Name: 使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学分析鉴定 大肠杆菌 中的抗菌免疫蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 了解使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学分析快速鉴定大肠杆菌中抗菌免疫蛋白的方法。该技术结合抗生素诱导和定制软件，可高效识别免疫蛋白，助力研究细菌防御机制。

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蛋白质生物标志物搜索软件可免费获取，有意者请联系美国农业部的 Clifton K. Fagerquist，邮箱地址：clifton.fagerquist@usda.gov。我们感谢美国农业部农业研究局（ARS, USDA）通过CRIS资助项目（编号：2030-42000-051-00-D）对本研究提供的支持。

1. 微生物学样品制备
<ol>
	<li>用无菌的 1 µL 接种环从甘油菌种保存管中取 E. coli O113:H21 菌株 RM7788（或其他细菌菌株），接种于装有 25 mL LB 培养基的 50 mL 圆底离心管中。盖紧管盖，在 37 °C、200 rpm 振荡条件下预培养 4 小时。</li>
	<li>取 100 µL 预培养的菌液，涂布于添加了 400 或 800 ng/mL 丝裂霉素-C 的 LB 琼脂平板上。将琼脂平板置于 37 °C 培养箱中静置过夜培养。 
	注意：STEC 菌株为致病性微生物，除常规培养外，所有微生物操作均须在 BSL-2 生物安全柜中进行。</li>
	<li>用无菌 1 μL 接种环挑取单个可见菌落的细菌细胞，转移至含有 300 μL HPLC 级水的 2.0 mL 带 O 型圈垫片的螺口微量离心管中。盖紧管盖，短暂涡旋振荡后，在 11,337 x g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。</li>
</ol>
2. 质谱分析
<ol>
	<li>取0.75 μL样品上清液点样于不锈钢MALDI靶板上，待其自然干燥。在已干燥的样品点上覆盖0.75 μL的&#160;芥子酸饱和溶液&#160;，该溶液由33%乙腈、67%水和0.2%三氟乙酸组成。让斑点自然干燥。</li>
	<li>使用MALDI-TOF-TOF质谱仪分析干燥后的样品点。
	<ol>
		<li>将MALDI靶板装入质谱仪后，在采集软件中点击MS线性模式采集按钮。在采集方法软件中，分别输入待分析的m/z范围的下限和上限值（例如，2 kDa至20 kDa），以设定分析范围。</li>
		<li>在软件中的MALDI靶板模板上点击待分析的样品点，然后按住鼠标左键并拖动光标覆盖该样品点，以划定用于激光烧蚀/电离的矩形区域。松开鼠标按钮后，采集即开始。每个样品点采集1,000次激光脉冲。 
		注意：数据采集过程在软件采集窗口中实时显示。</li>
		<li>若未检测到离子信号，可通过软件中激光强度下的滑动标尺条逐步提高激光强度，直至检测到蛋白质离子信号。此过程称为阈值设定。 
		注意：在样品点分析前，需使用蛋白质校准品在MS线性模式下对外部校准仪器，校准品的m/z应覆盖待分析范围，例如：细胞色素C、溶菌酶和肌红蛋白的+1和+2电荷态可覆盖2 kDa至20 kDa的质量范围。在指定质量范围内选择一个中间质量作为聚焦质量（例如9 kDa），该质量对应的离子将被线性模式检测器最优聚焦检测。</li>
		<li>完成MS线性模式采集后，在采集软件中点击MS/MS反射模式采集按钮。在前体离子质量字段中输入待分析的前体离子质量。随后，在前体离子质量窗口中输入隔离宽度（单位为Da），分别设定前体离子质量高低两侧的范围，例如±100 Da。</li>
		<li>点击CID关闭按钮，点击亚稳态抑制器开启按钮。通过软件中激光强度下的滑动标尺条将激光强度调节至其最大值的至少90%。</li>
		<li>在软件中的MALDI靶板模板上点击待分析的样品点，然后按住鼠标左键并拖动光标覆盖该样品点，以划定用于激光烧蚀/电离的矩形区域。松开鼠标按钮后，采集即开始。每个样品点采集10,000次激光脉冲。 
		注意：在样品点分析前，应使用烷基化硫氧还蛋白+1电荷态的源后衰变（PSD）产生的碎片离子，在MS/MS-反射模式下对外部校准仪器35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不要对原始MS数据进行处理。按以下顺序依次处理MS/MS-PSD原始数据：高级基线校正（32, 0.5, 0.0），随后进行噪声去除（两倍标准差），再进行高斯平滑（31个点）。</li>
	<li>人工检查MS/MS-PSD数据中是否存在由PBC19,20产生的显著碎片离子。</li>
	<li>根据碎片离子的绝对丰度和相对丰度及其信噪比（S/N）评估MS/MS数据。仅使用最丰富的碎片离子进行蛋白质鉴定，尤其是在MS/MS-PSD数据噪声较高时。</li>
</ol>
3.&#160;In silico 蛋白质数据库构建
<ol>
	<li>生成一个包含该细菌菌株的in silico蛋白质序列的文本文件，供蛋白质生物标志物搜索软件扫描以进行蛋白质鉴定。这些蛋白质序列来源于正在分析的菌株（或密切相关菌株）的全基因组测序（WGS）数据。</li>
