小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理

本方案具有重要意义，因为它旨在解答关于小鼠肺动脉瓣结构与功能关联的问题，而这一问题通常因其固有的异质性而难以研究。通过采用受控固定和关联成像技术，可在多个长度尺度上捕捉其结构特征。随后，可将局部高分辨率图像精确回溯至肺动脉瓣上的特定解剖位置。

本操作将由全美儿童医院再生医学中心显微外科主任 Tai Yi 博士进行演示。首先，对小鼠解剖所需器械进行高压灭菌，包括精细剪刀、显微镊、微血管夹、施夹镊、显微持针器、弹簧剪和牵开器。处死一只成年 C57BL/6 小鼠后，将其置于解剖盘上呈仰卧位，用胶带固定四肢，然后进行开胸术。

通过去除多余的脂肪组织和筋膜暴露心脏，随后去除右心房，并用室温生理盐水灌注左心室。切断上腔静脉、下腔静脉、肺动脉和主动脉，将整个心脏取下，并在心室-心房交界处上方约两毫米处剪断，该部位将作为加压的通道。去除左心室和右心室，使心腔暴露于大气压下，同时确保去除心室时不影响肺动脉干结构。

将加压管路与肺动脉吻合，使管路末端与窦管交界处之间保留约一毫米的距离，以适应瓣叶和肺动脉干的大幅度运动。将储液器抬升至相应的生理压力，并用生理盐水溶液填充。测试流通系统，确保无堵塞或气泡存在。

将三通阀连接至吻合的肺动脉瓣，并通过切换流出道确保管路中有足够的灌注流量。当流量充足后，将流出道切换至吻合的肺动脉瓣，并通过观察肺动脉干的扩张确认其已加压。确认肺动脉干加压后，逐渐加入初始固定液，直至盐水溶液的储液容量被置换出25%。

将浸有固定液的纱布覆盖在组织样本上，以防止干燥。用固定液灌注三小时，并及时补充储液器中的固定液，以维持恒定压力。灌注完成后，将心脏瓣膜置于固定液溶液中，在4°C条件下保存，可保存至多一周，以备后续使用。

染色时，用冰冷的0.15摩尔卡考基late缓冲液清洗固定的心瓣膜样本三次，每次五分钟，然后将心瓣膜完全浸入冰上预冷的溶液中，该溶液包含1.5摩尔铁氰化钾、0.15摩尔卡考基late缓冲液、2毫摩尔氯化钙和2%四氧化锇，孵育一小时。将样本转移至室温双蒸水中，在管中轻轻振荡清洗五分钟。再经过三次清洗后，将样本置于室温过滤后的硫代碳酰肼溶液中。

20分钟后，用水清洗样品三次，方法如前所述。接着，将样品置于室温下的2%四氧化锇溶液中。30分钟后，用水清洗三次，每次5分钟，并将样品在4摄氏度下于1%醋酸铀酰溶液中过夜孵育。

同时，配制硝酸铅溶液。次日，按之前演示的方法进行三次洗涤操作，然后将心脏瓣膜组织在60摄氏度的铅天冬氨酸溶液中孵育30分钟。再次洗涤样本三次，随后在冰上依次用新配制的20%、50%、70%和90%乙醇对心脏瓣膜组织进行梯度脱水处理，每次5分钟，最后再用100%乙醇处理两次。

脱水后，将组织转移至冰冻丙酮中，然后置于室温新鲜丙酮中10分钟。包埋时，按照制造商说明书配制树脂混合液。将组织依次放入树脂与丙酮比例为25:75、50:50和75:25的混合液中处理，每步各2小时。

最后，将组织置于100%树脂中过夜。次日，将组织转移至新鲜的100%树脂中。两小时后，将组织转入包埋胶囊，加入新鲜100%树脂，并置于60摄氏度烘箱中固化48小时。

此处显示的是在施加静水压之前和之后切除的吻合肺动脉。肺动脉主干呈径向扩张，表明肺动脉瓣叶处于关闭状态。微计算机断层扫描证实了肺动脉瓣的闭合状态。

瓣叶处于闭合状态，瓣环呈圆形，同时观察到不同程度的肺动脉瓣压力不足，原因可能是固定所致或动脉塌陷。通过将显微CT容积渲染的虚拟横截面与光学图像进行对照，以确认切片的方向和位置。当样本块处于理想位置和方向时，对瓣叶内局部区域进行高分辨率SBF-SEM成像。

此处展示了微计算机断层扫描（micro CT）体积渲染虚拟切片、低分辨率和高分辨率连续块面扫描电子显微镜（SBF SEM）图像之间的关联图像。在肺动脉瓣分段区域的三维表征中，可识别出内皮细胞、瓣膜间质细胞以及细胞外纤维等细胞外成分。在实施本方案时，请注意加压步骤至关重要，可确保获得尽可能高的产出率。