Name: 通过基于固体支持膜（SSM）的电生理学选择转运蛋白靶向抑制纳米抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解基于固体支持膜电生理学的高通量筛选方法，用于鉴定靶向电生转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体。该技术无需标记底物即可测定IC50值，适用于大规模纳米抗体文库筛选。

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感谢苏黎世大学医学微生物学研究所的 Cedric A. J. Hutter 和 Markus A. Seeger，以及巴塞尔大学生物中心的 Gonzalo Cebrero 在合成纳米抗体（sybodies）构建方面的合作。感谢 NANION Technologies 公司的 Maria Barthmes 和 Andre Bazzone 提供的技术支持。本研究得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）（项目编号 PP00P3_170607 以及授予 C.P. 的 NANION 研究资助计划）的资助。

1. 膜蛋白的重建
<ol>
	<li>在通风橱中，将 3 mL 大肠杆菌（E. coli）极性脂质与 1 mL 磷脂酰胆碱加入圆底烧瓶中混合。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪和 37 °C 水浴，在减压条件下干燥脂质混合物 20 分钟，以去除氯仿。如有需要，可在氮气或氩气氛围下进一步干燥。</li>
	<li>使用含 2 mM β-巯基乙醇的 TS 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl），将脂质重悬至浓度为 25 mg/mL。</li>
	<li>将脂质分装为每份 500 µL，液氮中速冻后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>取出一份 500 µL 脂质分装样品，用含 2 mM β-巯基乙醇的 TS 缓冲液按 1:1 比例稀释。</li>
	<li>使用 400 nm 孔径膜，将脂质悬浮液挤出 15 次。</li>
	<li>稀释脂质悬浮液，使最终脂质浓度为 4.4 mg/mL。</li>
	<li>加入正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM），使其终浓度为 0.2%，并在室温（RT）下以 200 rpm 转速旋转孵育 1 小时。</li>
	<li>按照脂质与蛋白质量比 1:10 至 1:100（w:w）的比例，将纯化的蛋白加入脂质中。 
	注意：该比例需根据 SSM 电生理测量中底物转运信号的强弱进行调整（见下文）。为获得更强信号，应使用较小的脂质与蛋白比例。</li>
	<li>将混合物在室温下以 200 rpm 转速旋转孵育 1 小时。</li>
	<li>加入预先用 TS 缓冲液洗涤过的聚苯乙烯吸附珠，终浓度为 30 mg/mL。 
	注意：聚苯乙烯珠应分步加入。</li>
	<li>将珠-脂质混合物在室温下缓慢搅拌孵育 30 分钟。</li>
	<li>为去除珠子，静置珠-脂质混合物使珠子沉降，将上清液转移至新离心管中，留下珠子。向分离后的脂质混合物中加入 30 mg/mL 新鲜的聚苯乙烯吸附珠。</li>
	<li>将混合物在 4 °C 下缓慢搅拌孵育 1 小时。</li>
	<li>参照步骤 1.13 的方法分离珠子，并加入 30 mg/mL 新鲜的聚苯乙烯吸附珠。</li>
	<li>将混合物在 4 °C 下孵育 16 小时。</li>
	<li>参照步骤 13 的方法分离珠子，并加入 30 mg/mL 新鲜的聚苯乙烯吸附珠。</li>
	<li>将混合物在 4 °C 下孵育 2 小时，进行第四次也是最后一次洗涤。</li>
	<li>在 4 °C 下以 110,000 xg 离心 30 分钟。</li>
	<li>用含 2 mM β-巯基乙醇的 500 µL TS 缓冲液洗涤沉淀。</li>
	<li>再次在 4 °C 下以 110,000 xg 离心 30 分钟。</li>
	<li>用含 2 mM β-巯基乙醇的 TS 缓冲液将沉淀重悬，最终脂质浓度为 25 mg/mL。</li>
	<li>使用凝胶内蛋白染色法或氨基黑法测定蛋白浓度36。</li>
	<li>将蛋白脂质体分装，液氮中速冻后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 芯片制备
<ol>
	<li>向单个传感器芯片中加入 50–100 µL 的 0.5 mM 1-十八烷硫醇溶液（溶于异丙醇中）。</li>
	<li>在室温下将芯片与该溶液孵育 30 分钟。</li>
	<li>通过将芯片轻触纸巾去除巯基溶液。</li>
	<li>用 5 mL 纯异丙醇冲洗传感器 3 次。</li>
	<li>用 5 mL 双蒸水冲洗传感器 3 次。</li>
	<li>通过轻触纸巾将传感器干燥。</li>
	<li>加入 1.5 µL 浓度为 7.5 µg/µL 的 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（脂质经旋转蒸发仪干燥后重悬于正癸烷中）。</li>
	<li>立即向传感器中加入 50 µL 不含底物的非激活 SSM 缓冲液，以促进 SSM 层的自发形成。 
	注意：应预先优化 SSM 缓冲液，以确定背景噪声最低的最佳条件。可使用含 30 mM HEPES（pH 7.4）、5 mM MgCl2 和 140 mM NaCl 的通用缓冲液作为起始条件。测量前后洗涤时使用不含底物的非激活 SSM 缓冲液。为避免缓冲液不匹配，应使用非激活缓冲液配制含底物的缓冲液（激活缓冲液）。底物可直接以粉末形式加入，或以小体积高浓度母液加入，以避免稀释。</li>
	<li>在室温下解冻步骤 1.24 中的蛋白脂质体。</li>
