抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析
2021年5月23日
本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。
该方案展示了一种利用抗生素诱导和质谱技术快速鉴定细菌蛋白质的方法。该技术的主要优势在于其快速和简便。样品制备过程简单。
该技术可拓展用于表征任何致病性细菌，例如毒力因子或抗生素耐药性，从而为细菌感染的适当治疗提供更充分的依据。首先，使用无菌的1微升接种环从LB琼脂平板上生长的单个菌落中采集细菌，然后转移至含有300微升HPLC级水的2毫升O形圈密封螺口微量离心管中。
然后短暂涡旋混匀管内样品，通过离心沉淀细胞，在不锈钢基质辅助激光解吸电离靶板上留下0.75 µL的样品上清液残留水，并使其干燥。将干燥后的样品点覆盖0.75 µL的芥子酸饱和溶液，该溶液由33%乙腈、67%水和0.2%三氟乙酸配制而成，再让其干燥。待样品点完全干燥后，将靶板装入质谱仪中。
打开采集软件，点击“MS Linear Mode Acquisition”或在相应字段中输入质荷比范围以及质荷比的上下限。在MALDI靶板模板上点击待分析的样品点，然后按住鼠标左键，拖动光标覆盖样品点，以确定用于激光消融或电离的矩形采样区域。
释放鼠标按钮以启动采集，并为每个样品点收集 1000 次激光脉冲。如果未检测到离子，则通过调节激光强度下方的滑动条逐步增加激光强度，直至检测到蛋白质离子信号。完成线性模式质谱采集后，单击进行二级质谱反射模式采集。
在“前体离子质量”字段中输入待分析的前体离子质量。接着，在前体离子质量窗口中，分别输入前体离子质量低质量和高质量端的隔离宽度（单位为道尔顿）。单击“关闭CID”按钮。
然后点击“亚稳态抑制器开启”按钮。通过调节滑动标尺，将激光强度调整至其最大值的至少90%，如图所示。在MALDI靶板模板上点击待分析的样品点，然后按住鼠标左键，拖动光标覆盖样品点以指定用于激光解吸或电离的矩形区域，松开鼠标按钮以开始采集，并对每个样品点采集10,000次激光射击，如图所示。
双击蛋白质生物标志物搜索器可执行文件，图形用户界面窗口将出现。在“成熟蛋白质质量”字段中输入蛋白质生物标志物的质量，在“质量容差”字段中输入质量测量误差。可选地，单击“互补 b/y 离子蛋白质质量计算器”按钮，以根据假定的互补碎片离子对计算蛋白质质量，此时将弹出蛋白质质量计算器工具的窗口。
输入假设的互补片段离子对的质荷比，点击“添加对”按钮，计算器将显示蛋白质质量。将此值复制并粘贴到成熟蛋白质质量字段中，然后关闭蛋白质质量计算器工具窗口。点击“设置残基限制”复选框。
选择末端终止信号肽的长度，此时将弹出带有滑动标尺和光标的窗口，请移动光标至所需的信号肽长度。如果未选择信号肽长度，软件将执行无限制的序列截断。在“片段离子条件”下，通过点击一个或多个残基（D、E、N 和/或 P）的复选框，选择多肽骨架裂解所对应的残基。然后点击“输入片段离子加一以进行搜索”按钮，片段弹出页面将会出现。
接下来，点击“添加碎片离子”按钮，将出现一个下拉字段用于输入每个碎片离子。输入碎片离子的质荷比及其相应的质荷比容差，然后点击“保存并关闭”按钮。
在“需要匹配多少个碎片离子”右侧框中，滚动选择用于鉴定所需的最少碎片离子匹配数量，并选择处于氧化状态的半胱氨酸残基。如果搜索后蛋白质仍未被鉴定出来，请使用还原状态的半胱氨酸重复搜索。在文件设置下，点击“选择FASTA文件”图标，浏览并选择之前构建的细菌菌株的蛋白质序列的FASTA文件。
然后选择一个输出文件夹并创建输出文件名。单击“在文件条目上运行搜索”图标。此时将弹出一个名为“确认搜索参数”的窗口，显示搜索开始前的搜索参数。
如果搜索参数正确，请单击“开始搜索”。如果参数不正确，请单击“取消”并重新输入正确的参数。搜索启动后，参数窗口将关闭，随后会弹出一个显示进度条的新窗口，实时显示搜索进度以及已找到的鉴定结果数量的动态统计。
搜索完成后，进度条将自动关闭，搜索结果摘要将显示在图形用户界面的日志字段中，同时会弹出一个新窗口，显示所找到的蛋白质鉴定结果。在本研究中，细菌培养物在含有两种不同浓度丝裂霉素C的LB培养基中培养。该质谱图来自在含有丝裂霉素C的培养条件下生长的细菌培养物。
鉴定出冷休克蛋白C、冷休克蛋白E以及一种功能未知的质粒编码蛋白。对分子量为9780的未知蛋白离子进行MS/MS分析，前体离子通过时间离子选择窗口约为100道尔顿进行分离。质荷比为9675.9的碎片离子来源于亚稳态蛋白离子9655的解离过程中的信号溢出。
大肠杆菌素E3的免疫蛋白序列含有可电离的碱性残基位点。在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时，可检测到来自多肽骨架断裂的碎片离子。N端甲硫氨酸在翻译后修饰过程中被切除。
当细菌培养物在高浓度丝裂霉素C条件下生长时，鉴定了细菌素的免疫蛋白。通过串联质谱（MS/MS）分析了分子量为9651的未知峰，并采用更窄且不对称的TIS窗口（负75至正60道尔顿）对前体离子进行分离。该细菌素免疫蛋白的序列中含有碱性残基，可能是电离的潜在位点。
在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时，检测到的来自多肽骨架裂解的碎片离子。在不同浓度抗生素作用下，相对蛋白质丰度可能发生变化。这些变化通过质谱分析进行检测。
