通过基于固体支持膜（SSM）的电生理学选择转运蛋白靶向抑制纳米抗体

所提出的方案用于高通量筛选和鉴定靶向蛋白脂肪小体中重组或存在于膜囊泡中的电原转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体。在多种情况下设计转移测定可能很困难，尤其是在没有标记底物的情况下。如果相同的电生理学允许研究纳米抗体对几乎任何电生转运蛋白的转运的影响，因为SSM电生理学不需要标记的底物。

纳米抗体已被研究用于医疗应用。该技术可以帮助筛选针对人类或人类病原体的特定电生转运蛋白的潜在抑制剂。首先，取10个干净的试管，并将10毫升非活化固体支撑膜或SSM缓冲液转移到每个试管中。

要制备活化SSM缓冲液，请使用一系列接近预期半最大浓度的浓度将底物加入试管中。启动 SSM 软件并让计算机自动初始化。设置数据的保存路径。

点击"确定"按钮进行确认。在工作流选项中选择标准的初始清理协议，然后单击运行。接下来，将蛋白脂体包被的芯片安装在插座上。

移动机械臂以锁定芯片。用盖子封装安装的芯片。在工作流程中选择CapCom程序，然后让它运行以确定电导率和电容。

在将其用于测量之前，确认电导率低于5纳西门，电容在15至35纳法拉之间。将活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。将非活化缓冲液转移到储液槽中，并将其放在右侧储液器位置的切屑架旁边。

在循环中使用非激活、激活和非激活溶液序列或 BAB 序列为工作流程创建协议，该循环执行三次测量并移动到所有 10 个缓冲液的下一个激活缓冲液。使用默认流速 200 微升/秒，BAB 序列的流速为 1 秒、1 秒、1 秒，然后单击播放开始测量。保存协议，并通过单击播放按钮让工作流运行。

然后使用无蛋白脂质体进行相同的实验。使用任何首选软件进行数据分析，以绘制测量的电流与时间的关系，并使用该函数在添加激活缓冲器的范围内进行峰值高度估计。将峰值电流与底物浓度绘制，通过非线性回归确定底物浓度的一半最大效应或EC50。

将50毫升非活化SSM缓冲液转移到干净的管中。将底物胆碱加入至最终浓度为5毫摩尔，并将其用于阳性对照测量。将10毫升非活化SSM缓冲液转移到干净的管中。

将底物胆碱加入5毫摩尔，将纳米体加入500纳摩尔终浓度。对每个纳米体重复该步骤，以制备所示的活化溶液。启动SSM机器并测量蛋白脂体包覆芯片的电容和电导率，如前所述。

将没有纳米体的活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液置于探针采样器中。将无纳米体的非活化缓冲液转移到储液器中，并将其定位在探针采样器中。然后对所有含有纳米抗体的溶液重复此过程，并具有激活和非活化溶液。

使用 BAB 序列为工作流创建协议。创建一个循环，使用不含纳米体的缓冲液对BAB序列进行三次测量，使用含有纳米体的缓冲液对BAB序列进行两次测量，与纳米体一起孵育120秒延迟时间，以及使用含有纳米体的缓冲液对BAB序列进行三次测量。保存工作流，并通过单击播放按钮让它运行。

接下来，使用BAB序列和五个测量的循环为工作流程创建新的协议，以冲洗掉可逆结合的纳米体。保存工作流，并通过单击播放按钮让它运行。将测量值的最后峰值电流与初始仅基板测量值进行比较。

如果峰值电流达到初始值，则纳米体已被成功洗掉，并且初始条件已重建。否则，请重复工作流程或更改为新芯片。对每个纳米体屏幕使用单独的芯片重复此过程，或者使用相同的芯片对多个纳米体重复此过程。

使用任何首选软件进行数据分析，以绘制测量的电流与时间的关系。然后，软件自动选择功能，在添加激活缓冲区的范围内进行峰高估计。根据正在进行的仅基底测量，对峰值电流和纳米体的存在进行归一化。

绘制直方图中的峰值电流，并将仅基板测量值的峰值电流与在纳米体存在下测量的峰值电流进行比较，以识别抑制性纳米抗体。将50毫升非活化SSM缓冲液转移到干净的管中，并将底物胆碱加入至5毫摩尔的终浓度，并将其用作阳性对照的活化溶液。将五毫升非活化溶液加入八个干净的管中，然后将底物胆碱和抑制性纳米体以预期IC50范围内的浓度添加到管中。

向八个管中加入10毫升非活化溶液，并向对应于非活化缓冲液的每个管中加入抑制性纳米体。启动SSM设置并测量蛋白脂体包覆芯片的电容和电导率。将不含纳米体的活化溶液转移到小瓶中，并将其置于探针采样器中。

然后将没有纳米体的非活化缓冲液转移到储液槽中，并将其放置在右侧芯片支架旁边的储液槽位置。将含有纳米抗体的活化和非活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。使用 BAB 序列为工作流创建协议。

包括一个循环，测量每个浓度两次，孵育120秒，再测量三次。使用任何首选的数据分析软件绘制测量的电流与时间的关系，并在添加激活缓冲器的范围内选择峰值高度估计功能。绘制峰值电流与纳米体浓度的关系，通过非线性回归确定IC50。

为了确定在纳米抗体筛选期间要使用的底物浓度，在不同底物浓度下测量电生传递以确定EC50。选择对应于饱和条件的底物浓度，即5毫摩尔，并在所有活化缓冲液中保持恒定。抑制性纳米抗体对电生转运的影响从峰值电流幅度的降低中可见一斑。

在运行洗涤方案以允许纳米体解绑后，观察到初始峰值电流幅度的80%至95%的恢复。当从非激活条件转变为激活条件时，这些缓冲液中存在的纳米体不会引入明显的伪影电流。在选择具有抑制性质的纳米抗体后，测定了单个纳米抗体的IC50值。

至关重要的是要有足够的时间用含有纳米体的缓冲液校准芯片上的蛋白脂质体。由于结合是可逆的，纳米体需要同时存在于激活和非活化缓冲液中。