	<li>在非激活 SSM 缓冲液中将蛋白脂质体稀释 1:5 至 1:100（蛋白脂质体:缓冲液体积比）（此处为 1:20）。</li>
	<li>对稀释后的蛋白脂质体进行超声处理，持续 20–30 秒，或分 3 次每次 10 秒，超声间隔置于冰上冷却（如需要）。此处使用频率为 45 kHz 的水浴超声仪。</li>
	<li>将 5–10 µL 超声处理后的稀释蛋白脂质体样品滴加至传感器表面，避免接触传感器。</li>
	<li>在室温下以 2,000 至 3,000 ×g 的转速离心带有溶液的芯片 30 分钟。 
	注意：使用底部平坦的 50 mL 离心管。用镊子小心将传感器芯片垂直放置。也可使用 6 孔板及配备板架的离心机。</li>
	<li>传感器芯片应在同一天内使用。</li>
</ol>
3. 测量溶质运输：确定饱和条件
注意：作为原理验证，本实验采用上述方案将细菌胆碱转运蛋白重建于脂质体中进行。此处展示了在测定纳米抗体抑制作用之前，确定底物胆碱饱和条件的逐步操作过程。
<ol>
	<li>准备 1-2 L 的非激活 SSM 缓冲液。 
	注意：在所有测量过程中，所有激活和非激活缓冲液均应使用相同批次的 SSM 缓冲液储备液。</li>
	<li>取 10 个洁净的离心管，每管加入 10 mL 非激活 SSM 缓冲液。</li>
	<li>使用一系列接近预期半最大浓度的底物浓度（此处为胆碱：15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001 mM），将底物加入第 3.2 步的试管中，以制备激活型 SSM 缓冲液。使用高浓度母液以避免稀释效应。</li>
	<li>打开 SSM 仪器。</li>
	<li>启动 SSM 软件，等待仪器自动初始化。设置数据保存路径，点击 确定 按钮确认。在 工作流程 选项中选择标准的 初始清洗程序，然后点击 运行。</li>
	<li>将包被有蛋白脂质体的芯片安装到插槽上，移动机械臂锁定芯片，并用盖子封闭已安装的芯片。</li>
	<li>在工作流程中选择 CapCom 程序并点击 运行，以测定电导和电容。在用于测量前，请确认电导低于 5 nS，电容介于 15 至 35 nF 之间。 
	注意：制造商建议，当使用 3 mm 芯片时，电容值应在 15–35 nF 范围内，电导应低于 5 nS。</li>
	<li>将激活溶液转移至样品瓶中，并将其放置在探针取样器的相应位置。</li>
	<li>将非激活缓冲液转移至储液罐中，并将其置于右侧储液位，紧邻芯片支架。</li>
	<li>创建一个工作流程协议，使用非激活（B）、激活（A）和非激活（B）溶液的序列（即 B-A-B 序列），并设置一个循环，对第 3.3 步制备的全部 10 种激活缓冲液依次进行三次测量。使用默认流速 200 µL/s，B-A-B 序列的流速时间为 1 s - 1 s - 1 s。点击 播放 按钮开始测量。 
	注意：典型的实验包括非激活（B）、激活（A）和非激活（B）溶液的顺序流动（记为 B-A-B；见 图 1A）。传感器上固定的蛋白脂质体会被这些溶液冲洗，因此 B-A 溶液交换会产生底物浓度梯度，从而驱动生电转运反应。</li>
	<li>保存该协议，并点击 播放 按钮运行工作流程。使用不含蛋白质的脂质体重复相同类型的实验。这一步至关重要，因为它可显示背景电流的强度。在分析蛋白脂质体测得的生电转运数据时应考虑此背景信号（图 1C）。</li>
	<li>使用任意常用的数据分析软件绘制测量电流随时间变化的曲线。手动读取峰值电流，或若使用软件分析，则在激活缓冲液加入的时间范围内使用峰值高度估算功能进行读取。</li>
	<li>绘制峰值电流与底物浓度的关系曲线，通过非线性回归分析确定底物的 EC50 值（图 1B、C）。读取峰值电流达到最大值时的最低浓度，该浓度即对应于饱和条件。 
	&#8203;注意：必须注意，不同芯片上保持固定的蛋白脂质体数量存在芯片间差异&#160;。这种差异表现为在相同测量条件下峰值电流的幅值不同。因此，在比较不同芯片制备之间的测量结果之前，必须对每个芯片上单独进行的测量电流幅值进行归一化处理。</li>
</ol>
4. 抑制性与非抑制性纳米抗体的连续分类
注意：本节介绍如何在存在特异性结合细菌胆碱转运蛋白的纳米抗体的情况下测量胆碱转运。在纳米抗体存在时，若峰值电流减小，表明转运受到抑制。非抑制性纳米抗体不会影响底物的转运，即不会导致峰值电流信号的降低。
<ol>
	<li>准备 1–2 L 的非激活 SSM 缓冲液。</li>
	<li>将 50 mL 非激活 SSM 缓冲液转移至洁净离心管中，加入底物胆碱至终浓度为 5 mM（饱和条件），用于阳性对照测量。</li>
	<li>将 10 mL 非激活 SSM 缓冲液转移至洁净离心管中，加入底物胆碱至终浓度为 5 mM（饱和条件），并加入纳米抗体至终浓度为 500 nM。</li>
	<li>对每种纳米抗体重复步骤 4.3，以制备激活溶液。 
	注意：如果纯化的纳米抗体溶解于与 SSM 缓冲液不同的缓冲液中，则将其加入激活和非激活缓冲液时会导致缓冲液不匹配。应避免缓冲液不匹配，因为它可能导致高噪声。可通过将纯化纳米抗体置换至 SSM 缓冲液中以避免此问题。此外，建议使用能够达到饱和条件的纳米抗体浓度。鉴于纳米抗体的结合常数通常低于 100 nM，本实验推荐使用 500 nM 的纳米抗体浓度。然而，重要的是需预先筛选最佳浓度。</li>
	<li>启动 SSM 仪器，并按照步骤 3.4–3.7 所述方法测量蛋白脂质体包被芯片的电容和电导。</li>
	<li>将不含纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器中；将不含纳米抗体的非激活缓冲液转移至储液瓶中，并将其置于探针取样器中。</li>
	<li>将含有纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器中；将含有纳米抗体的非激活缓冲液转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器中。</li>
	<li>使用非激活（B）、激活（A）和非激活（B）溶液的序列（B-A-B 序列）创建工作流程协议。</li>