	<li>访问NCBI/PubMed网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/），下载待分析特定细菌菌株（例如&#160;Escherichia coli O113:H21菌株RM7788）的约5,000条蛋白质序列。每次最多可下载200条序列。
	<ol>
		<li>因此，需将25次下载结果复制并粘贴至同一个文本文件中。每次下载请选择FASTA（文本）格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 运行蛋白质生物标志物搜索软件
<ol>
	<li>双击 Protein Biomarker Seeker 可执行文件。将出现一个图形用户界面（GUI）窗口（图1，上方面板）。</li>
	<li>将蛋白质生物标志物的质量（在 MS-linear 模式下测得）输入到 成熟蛋白质质量 字段中。接着，将质量测量误差输入到 质量容差 字段中。对于 10,000 Da 的蛋白质，标准质量测量误差为 ±10 Da。</li>
	<li>可选：点击 互补 b/y 离子蛋白质质量计算器 按钮，以根据假定的互补碎片离子对（CFIP 或 b/y）计算蛋白质质量。将弹出一个名为“Protein Mass Calculator Tool”的窗口（图1，下方面板）。
	<ol>
		<li>输入假定 CFIP 的 m/z 值，然后点击 添加配对 按钮。计算出的蛋白质质量将显示出来。</li>
		<li>将此数值复制并粘贴到 成熟蛋白质质量 字段中，并关闭 Protein Mass Calculator Tool 窗口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过点击 设置残基限制 框，选择 N 端信号肽长度。将弹出一个带有滑动标尺和光标的窗口。将光标移动至所需的信号肽长度（最大为 50）。若未选择信号肽长度，软件将执行无限制的序列截断。</li>
	<li>在 GUI 的 碎片离子条件 下，选择用于多肽骨架裂解（PBC）的残基。点击一个或多个残基对应的框：D、E、N 和/或 P。
	<ol>
		<li>点击 输入待搜索的碎片离子（+1） 按钮。将弹出一个 碎片页面 窗口。然后点击 添加碎片离子 按钮，该按钮对应需输入的碎片离子数量，即每添加一个碎片离子点击一次。每个待输入的碎片离子将出现一个下拉字段。</li>
		<li>输入碎片离子的 m/z 值及其相应的 m/z 容差。完成后，点击 保存并关闭 按钮。 
		注：合理的 m/z 容差为 ±1.5。</li>
		<li>在 需要匹配多少个碎片离子 右侧的框中滚动选择必须匹配的最小碎片离子数量，以确认鉴定结果。 
		注：三个匹配通常已足够。</li>
		<li>通过点击相应圆圈选择处于氧化状态的半胱氨酸残基。如果搜索后未找到任何蛋白质鉴定结果，请以还原态的半胱氨酸重复搜索。如果仍无鉴定结果，将碎片离子容差扩大至 ±3 并重新执行搜索。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 文件设置 下，点击 选择 FASTA 文件 按钮，浏览并选择包含此前在实验步骤 3.1 至 3.2 中构建的细菌菌株的 in silico 蛋白质序列的 FASTA（文本）文件。然后选择一个输出文件夹并创建输出文件名。</li>
	<li>点击 在文件条目上运行搜索 按钮。将弹出一个名为 确认搜索参数 的窗口（图1，下方面板），在搜索开始前显示所设置的搜索参数。</li>
	<li>如果搜索参数正确，点击 开始搜索 按钮。如果参数不正确，点击 取消 按钮并重新输入正确参数。一旦搜索启动，参数窗口将关闭，并弹出一个带有进度条的新窗口（图1，下方面板），显示搜索进度以及已发现鉴定结果的实时统计。</li>
	<li>搜索完成后（几秒钟内），进度条将自动关闭，搜索摘要将在 GUI 的日志字段中显示（图2，上方面板）。此外，还将弹出一个新窗口，显示找到的蛋白质鉴定结果（如有）（图2，下方面板）。 
	&#8203;注：含有无法识别残基（例如 U 或 X）的 in silico 蛋白质序列将自动从分析中跳过，搜索完成后会通过单独的弹窗通知操作人员哪些（如有）序列被跳过。</li>
</ol>
5. 搜索后对蛋白质序列的确认
<ol>
	<li>通过手动分析确认候选序列的正确性。 
	注：蛋白质生物标志物筛选软件的目的是通过排除大量明显错误的蛋白质序列，并将序列截短作为成熟蛋白中可能的翻译后修饰（PTM），从而高精度地鉴定出蛋白质序列。由于返回的候选序列数量较少，因此可进行人工确认。</li>
	<li>使用具备相应功能的任何质谱或蛋白质组学软件，生成候选序列的 b 型和 y 型碎片离子的平均 m/z 值表格。将 D-、E- 和 N-残基 C 末端侧（以及 P-残基 N 末端侧）的 in silico 碎片离子的平均 m/z 值与 MS/MS-PSD 数据中的显著碎片离子 m/z 值进行比对。 
	注：最显著的 MS/MS-PSD 碎片离子应能轻松匹配到与 D-、E- 和 N-残基相关的 in silico 碎片离子。然而，天冬氨酸效应裂解机制在蛋白质序列的 N-或 C-末端附近效率较低36。</li>
</ol>