收集细菌细胞时，应观察菌落形态以及细菌在不同抗生素及其浓度下的生长情况。检测蛋白质需要使用一微升环的细胞量。
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概述
本方案介绍了一种快速且简便的方法，用于鉴定与致病性大肠杆菌（Escherichia coli）产生的杀菌酶（特别是大肠杆菌素E3和细菌素）相关的免疫蛋白。该方法结合了抗生素诱导、基质辅助激光解吸/电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）以及利用自主开发软件进行的自上而下蛋白质组学分析。该技术可高效鉴定免疫蛋白，对于理解细菌防御机制具有重要意义。
关键研究要素
科学领域
- 微生物学
- 蛋白质组学
- 质谱分析
- 细菌遗传学
背景
- 免疫蛋白可保护细菌免受其自身杀菌酶（如大肠杆菌素和细菌素）的攻击。
- 快速鉴定这些蛋白对于理解细菌的致病性和耐药机制具有重要意义。
- 传统的蛋白质鉴定方法可能耗时且复杂。
- 质谱技术为蛋白质分析提供了一种高通量的替代方案。
研究目的
- 开发并演示一种快速鉴定致病性大肠杆菌（E. coli）菌株中免疫蛋白的实验方案。
- 利用抗生素诱导结合质谱技术进行蛋白质检测。
- 应用自主开发的软件实现高效的自上而下蛋白质组学分析。
使用的方法
- 使用不同浓度的丝裂霉素-C诱导细菌培养物。
- 样品制备，包括从菌落中收集细菌并将其制备用于MALDI-TOF-TOF分析。
- 获取质谱及串联质谱（MS/MS）数据以进行蛋白质鉴定。
- 利用定制软件将检测到的蛋白质质荷比及碎片离子与全基因组测序获得的蛋白质序列进行比对。
- 人工检查候选序列以确认碎片离子的归属。
主要结果
- 成功鉴定了大肠杆菌素E3（Im3）和细菌素（Im-Bac）的免疫蛋白。
- 多肽骨架断裂产生的显著的b型和y型片段离子是鉴定的关键。
- Im3的N端甲硫氨酸在翻译后被切除，而Im-Bac则保留了其完整的序列。
- 仅需两到三个非互补的片段离子即可实现正确的蛋白质序列鉴定。
- 在质粒基因组中，抗菌基因和免疫基因上游发现了一个启动子（SOS盒）。
结论
- 该方案利用质谱技术和定制软件，能够快速、准确地鉴定细菌免疫蛋白。
- 该方法可适用于表征其他细菌蛋白，例如毒力因子或抗生素抗性蛋白。
- 通过揭示细菌防御机制，该方法可为细菌感染的治疗策略提供依据。
常见问题
行业重要性概述
利用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学技术快速鉴定细菌免疫蛋白，可直接支持抗感染药物发现早期阶段的靶点验证和作用机制去风险化。该工作流程能够高置信度地解析细菌防御机制，为抗菌研发项目中的靶点优先排序和转化连续性提供依据。该方法加速了从发现到可操作性洞见的转化过程，减少了蛋白质功能注释中的不确定性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够直接鉴定细菌在杀菌酶作用下存活所必需的免疫蛋白。
- 通过确认蛋白质身份及其翻译后修饰，支持作用机制的去风险化研究。
- 有助于快速进行功能基因组学和通路解析的假设验证。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选和检测开发工作流程提供经过验证的蛋白质靶标。
- 提供可重复、定量的质谱输出结果，用于检测标准化。
- 实现对不同致病菌株中蛋白质生物标志物的可扩展性鉴定。
转化与临床前研究
- 将蛋白质鉴定与疾病相关的细菌系统相结合，推动转化生物标志物的发现。
- 确保从分子发现到抗菌靶标的临床前验证过程的连续性。
- 通过确认在抗生素应激条件下靶标的存在及其调控，降低后期研发失败的风险。
流程与工作流整合
该方法在早期发现与先导物识别的交汇处发挥作用，通过提供经过验证的蛋白质靶点和机制性见解，为临床前研究搭建桥梁。
- 发现生物学：通过确认免疫蛋白的身份及其调控机制，支持无效假设检验和通路阐明。
- 筛选：提供定量且可重复的质谱数据，用于检测就绪性评估和化合物评价。
- 分析：实现对蛋白质质量及片段离子的精确测量，支持在不同条件下进行可靠的统计学比较。
- 转化研究：在抗生素诱导条件下，将蛋白质鉴定与疾病相关的细菌应答相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的蛋白质组学工作流程，可适配于其他细菌靶标及耐药因子研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低抗菌研究中的机制模糊性。
- 操作价值：仅需极少样品前处理，即可实现标准化、快速且可扩展的蛋白质鉴定。
- 战略价值：通过实现对抗菌靶点的早期去风险化，提升“推进/终止”决策的准确性与资本使用效率。
- 项目组合影响：基于已验证的分子证据，支持对抗菌项目进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备质谱分析和蛋白质组学数据分析的专业知识。
- 依赖于MALDI-TOF-TOF仪器设备及定制化分析软件的可及性。
- 要求各研究团队采用标准化的样品制备和数据采集流程。
- 在具备适当基因组数据的前提下，可适用于多种细菌菌株和蛋白质靶标。
- 受限于对高质量基因组衍生蛋白质序列数据库的需求。