	<li>创建一个循环，执行以下操作：使用不含纳米抗体的缓冲液进行三次 B-A-B 序列测量，使用含纳米抗体的缓冲液进行两次 B-A-B 序列测量，随后设置 120 秒延迟时间以孵育纳米抗体，再使用含纳米抗体的缓冲液进行三次 B-A-B 序列测量。</li>
	<li>保存工作流程，并点击 播放 按钮运行。 
	注意：该工作流程将首先运行三次不含纳米抗体的非激活（B）和激活（A）缓冲液的 B-A-B 协议，以测量无抑制条件下的初始转运状态（图 1B、C）；随后运行五次含纳米抗体的非激活和激活缓冲液的 B-A-B 协议，以测量纳米抗体对转运的影响（图 2A）。纳米抗体与其靶蛋白的相互作用遵循二级结合动力学，因此在 B-A 步骤中设置时间延迟至关重要，以确保纳米抗体有足够时间结合芯片上蛋白脂质体中的转运蛋白。最佳孵育时间取决于纳米抗体浓度，即浓度越低所需时间越长。前两次测量用于使系统适应新条件，第二次运行应在 120 秒延迟后进行。仅后续三次测量的数据应用于数据分析。</li>
	<li>创建新的工作流程协议，使用非激活（B）、激活（A）和非激活（B）溶液的序列（B-A-B 序列），并设置包含 5 次测量的循环，以洗脱可逆结合的纳米抗体。 
	注意：可选择性地加入孵育步骤，以允许解离动力学较慢的纳米抗体充分解离。</li>
	<li>保存工作流程，并点击 播放 按钮运行。</li>
	<li>将最后一次测量的峰值电流与步骤 4.10 中初始仅底物的测量值进行比较。若峰值电流恢复至初始水平，则表明纳米抗体已成功洗脱且初始条件已重建；否则需重复步骤 4.12–4.13 或更换新芯片。</li>
	<li>重复步骤 4.6–4.13，每次纳米抗体筛选使用独立芯片（图 2C），或在同一芯片上依次测试多种纳米抗体（图 2D）。</li>
	<li>使用任意常用软件进行数据分析，绘制测得电流随时间变化的曲线。手动读取峰值电流，或在软件支持的情况下，自动选择激活缓冲液添加时间段内的峰值高度估算功能。</li>
	<li>根据前一次仅含底物的测量结果，对存在纳米抗体时的峰值电流进行归一化处理。将峰值电流绘制成直方图，并比较仅含底物测量的峰值电流与含纳米抗体条件下测得的峰值电流（图 2C、D），以识别具有抑制作用的纳米抗体。 
	注意：每次含纳米抗体的独立运行所测得的峰值电流归一化时，应以前一次无纳米抗体测量的峰值电流为基准。此外，由于不同芯片上固定的蛋白脂质体数量存在差异，因此在比较不同芯片制备之间的测量结果前，必须对每个芯片上的电流幅度分别进行归一化处理。</li>
</ol>
5. 使用抑制性纳米抗体进行IC50测定
注意：在鉴定出抑制性纳米抗体后，可测定其半数最大抑制浓度（IC50）。方法是在胆碱浓度保持恒定的条件下，测量不同浓度抑制性纳米抗体对胆碱转运的抑制作用。
<ol>
	<li>准备 1-2 L 的非激活 SSM 缓冲液。</li>
	<li>将 50 mL 非激活 SSM 缓冲液转移至一个洁净离心管中，加入底物胆碱，使其终浓度为 5 mM（饱和条件）。将&#160;此溶液用作阳性对照的激活溶液。</li>
	<li>取 8 个洁净离心管，每管加入 5 mL 非激活溶液，再向每管中加入胆碱底物，使其终浓度为 5 mM（饱和条件）。然后向各管中分别加入抑制性纳米抗体，浓度范围设定在预期的 IC50 范围内（此处为 500 nM - 1 nM）。</li>
	<li>另取 8 个洁净离心管，每管加入 10 mL 非激活溶液，并向每管单独加入与步骤 5.3 相同浓度的抑制性纳米抗体。此组对应为非激活缓冲液。 
	注：这将生成一系列在相同纳米抗体浓度下、但分别为激活与非激活状态的缓冲液配对。</li>
	<li>启动 SSM 装置，并按照步骤 3.4–3.7 所述方法测量蛋白脂质体包被芯片的电容和电导。</li>
	<li>将不含纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并置于探针取样器内；将不含纳米抗体的非激活缓冲液转移至储液槽中，并将其放置在芯片支架右侧的储液位。</li>
	<li>将含有纳米抗体的激活溶液分别转移至样品瓶中，并置于探针取样器内；将含有纳米抗体的非激活缓冲液也分别转移至样品瓶中，并置于探针取样器内。</li>
	<li>创建实验流程方案，使用非激活（B）、激活（A）和再次非激活（B）溶液的序列（B-A-B 序列）。包含一个循环，对每种浓度测量 2 次，孵育 120 秒后再测量 3 次。流程起始于仅含底物的阳性对照，随后按纳米抗体浓度从低到高依次进行。每次纳米抗体测量后，均需再次测量仅含底物的阳性对照，以恢复初始峰幅值，然后进入下一个更高浓度的纳米抗体测量。 
	注：纳米抗体的结合遵循二级动力学，因此在 B-A 步骤中必须设置时间延迟。最佳延迟时间取决于纳米抗体浓度，即浓度越低所需时间越长；此处采用 120 秒，结果满意。</li>
	<li>使用任意偏好的数据分析软件，绘制测得电流随时间变化的曲线。手动读取峰电流值，或若使用软件，则选择在激活缓冲液添加时间段内估算峰高的功能（图 3A）。将峰电流值对纳米抗体浓度作图，通过非线性回归分析确定 IC50 值（图 3B）。 
	&#8203;注：在比较不同芯片制备之间的测量结果前，需对每个独立芯片上所进行测量的电流幅值进行归一化处理。</li>
</ol>
6. 传感器的清洗
<ol>
	<li>使用后用 10 mL 蒸馏水冲洗单个传感器芯片。</li>
	<li>将芯片轻敲在纸巾上以干燥。</li>
	<li>向芯片的传感器腔内加入 100 µL 纯异丙醇，并在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>将棉签浸入纯异丙醇中，孵育 1–3 分钟。</li>
	<li>使用预先浸泡的棉签，在传感器表面轻轻旋转擦拭，避免施加压力，以去除残留物。</li>
	<li>用 5 mL 纯异丙醇冲洗传感器。</li>
	<li>用 10 mL 蒸馏水冲洗传感器。</li>
	<li>将芯片轻敲在纸巾上使其干燥。</li>
	<li>让传感器在室温下过夜干燥，并在室温下干燥环境中保存。 
	注意：若清洁和储存得当，传感器可重复使用 4–5 次。</li>
</ol>

