Name: 穆林肺瓣膜相关成像的手术和样品处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学习小鼠肺瓣膜多尺度结构成像方法，采用静水压固定、整体染色及μCT与SBF-SEM联合成像技术，实现高分辨率超微结构数据与解剖位置的精确对应，为心脏瓣膜疾病的机制研究提供可靠技术支撑。

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本工作部分由授予 CKB 的 R01HL139796 和 R01HL128847 基金以及授予 DWM 的 RO1DE028297 和 CBET1608058 基金支持。

本研究中动物的使用遵循全国儿童医院机构动物护理和使用委员会批准的方案 AR13-00030。
1. 肺动脉瓣切除
<ol>
	<li>对小鼠解剖所需工具进行高压灭菌。这些工具包括精细剪刀、显微镊子、显微血管夹、持夹镊子、显微持针器、弹簧剪和牵开器。</li>
	<li>手术前至少将所有小鼠适应环境两周。取出约1年龄的C57BL/6小鼠，从笼中取出后称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮:赛拉嗪 = 3:1，每克体重0.01 mL）实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于托盘上，并用胶带固定四肢。固定后，进行开胸操作。
	<ol>
		<li>清除多余脂肪组织和筋膜，暴露心脏。</li>
		<li>切除右心房，并通过左心室以室温生理盐水（0.9% NaCl）进行灌注。灌注量约为20 mL，持续约30秒。此过程可使小鼠完全放血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切断上腔静脉、下腔静脉、肺动脉和主动脉，完整取出心脏。操作肺动脉时需格外小心。在心室-动脉连接处上方约2 mm处剪断，该段将作为后续加压的通路。</li>
	<li>切除左心室和右心室，使心腔暴露于大气压下。注意确保切除心室过程中肺动脉主干结构不受影响。</li>
</ol>
2. 肺动脉瓣的压力固定
<ol>
	<li>将加压导管与肺动脉吻合，使窦管交界处与导管末端之间保留约1 mm的距离，以适应瓣叶和肺动脉干的大幅度运动。</li>
	<li>将储液罐抬升至接近生理压力的水平，并用生理盐水充满。测试流通系统，确保无堵塞或气泡存在。</li>
	<li>在吻合的肺动脉瓣处连接一个三通阀，通过切换流出道确保导管内有充分的液体流动（即无气泡）。当流动充分后，将流出道切换至吻合的肺动脉瓣，确保肺动脉干被加压。可通过观察肺动脉干扩张来确认加压成功。</li>
	<li>一旦确认肺动脉干已加压，逐步引入固定液（1.25% 戊二醛，1.0% 多聚甲醛溶于0.15 M cacodylate缓冲液），直至完全置换出生理盐水。具体操作为移除约25%储液罐容量的生理盐水，并替换为初始固定液。 
	注意：所使用的固定剂（多聚甲醛和戊二醛）具有高度毒性，应穿戴适当的个人防护装备（PPE）以确保安全。</li>
	<li>用浸有固定液的纱布覆盖组织样本，防止干燥。</li>
	<li>以固定液灌注3小时，根据需要补充储液罐以维持恒定压力。在固定过程中，由于化学固定作用，肺动脉瓣发生收缩是常见现象。若出现此情况，需持续补充初始固定液以维持生理压力。</li>
	<li>将心脏瓣膜置于固定液中，于4 °C保存备用。样本保存时间最长可达1周，未观察到明显差异。</li>
</ol>
3. 组织块整体染色与包埋15,16
警告：本节使用的染色试剂（亚铁氰化钾、四氧化锇、硫代碳酰肼、天冬氨酸铅和醋酸铀酰）具有高毒性，应极其小心地操作。建议在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。
<ol>
	<li>染色
	<ol>
		<li>用冰冷的 0.15 M 卡可基酸盐缓冲液清洗固定的心瓣膜样本 5 分钟。重复清洗两次。</li>
		<li>将心瓣膜完全浸入含有 1.5% 亚铁氰化钾、0.15 M 卡可基酸盐、2 mM 氯化钙和 2% 四氧化锇的溶液中，置于冰上孵育 1 小时。</li>
		<li>在样本孵育期间，通过将 0.1 g TCH 溶解于 10 mL ddH2O 中制备硫代碳酰肼（TCH）溶液。将溶液置于 60 °C 烤箱中 1 小时。定期轻轻振荡以确保 TCH 完全溶解。使用前立即用 0.22 µm 注射器滤器过滤该溶液。</li>
		<li>用室温 ddH2O 清洗样本：将样本放入装有 ddH2O 的试管中 5 分钟，并通过轻轻摇动容器进行轻微振荡。重复此过程三次。</li>