作者无利益冲突。

实验方案注意事项 
本实验方案的主要优势在于其速度快、样品制备简单，以及所用仪器相对易于操作、培训和维护。尽管液相色谱-电喷雾电离-高分辨质谱（LC-ESI-HR-MS）在自下而上和自上而下的蛋白质组学分析中应用广泛，且在许多方面均显著优于基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）的自上而下分析，但其耗时更长，需要更多人力和专业技术。仪器的复杂性常常会影响未经质谱学正式培训的科研人员是否愿意采用某些仪器平台。采用MALDI-TOF-TOF的自上而下方法旨在将MALDI-TOF-MS的应用范围扩展到临床微生物学实验室中目前用于细菌分类鉴定之外的领域，同时不会显著增加分析所需的工作量、操作复杂性或技术要求。
该方案不采用任何机械（或电学）细胞裂解步骤。尽管本方案也可用于检测分泌性或细胞外蛋白，但此方法的早期版本最初是为检测产志贺毒素大肠杆菌（STEC）菌株中的志贺毒素（Stx）而开发的，其中抗生素诱导会触发细菌的SOS反应，从而表达噬菌体基因，包括stx以及负责细菌细胞裂解的晚期噬菌体基因<sup ...

通过质谱法对未消化的蛋白质进行分析和鉴定被称为自上而下蛋白质组学分析1,2,3,4。该技术现已成熟，采用电喷雾电离（ESI）5 和高分辨率质谱分析器6，以及复杂的解离技术，例如电子转移解离（ETD）、电子捕获解离（ECD）7、紫外光解离（UV-PD）8 等。
另一种软电离技术是基质辅助激光解吸/电离（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）9,10,11，该技术在自上而下蛋白质分析中的应用相对较少，部分原因是它主要与飞行时间（time-of-flight, TOF）质谱分析器联用，而与其他质谱分析器相比，TOF的分辨率有限。尽管存在这些局限性，MALDI-TOF和MALDI-TOF-TOF仪器仍已被用于纯蛋白质以及分馏和未分馏蛋白质混合物的快速自上而下分析。对于纯蛋白质的鉴定，源内裂解（in-source decay, ISD）是一种特别有用的技术，因为它允许对ISD产生的碎片离子进行质谱（MS）分析，同时还能对蛋白质离子碎片进行串联质谱（MS/MS）分析，从而获得目标蛋白质N端和C端的序列特异性碎片信息，类似于Edman降解测序12,13。ISD方法的一个缺点是，与Edman测序类似，样品中必须仅含一种蛋白质。这一单蛋白要求源于需要明确地将碎片离子归因于特定的前体离子。如果样品中存在两种或多种蛋白质，则可能难以确定各个碎片离子归属于哪一个前体离子。
可以使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF-MS/MS）进行碎片离子/前体离子归属分析。与任何经典的串联质谱（MS/MS）实验一样，在碎裂之前需对前体离子进行质量选择/分离，从而可将检测到的碎片离子归因于特定的前体离子。然而，该方法可用的解离技术主要局限于高能碰撞诱导解离（HE-CID）14 或源后衰变（PSD）15,16。HE-CID 和 PSD 在肽段和小分子蛋白质的碎裂方面效果最佳，但在某些情况下，序列覆盖度可能有限。