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<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍的技术可用于对靶向生电型转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体进行分类。由于能够检测穿过蛋白脂质体膜中嵌入的转运蛋白的电荷移动，因此可以评估底物的转运情况。实验设置过程中的一些关键步骤包括：将活性蛋白重组到脂质体中、在固持单层膜（SSM）芯片上制备稳定的单分子层，以及在应用洗涤程序以去除结合的纳米抗体分子后恢复初始条件。一旦膜蛋白以适当的脂质-蛋白比例完成重组，即可使用天然底物建立通用的SSM实验方案。必须使用不含蛋白的脂质体进行对照实验，以识别需要从蛋白脂质体测得的电流中扣除的噪声电流。然而，如果噪声电流过大，建议尝试使用不同的脂质进行蛋白重组，或筛选能够最小化这些有害信号的缓冲条件。在成功建立SSM检测条件后，便可开展纳米抗体的筛选。一种有助于加快纳米抗体筛选速度的有效方法是使用单个SSM传感器芯片进行高通量检测。这种方法可减少芯片和缓冲液的操作时间，并降低实验成本。但是，由于在此类检测中需依次施加多种纳米抗体，因此必须确保每次测量后能够彻底洗脱已施加的纳米抗体。若在未添加纳米抗体的情况下检测到峰值电流幅度降低，则可能需要实施更严格的洗涤程序，以解离某些难以脱离的纳米抗体。我们建议以本文所述的洗涤条件作为起始点。如果增加洗涤体积...