		<li>将样本置于过滤后的 TCH 溶液中，在室温下孵育 20 分钟。然后按照步骤 3.1.4 所述方法，用室温 ddH2O 清洗三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>完成后，将样本置于 2% 四氧化锇溶液中，室温孵育 30 分钟。然后再次用室温 ddH2O 清洗三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将样本在 1% 醋酸铀溶液中 4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>在此期间，将 0.066 g 硝酸铅溶于 10 mL 天冬氨酸储备液中，用 1 N KOH 调节 pH 至 5.5。将溶液置于 60 °C 烤箱中以溶解硝酸铅。</li>
		<li>过夜孵育后，按照步骤 3.1.4 所述方法进行清洗，重复三次。然后将心瓣膜组织置于步骤 3.1.8 制备的铅-天冬氨酸溶液中，在 60 °C 烤箱中孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水
	<ol>
		<li>用室温 ddH2O 清洗组织 5 分钟，重复三次。</li>
		<li>用 ddH2O 新鲜配制 20%、50%、70%、90% 和 100% 的乙醇溶液。置于冰上保存，直至使用。</li>
		<li>对心瓣膜组织进行脱水处理：依次在冰上使用 20%、50%、70% 和 90% 乙醇溶液处理，每次 5 分钟。然后在冰上用 100% 乙醇连续处理两次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将组织转移至冰冻丙酮中 10 分钟，随后转移至室温新鲜丙酮中 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包埋
	<ol>
		<li>根据制造商说明配制树脂混合物（参见材料表）：组分 A 11.4 g，组分 B 10 g，组分 C 0.3 g，组分 D 0.05–0.1 g。首先将组分 A 和 B 分别加热至 60 °C 后混合，再加入组分 C 和 D。加入组分 C 和 D 后，混合物将变为琥珀色。充分混合后应呈均匀状态。</li>
		<li>配制体积比为 25:75、50:50 和 75:25 的树脂:丙酮混合液，充分混匀。</li>
		<li>将组织依次置于 25:75、50:50 和 75:25 的树脂:丙酮混合液中，每种混合液在室温下处理 2 小时。</li>
		<li>将组织置于 100% 树脂中，室温过夜。</li>
		<li>次日，将组织转移至新鲜的 100% 树脂中，室温处理 2 小时。</li>
		<li>将心瓣膜组织转移至包埋胶囊中，更换为新鲜 100% 树脂，并置于 60 °C 烤箱中固化 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下所示进行相关成像。</li>
</ol>
4. 微型计算机断层扫描成像
<ol>
	<li>使用粘合剂（胶水或双面胶均可）将树脂样品块固定在 µCT 样品 holder 上。</li>
	<li>将 holder 放入 µCT 腔室，并通过拧紧夹头将其固定在载物台上，确保 holder 无任何移动。扫描过程中样品的移动会降低图像质量。</li>
	<li>通过双击图标打开 µCT 用户界面。点击 Projects 旁边的 + 号添加项目，并填写必要的信息字段。</li>
	<li>项目创建完成后，找到该新建项目并点击选中。此时将出现第二个栏目 Acquisitions。点击 Acquisitions 旁边的 + 号，并填写必要的信息字段。</li>
	<li>关闭腔室门，按下 µCT 前面板上的启动按钮以启动系统。在用户界面中点击标有 Warmup 的按钮，开始 X 射线预热。 
	注意：系统在成功完成预热程序后将自动关闭 X 射线。需手动点击按钮重新开启 X 射线。</li>
	<li>调整载物台旋转位置，使样品的旋转中心不偏离显示器中心（即在整个扫描过程中样品始终处于视野范围内）。对于本实验所用系统，需按照以下步骤在下拉选项卡中调节感兴趣区域（ROI）载物台：
	<ol>
		<li>将旋转角度设为 0°，标记样品边缘；然后将样品旋转至 180°，再次标记样品边缘。</li>
		<li>调节 ROI 载物台的 x 轴位置，使样品边缘位于上述两个极端位置之间。对 y 轴位置重复此过程，使用 90° 和 270° 的旋转角度进行调节。</li>
		<li>若样品旋转时边缘移出视野范围，则需降低 µCT 的放大倍数，直至在上述设定角度下可见样品边缘，从而进行粗略的 ROI 载物台调节。</li>
		<li>在较低放大倍数下完成初步调节后，移动样品或探测器以提高放大倍数，并对 ROI 位置进行精细调节。 