此外，PSD 通过一种称为天冬氨酸效应的现象，主要在天冬氨酸和谷氨酸残基的C端侧引起多肽主链断裂（PBC）17,18,19,20。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）在微生物的分类鉴定中也具有独特应用：包括细菌21、真菌22和病毒23。例如，通过将未知细菌的质谱图与已知细菌的参考质谱文库进行比对，并利用模式识别算法进行分析，从而实现鉴定。该方法因其快速和简便而被证明非常成功，尽管仍需对分离株进行过夜培养。该方法检测到的蛋白质离子（通常小于20 kDa）构成了一种质谱“指纹”，可在属和种的水平上实现分类学分辨，某些情况下还可达到亚种24和菌株25,26水平。然而，目前仍需不仅对潜在致病微生物进行分类学归类，还需鉴定特定的毒力因子、毒素以及抗菌药物耐药性（AMR）因子。为实现这一目标，需通过质谱（MS）测定肽段、蛋白质或小分子的质量，随后通过串联质谱（MS/MS）对其进行分离和碎裂分析。
致病菌通常携带一种称为质粒的环状DNA片段。质粒与前噬菌体一起，是细菌间水平基因转移的主要载体，导致抗菌药物耐药性及其他毒力因子在细菌中迅速传播27。质粒还可能携带抗菌（AB）基因，例如大肠杆菌素（colicin）和细菌素（bacteriocin）。当这些基因表达并分泌相应蛋白质时，可破坏占据相同生态位的邻近细菌的蛋白质翻译机制。然而，这些杀菌酶也可能对产生它们的宿主细胞造成威胁。因此，宿主会共表达一种特异性抑制AB酶功能的基因，该基因编码的蛋白质被称为其免疫蛋白（Im）。
DNA损伤类抗生素（如丝裂霉素C和环丙沙星）常被用于诱导产志贺毒素大肠杆菌中的SOS反应 E. coli （产志贺毒素大肠杆菌，STEC）的志贺毒素基因（stx 存在于细菌基因组中的前噬菌体基因组内28我们先前已采用抗生素诱导、基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF-MS/MS）以及自上而下的蛋白质组学分析方法，检测并鉴定产志贺毒素大肠杆菌（STEC）菌株产生的Stx类型及亚型29,30,31,32在先前的研究中，STEC O113:H21 菌株 RM7788 在添加了丝裂霉素-C 的琼脂培养基上过夜培养。然而，并未检测到预期的 Stx2a B 亚基 m/z ~7816，检测到一种不同的蛋白质离子 m/z ~7839，被鉴定为一种质粒编码的未知功能的假定蛋白33在本研究中，我们通过抗生素诱导、基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF-MS/MS）以及使用自主研发的独立软件进行自上而下蛋白质组学分析，鉴定了该菌株产生的两种质粒编码的AB-Im蛋白 计算机模拟 由全基因组测序（WGS）获得的蛋白质序列。此外，软件中还整合了涉及序列截短的翻译后修饰（PTM）的可能性。利用该软件，通过质谱/串联质谱-光解离（MS/MS-PSD）检测到的成熟蛋白离子质量以及由天冬氨酸效应引起的PBC特异性序列片段离子，鉴定了免疫蛋白。最后，在质粒基因组中AB/Im基因上游鉴定出一个启动子，这可能解释了当该菌株暴露于DNA损伤性抗生素时这些基因的表达。本研究的部分内容曾在2020年美国化学会秋季虚拟会议上展示。 &amp;#38; 展览会（2020年8月17日至20日）34.