抗体由两条相同的重链和两条轻链组成，其中轻链负责抗原结合。骆驼科动物具有仅含重链的抗体，其对相应抗原的亲和力与传统抗体相似1,2仅含重链抗体的单变量结构域（VHH）保留了完整的抗原结合能力，并已被证明具有很高的稳定性1,2这些分离的VHH分子或 &#34;纳米抗体&#34; 已应用于膜蛋白生物化学相关研究中，作为稳定构象的工具3,4，作为抑制剂5,6，作为稳定剂7，以及作为小工具用于&#160;结构测定8,9,10纳米抗体可通过免疫骆驼科动物，富集编码靶标特异性纳米抗体的B细胞，随后分离B细胞，构建纳米抗体文库，并利用噬菌体展示技术进行筛选获得。11,12,13. 一种生成纳米抗体的替代方法基于 体外 依赖于文库构建及通过噬菌体展示、核糖体展示或酵母展示进行筛选的方法14,15,16,17,18,19,20。这些 体外 方法需要较大的文库规模，但其优势在于无需动物免疫，并有利于筛选靶向稳定性相对较低蛋白的纳米抗体。
纳米抗体体积小、稳定性高、溶解性好、对抗原具有强亲和力、免疫原性低且相对易于生产，使其成为开发治疗药物的有力候选分子21,22,23。特别是那些能够抑制多种膜蛋白活性的纳米抗体，在临床应用中具有重要价值5,24,25,26。对于膜转运蛋白而言，要评估某种纳米抗体是否具有抑制活性，必须建立一种能够检测被转运底物和/或共底物的分析方法。这类分析通常涉及标记分子或设计底物特异性的检测手段，但这些方法往往缺乏通用性。此外，抑制性纳米抗体的鉴定通常需要对大量结合分子进行筛选。因此，一种可用于高通量模式且不依赖标记底物的检测方法对于此类筛选至关重要。
基于固持化膜（SSM）的电生理学是一种极其灵敏且具有高时间分辨率的技术，可用于检测跨膜电荷的移动（例如离子结合/转运）27,28。该技术已被用于表征生电性转运蛋白，这类蛋白由于周转率相对较低，难以通过其他电生理学技术进行研究29,30,31,32,33,34,35。SSM电生理学无需使用标记底物，适用于高通量筛选，并且可使用含有目标转运蛋白的蛋白脂质体或膜囊泡。本文中，我们证明基于SSM的电生理学可用于对具有抑制性和非抑制性特性的靶向转运蛋白的纳米抗体进行分类。作为原理验证，我们描述了将一种细菌胆碱转运蛋白重组到脂质体中的过程，随后详细说明了将蛋白脂质体固定在SSM传感器上的步骤。接着，我们阐述了如何开展基于SSM的胆碱转运电生理测量以及如何测定半最大有效浓度（EC50）。然后，我们展示了如何利用基于SSM的电生理学技术筛选多个纳米抗体并鉴定胆碱转运的抑制剂。最后，我们描述了如何测定选定抑制性纳米抗体的半最大抑制浓度（IC50）。