<table><tbody><tr><td>4000系列Explorer软件</td><td>AB Sciex</td><td>版本 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>4800 Plus MALDI TOF/TOF 分析仪</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈 Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-1</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 生物安全柜</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>细胞色素-C</td><td>Sigma</td><td>C2867-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer 软件</td><td>AB Sciex</td><td>版本 4.9</td><td></td></tr><tr><td>Focus Protein 还原-烷基化试剂盒</td><td>G-Biosciences</td><td>786-231</td><td></td></tr><tr><td>GPMAW 软件</td><td>灯塔数据</td><td>版本 10.0</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR</td><td>9120973</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma</td><td>L4919-1G</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 带螺口盖和O型圈的微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-343</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Plus 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22620207</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素-C（源自链霉菌）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0440-5MG</td><td></td></tr><tr><td>肌红蛋白</td><td>Sigma</td><td>M5696-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Shaker MaxQ 420HP 型号 420</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Model 420</td><td></td></tr><tr><td>芥子酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1861580</td><td></td></tr><tr><td>无菌 1 μL 接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-595</td><td></td></tr><tr><td>硫氧还蛋白（大肠杆菌，重组）</td><td>Sigma</td><td>T0910-1MG</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima LC/MS级水</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 maldi-tof-tof-ms/ms 和自上而下蛋白质组学分析

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

本方案通过抗生素诱导，从致病性大肠杆菌（Escherichia coli）菌株中鉴定其杀菌酶——大肠杆菌素E3（colicin E3）和细菌素（bacteriocin）的免疫蛋白，并利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自研软件支持的自上而下蛋白质组学分析进行鉴定。大肠杆菌素E3的免疫蛋白（Im3）和细菌素的免疫蛋白（Im-Bac）通过天冬氨酸效应裂解机制，在天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺残基的C端侧发生多肽主链断裂（PBC），产生显著的b型和/或y型片段离子而得以鉴定。该软件可快速扫描由该菌株全基因组测序获得的in silico蛋白质序列，并在成熟蛋白序列发生截短的情况下，迭代去除蛋白质序列中的氨基酸残基。每种免疫蛋白均对应一条具有匹配质荷比及片段离子特征的单一蛋白质序列。随后通过人工核查，确认所有检测到的片段离子均可被合理指认。Im3的N端甲硫氨酸在翻译后被切除，而Im-Bac则保留完整序列。此外，我们发现仅需两个或三个由PBC产生的非互补片段离子即可准确鉴定正确的蛋白质序列。最后，在该菌株质粒基因组中，抗菌基因和免疫基因上游均鉴定出一个启动子（SOS box）。

图3（上图）显示了在添加了400 ng/mL丝裂霉素-C的LBA培养基中过夜培养的STEC O113:H21菌株RM7788的质谱图。m/z 7276、7337和7841处的峰先前已被鉴定为冷休克蛋白C（CspC）、冷休克蛋白E（CspE）以及一种功能未知的质粒携带蛋白33。m/z 9780处的蛋白离子[M+H]+通过MS/MS-PSD进行分析，结果如图3（下图）所示。前体离子使用时间离子选择器（TIS）窗口（±100 Da）进行分离。碎片离子以其m/z值及类型/编号标识。m/z 2675.9处的碎片离子（以星号标出）来自图3（上图）中m/z 9655处亚稳态蛋白离子解离产生的溢出信号。每个碎片离子的理论平均m/z值（括号内）基于上方所示的大肠杆菌素E3免疫蛋白（Im3）序列的肽键断裂（PBC）计算得出。PBC位点以红色星号标出，并对应生成的碎片离子。N端甲硫氨酸被加下划线，表示其在成熟蛋白...