<table><tbody><tr><td>1-十八硫醇溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 吸附剂（聚苯乙烯吸附珠）</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>200 nm 滤膜</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>正癸烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;szlig;-D-麦芽糖苷（DDM）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>（SSM 装置）SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>-----</td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1 单传感器芯片</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌极性脂质提取物</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>蛋磷脂酰胆碱 L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

基于固相支撑膜（ssm）电生理学的转运体靶向抑制性纳米抗体筛选

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

单域抗体（纳米抗体）已广泛应用于蛋白质的机制和结构研究，并在开发临床治疗手段方面展现出巨大潜力，其中许多应用依赖于对转运蛋白等膜蛋白的抑制。然而，目前用于测定转运活性抑制作用的大多数方法难以实现高通量操作，且依赖于标记底物的可获得性，从而限制了对大型纳米抗体文库的筛选。固相支撑膜（SSM）电生理学是一种高通量方法，可用于表征生电型转运蛋白并测定其转运动力学及抑制效应。本文展示了基于SSM的电生理技术在筛选靶向生电型次级转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体中的应用，并可用于计算纳米抗体的抑制常数。该技术在筛选靶向缺乏标记底物的转运蛋白的抑制性纳米抗体时尤其具有应用价值。

基于固持化膜（SSM）的电生理学技术已被广泛用于电致转运蛋白的表征。在本方案中，我们展示了如何利用基于SSM的电生理学方法，根据纳米抗体对次级转运蛋白（此处为细菌胆碱同向转运蛋白）的抑制性或非抑制性特性，对其进行分类。该技术最有用的特点之一是能够对多种缓冲条件进行高通量筛选。这一特性对于纳米抗体文库的分析尤为有利，因为在筛选出结合子后，文库可能包含从数个到数十个不等的纳米抗体。在标准实验中，首先在传感器芯片上构建稳定的单层脂质膜。随后加入含有胆碱转运蛋白的蛋白脂质体，并检测良好的导电性和电容性，这对实验的成功至关重要。若实验过程中膜完整性受损（可通过背景电流噪声显著升高而轻易察觉），建议更换新的芯片，因为恢复低噪声状态较为困难。总体而言，我们在使用不同芯片进行转运及纳米抗体抑制效应的测量时，观察到了非常好的可重复性。
为了确定纳米抗体筛选过程中所用的底物浓度，首先在不同底物浓度下测量了电生运输以确定 EC50（图 1B、C）。选择一个对应于饱和条件的底物浓度（<str...

纳米抗体是结构生物学中的重要工具，在治疗手段的开发中具有巨大潜力。然而，筛选具有抑制特性的纳米抗体可能具有挑战性。本文展示了基于固态支撑膜（SSM）的电生理学技术，用于对靶向电驱动膜转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体进行分类。