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。

抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

该方案用于鉴定由致病性大肠杆菌菌株产生的杀菌酶——大肠杆菌素E3和细菌素的免疫蛋白

该方案展示了一种利用抗生素诱导和质谱技术快速鉴定细菌蛋白质的方法。该技术的主要优势在于其快速和简便。样品制备过程简单。该技术可拓展用于表征任何致病性细菌，例如毒力因子或抗生素耐药性，从而为细菌感染的适当治疗提供更充分的依据。首先，使用无菌的1微升接种环从LB琼脂平板上生长的单个菌落中采集细菌，然后转移至含有300微升HPLC级水的2毫升O形圈密封螺口微量离心管中。然后短暂涡旋混匀管内样品，通过离心沉淀细胞，在不锈钢基质辅助激光解吸电离靶板上留下0.75 µL的样品上清液残留水，并使其干燥。将干燥后的样品点覆盖0.75 µL的芥子酸饱和溶液，该溶液由33%乙腈、67%水和0.2%三氟乙酸配制而成，再让其干燥。待样品点完全干燥后，将靶板装入质谱仪中。打开采集软件，点击“MS Linear Mode Acquisition”或在相应字段中输入质荷比范围以及质荷比的上下限。在MALDI靶板模板上点击待分析的样品点，然后按住鼠标左键，拖动光标覆盖样品点，以确定用于激光消融或电离的矩形采样区域。释放鼠标按钮以启动采集，并为每个样品点收集 1000 次激光脉冲。如果未检测到离子，则通过调节激光强度下方的滑动条逐步增加激光强度，直至检测到蛋白质离子信号。完成线性模式质谱采集后，单击进行二级质谱反射模式采集。在“前体离子质量”字段中输入待分析的前体离子质量。接着，在前体离子质量窗口中，分别输入前体离子质量低质量和高质量端的隔离宽度（单位为道尔顿）。单击“关闭CID”按钮。然后点击“亚稳态抑制器开启”按钮。通过调节滑动标尺，将激光强度调整至其最大值的至少90%，如图所示。在MALDI靶板模板上点击待分析的样品点，然后按住鼠标左键，拖动光标覆盖样品点以指定用于激光解吸或电离的矩形区域，松开鼠标按钮以开始采集，并对每个样品点采集10,000次激光射击，如图所示。双击蛋白质生物标志物搜索器可执行文件，图形用户界面窗口将出现。在“成熟蛋白质质量”字段中输入蛋白质生物标志物的质量，在“质量容差”字段中输入质量测量误差。可选地，单击“互补 b/y 离子蛋白质质量计算器”按钮，以根据假定的互补碎片离子对计算蛋白质质量，此时将弹出蛋白质质量计算器工具的窗口。输入假设的互补片段离子对的质荷比，点击“添加对”按钮，计算器将显示蛋白质质量。将此值复制并粘贴到成熟蛋白质质量字段中，然后关闭蛋白质质量计算器工具窗口。点击“设置残基限制”复选框。选择末端终止信号肽的长度，此时将弹出带有滑动标尺和光标的窗口，请移动光标至所需的信号肽长度。如果未选择信号肽长度，软件将执行无限制的序列截断。在“片段离子条件”下，通过点击一个或多个残基（D、E、N 和/或 P）的复选框，选择多肽骨架裂解所对应的残基。然后点击“输入片段离子加一以进行搜索”按钮，片段弹出页面将会出现。接下来，点击“添加碎片离子”按钮，将出现一个下拉字段用于输入每个碎片离子。输入碎片离子的质荷比及其相应的质荷比容差，然后点击“保存并关闭”按钮。在“需要匹配多少个碎片离子”右侧框中，滚动选择用于鉴定所需的最少碎片离子匹配数量，并选择处于氧化状态的半胱氨酸残基。如果搜索后蛋白质仍未被鉴定出来，请使用还原状态的半胱氨酸重复搜索。在文件设置下，点击“选择FASTA文件”图标，浏览并选择之前构建的细菌菌株的蛋白质序列的FASTA文件。然后选择一个输出文件夹并创建输出文件名。单击“在文件条目上运行搜索”图标。此时将弹出一个名为“确认搜索参数”的窗口，显示搜索开始前的搜索参数。如果搜索参数正确，请单击“开始搜索”。如果参数不正确，请单击“取消”并重新输入正确的参数。搜索启动后，参数窗口将关闭，随后会弹出一个显示进度条的新窗口，实时显示搜索进度以及已找到的鉴定结果数量的动态统计。搜索完成后，进度条将自动关闭，搜索结果摘要将显示在图形用户界面的日志字段中，同时会弹出一个新窗口，显示所找到的蛋白质鉴定结果。在本研究中，细菌培养物在含有两种不同浓度丝裂霉素C的LB培养基中培养。该质谱图来自在含有丝裂霉素C的培养条件下生长的细菌培养物。鉴定出冷休克蛋白C、冷休克蛋白E以及一种功能未知的质粒编码蛋白。对分子量为9780的未知蛋白离子进行MS/MS分析，前体离子通过时间离子选择窗口约为100道尔顿进行分离。质荷比为9675.9的碎片离子来源于亚稳态蛋白离子9655的解离过程中的信号溢出。大肠杆菌素E3的免疫蛋白序列含有可电离的碱性残基位点。在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时，可检测到来自多肽骨架断裂的碎片离子。N端甲硫氨酸在翻译后修饰过程中被切除。当细菌培养物在高浓度丝裂霉素C条件下生长时，鉴定了细菌素的免疫蛋白。通过串联质谱（MS/MS）分析了分子量为9651的未知峰，并采用更窄且不对称的TIS窗口（负75至正60道尔顿）对前体离子进行分离。该细菌素免疫蛋白的序列中含有碱性残基，可能是电离的潜在位点。在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时，检测到的来自多肽骨架裂解的碎片离子。在不同浓度抗生素作用下，相对蛋白质丰度可能发生变化。这些变化通过质谱分析进行检测。收集细菌细胞时，应观察菌落形态以及细菌在不同抗生素及其浓度下的生长情况。检测蛋白质需要使用一微升环的细胞量。

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使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学分析鉴定 大肠杆菌 中的抗菌免疫蛋白

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结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

将基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱（MS）技术直接应用于血培养增菌液，可加快细菌的鉴定速度。本方法是一种直接从血培养增菌液中快速、可靠地鉴定革兰氏阴性细菌的方法。...

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术快速鉴定血培养肉汤中的革兰阴性菌

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）与分子技术（16S rRNA...

通过16S rRNA基因测序与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定罕见细菌病原体

采用基于质谱的系统发育蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp.

基于质谱的系统蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行分型

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

本文详细描述了一种利用毛细管区带电泳-电喷雾电离-串联质谱法（CZE-ESI-MS/MS）对蛋白质样品中的蛋白质变体进行分离、鉴定和表征的实验方案。该方案可用于简单蛋白质样品中蛋白质变体的高分辨率表征，以及复杂蛋白质组样品中蛋白质变体的大规模鉴定。...

大规模自上而下蛋白质组学采用毛细管区带电泳串联质谱法

本方案涵盖了利用液相色谱-质谱联用技术，并结合高级特征提取和生物信息学分析软件，对肽聚糖组成进行的详细分析。...

利用液相色谱质谱法与生物信息学对肽聚糖进行半定量分析

本方案通过将培养组学与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）相结合，实现对乳制品中微生物组成的快速、低成本评估。该方法获得的分类学结果与16S...

利用细菌蛋白质组学分析评估乳制品的微生物安全性 通过 基质辅助激光解吸电离方法

了解使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学分析快速鉴定大肠杆菌中抗菌免疫蛋白的方法。该技术结合抗生素诱导和定制软件，可高效识别免疫蛋白，助力研究细菌防御机制。

抗菌免疫蛋白的鉴定大肠杆菌使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

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抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

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