基于固相支撑膜（SSM）电生理学的转运体靶向抑制性纳米抗体筛选

单域抗体（纳米抗体）已广泛应用于蛋白质的机制与结构研究，并在……方面展现出巨大潜力

本方案用于高通量筛选和鉴定靶向蛋白脂质体中重建的或膜囊泡中天然存在的生电型转运蛋白的抑制性与非抑制性纳米抗体。在多种情况下，设计转运实验可能较为困难，尤其是当缺乏标记底物时。而固持膜斑块（SSM）电生理技术无需标记底物，因此原则上可应用于研究纳米抗体对任何生电型转运蛋白转运功能的影响。纳米抗体已被研究用于医学应用。该技术可帮助筛选靶向人类或人类病原体特定生电转运蛋白的潜在抑制剂。首先，取10个洁净的试管，向每支试管中加入10毫升非激活型固相支撑膜（SSM）缓冲液。为配制激活型SSM缓冲液，请使用一系列接近预期半最大浓度的浓度，将底物加入试管中。启动SSM软件并让仪器自动初始化。设置数据保存路径。通过点击“确定”按钮进行确认。在工作流程选项中选择标准的初始清洁程序，然后点击运行。接下来，将涂有蛋白脂质体的芯片安装到插座上。移动机械臂以锁定芯片。用盖帽将安装好的芯片封闭。在工作流程中选择程序 CapCom，并运行以测定电导率和电容。使用前请确认电导率低于5纳西门子，电容在15至35纳法之间。将激活溶液转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器的相应位置。将非激活缓冲液转移至储液池中，并将其放置在芯片 holder 右侧的储液池位置。使用非激活溶液、激活溶液、非激活溶液的序列，即 BAB 序列，创建一个循环的实验流程，对全部 10 种激活缓冲液依次进行三次测量。采用默认流速 200 µL/s，BAB 序列中各步骤流速时间均为 1 秒，点击播放按钮以开始测量。保存该实验方案，然后点击播放按钮以运行整个流程。然后使用无蛋白脂质体进行相同的实验。采用任意偏好的数据分析软件，绘制测得的电流随时间变化的曲线，并在加入激活缓冲液的时间范围内，使用峰高估测函数进行分析。绘制峰值电流随底物浓度变化的曲线，通过非线性回归分析确定底物的半最大效应浓度（EC50）。将50毫升非激活型SSM缓冲液转移至洁净离心管中。加入底物胆碱，使其终浓度为5毫摩尔，并用此溶液进行阳性对照测定。将10毫升非激活型SSM缓冲液转移至另一洁净离心管中。将底物胆碱加入至终浓度为5毫摩尔，纳米抗体加入至终浓度为500纳摩尔。按照上述方法，对每种纳米抗体重复该步骤，以制备激活溶液。启动SSM仪器，并测量包被有蛋白脂质体的芯片的电容和电导率，操作方法如前所述。将不含纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并将缓冲液放入探针取样器内。将不含纳米抗体的非激活缓冲液转移至储液槽中，并将其置于探针取样器内。随后，对所有含有纳米抗体的激活溶液和非激活溶液重复此操作。创建使用 BAB 序列的工作流程方案。建立一个循环，首先使用不含纳米抗体的缓冲液进行三次 BAB 序列测量，接着使用含纳米抗体的缓冲液进行两次 BAB 序列测量，随后加入纳米抗体并孵育 120 秒，最后再使用含纳米抗体的缓冲液进行三次 BAB 序列测量。保存该工作流程，并点击播放按钮运行。接下来，使用 BAB 序列创建一个新方案，并设置包含五次测量的循环，以洗脱可逆结合的纳米抗体。保存该工作流程，然后单击播放按钮运行。将各次测量的最后一个峰电流与初始仅底物的测量结果进行比较。如果峰值电流恢复至初始值，则表明纳米抗体已成功洗脱，初始条件已重新建立。否则，需重复操作流程或更换新的芯片。每次纳米抗体筛选应使用单独的芯片重复此过程，或者在同一芯片上依次对多个纳米抗体重复该过程。使用任何常用的数据分析软件绘制测得的电流随时间变化的曲线。然后，软件会自动选择在加入激活缓冲液时间段内用于估算峰高的函数。根据之前仅含底物的测量结果，对峰电流以及纳米抗体的存在进行归一化处理。将峰电流绘制在直方图中，并将仅含底物的测量值与存在纳米抗体时测得的峰电流进行比较，以鉴定出具有抑制作用的纳米抗体。取50毫升非激活性SSM缓冲液加入洁净离心管中，加入胆碱底物至终浓度为5毫摩尔，作为阳性对照的激活溶液。将5毫升非激活性溶液分别加入8个洁净离心管中，然后在各管中加入胆碱底物和抑制性纳米抗体，使其浓度处于预期IC50范围内。向八根试管中各加入10毫升非激活溶液，并向每根试管中加入对应于非激活缓冲液的抑制性纳米抗体。启动SSM装置，测量蛋白脂质体包被芯片的电容和电导率。将不含纳米抗体的激活溶液转移至样品瓶中，并将其放入探针取样器内。然后将不含纳米抗体的非激活缓冲液转移至储液槽中，并将其放置在芯片支架右侧的储液槽位置。将含有纳米抗体的激活和非激活溶液分别转移至样品瓶中，并将缓冲液置于探针取样器内。使用BAB序列创建工作流程的实验方案。设置一个循环，对每种浓度测量两次，孵育120秒后，再测量三次。使用任意常用的数据分析软件，绘制电流随时间变化的曲线，并在加入激活缓冲液的时间范围内，选择合适的函数进行峰高估算。以纳米抗体浓度为横坐标，峰值电流为纵坐标作图，通过非线性回归分析确定IC50值。为了确定纳米抗体筛选过程中所用的底物浓度，通过在不同底物浓度下测定生电性转运以确定EC50值。选择对应于饱和条件的底物浓度（5毫摩尔）作为激活缓冲液中的恒定浓度。抑制性纳米抗体对生电性转运的影响通过峰电流幅度的降低得以显现。在运行洗涤程序以允许纳米抗体解离后，观察到初始峰值电流幅度恢复了80%至95%。当从非激活条件转换为激活条件时，这些缓冲液中存在的纳米抗体未引入显著的伪影电流。在筛选出具有抑制特性的纳米抗体后，测定了各个纳米抗体的IC50值。用含有纳米抗体的缓冲液对芯片上的蛋白脂质体进行校准时，必须给予足够的时间。由于结合是可逆的，因此在激活和非激活缓冲液中均需存在纳米抗体。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过基于固体支持膜（SSM）的电生理学选择转运蛋白靶向抑制纳米抗体

本文介绍一种基于固态支撑膜的电生理学方法，并重点阐述其在电致性膜转运蛋白表征中的应用。...

固相支持膜电生理学简介

许多治疗应用需要将药物载体及其携带的药物安全高效地转运通过体内的细胞屏障。本文介绍了一种对已有方法的改进，用于评估药物纳米载体（NCs）通过细胞屏障（如胃肠道（GI）上皮）的转运速率和机制。...

评估药物递送系统跨细胞屏障转运的模型与方法

本文的第一部分介绍了如何筛选在细胞质膜上表达囊泡型 Na+/H+ 交换体的突变细胞系。第二部分提供了基于细胞内 pH...

利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na+/H+ 交换体并进行功能表征

本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。...

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。...

电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

蛋白质从细胞表面逆行运输至高尔基体对于维持膜稳态至关重要。本文介绍一种利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中对重组蛋白从细胞表面到高尔基体的运输进行生化分析的方法。...

利用功能化纳米抗体在培养细胞中分析内吞摄取及逆行转运至反式高尔基网络

我们介绍一种采用两步酶解法从人膀胱标本中分离单个新鲜逼尿肌平滑肌细胞的方法。所获得的有活力的逼尿肌细胞可通过多种单细胞技术进行研究，包括文中所述的两性霉素B膜片钳电生理学技术，以揭示其生理学和药理学特性。...

新鲜分离人膀胱逼尿肌平滑肌细胞的制备与应用：用于表征9-苯并蒽酚敏感性阳离子电流

关键词：膀胱逼尿肌，平滑肌细胞，新鲜分离，9-苯并蒽酚，阳离子电流，电生理学，膜片钳技术

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E.

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。...

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

蛋白质从质膜到反式高尔基网络的内吞和逆向运输对于维持膜稳态和调控信号传导至关重要。本文介绍一种利用衍生化抗GFP纳米抗体，通过活细胞显微镜在HeLa细胞中对跨膜货物蛋白的内吞运输进行成像和定量分析的方法。...

利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

本方案描述了单抗体标记法（SAL），用于解析质膜蛋白的纳米级空间分布。通过利用单分子水平上的抗体-表位累积相互作用，膜蛋白单抗体标记法（mSAL）可在原生细胞环境中同时绘制局部表位分布图并捕获抗体结合行为。...

使用单抗体标记法对膜蛋白进行单分子定位显微成像

了解基于固体支持膜电生理学的高通量筛选方法，用于鉴定靶向电生转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体。该技术无需标记底物即可测定IC50值，适用于大规模纳米抗体文库筛选。

基于固相支撑膜（SSM）电生理学的转运体靶向抑制性纳米抗体筛选

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