		注意：此过程可能需要重复多次以确保对齐准确。正确对齐的结果是样品在所有旋转角度下几乎无水平移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用制造商提供的软件将 µCT 调整至所需的扫描参数。这些参数包括管电压、管电流、探测器距离、样品距离、曝光时间、轨迹以及投影数量（本研究中使用的 µCT 采集参数见 Table S1）。 
	注意：校准参数（如空白场和暗场扫描）应保持为制造商规定的标准值，除非另有说明。例如，若样品过大导致系统无法将其移出视野，则需手动取出样品以执行空白场校准扫描。</li>
	<li>参数设置完成后，点击 Time Estimate 按钮可预估扫描所需时间。点击 Start 按钮开始扫描。</li>
	<li>扫描完成后，确认 X 射线已关闭，松开夹头，并小心地将样品从 µCT 腔室中取出。</li>
</ol>
5. 样品处理与图像关联
<ol>
	<li>使用制造商提供的软件（参见材料表），通过滤波反投影算法重建µCT投影图像。
	<ol>
		<li>在屏幕顶部选择Recon选项卡，然后选择Project和Acquisition选项卡。</li>
		<li>选择与滤波反投影相关的重建模板，点击Start Recon按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用图像处理软件识别并分割肺动脉瓣。此步骤需要预先掌握肺动脉瓣的解剖结构17。在动脉压力升高时，瓣叶会合，阻塞肺动脉瓣的管腔。</li>
	<li>确定切片方向相对于扫描方向和样品的位置。重新调整样品方向，使切片方向与目标轴对齐。</li>
	<li>确定用于高分辨率成像的兴趣区域。在本实验中，选择了瓣叶中部（腹部）以及动脉-瓣膜交界处。</li>
	<li>对于较大材料，可使用剃刀或砂纸去除多余树脂和样品；对于更精细的部分，则使用切片机进行修整。</li>
	<li>到达目标位置后，将实际样本与虚拟µCT切片进行比对，以确认位置。此步骤通过比较横截面的解剖特征完成。</li>
</ol>
6. 连续块面扫描电子显微镜18
<ol>
	<li>将样品截面减小至适合SBF-SEM，尺寸约为2.0 × 1.5 × 1.8 mm。</li>
	<li>使用环氧树脂将修整后的样品固定在SBF-SEM铝制样品 stub 上。</li>
	<li>在样品块表面镀约35 nm厚的金层。旋转样品平台，以确保镀层均匀。</li>
	<li>对SBF-SEM腔室进行放气，并将切片刀刃高度调整至显微镜的等中心高度。</li>
	<li>插入样品并调平样品 stub。</li>
	<li>在低真空条件下成像，以防止电荷积累，并使用背散射电子探测器（SBF-SEM成像参数见表S2）。</li>
	<li>使用自动化软件在不同放大倍数下对多个感兴趣区域进行成像并拼接（参见材料表）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

去除心室具有两个目的。首先，将心室侧暴露于大气压下，从而只需从肺动脉瓣的动脉侧施加跨瓣压力即可使其关闭；其次，提供一个稳定的基底，防止肺动脉干发生扭转。在加压过程中，肺动脉干会向径向和下方扩张，容易发生扭曲，导致肺动脉干塌陷。用生理盐水溶液对肺动脉瓣进行预加压，可提供额外的质量控制，以确保加压充分，并检测系统是否存在任何泄漏。固定剂的主要作用迅速，仅需数秒即可完成；若未使用生理盐水进行流体静力预加压，肺动脉瓣将被固定在随机构象中。若不进行预加压，肺动脉瓣成功闭合的几率仅为10%–20%；而通过预加压步骤，成功率可提升至90%以上。
针对本应用优化了µCT和SBF-SEM成像条件。肺动脉瓣在完全拉伸时厚度可小于10 µm。通常，分辨某一结构至少需要3个体素的阈值；因此，µCT体积重建的扫描体素尺寸设定为2.9 µm，视场为8.4 × 8.4 × 6.3 mm。在µCT中可实现更小的体素尺寸，但这需要对样品进行修整和/或延长扫描时间。通过将样品更靠近X射线源放置，可实现更高分辨率。将X射线探测器远离样品放置也可获得更小的体素，但会降低探测器上的总通量，从而影响信噪比。作为参考，本研究中...

肺动脉瓣（PV）的功能是确保血液在右心室与肺动脉之间的单向流动。肺动脉瓣的畸形与多种先天性心脏病相关。目前，先天性心脏瓣膜病（HVD）的治疗方法主要是瓣膜修复或瓣膜置换，这些治疗可能需要患者在一生中接受多次侵入性手术1。目前普遍认为，心脏瓣膜的功能源于其结构，这一关系常被称为结构-功能相关性。更具体而言，心脏的几何结构和生物力学特性决定了其功能表现。而这些力学特性又由细胞外基质（ECM）的组成和组织结构所决定。通过建立一种测定小鼠心脏瓣膜生物力学特性的方法，可利用转基因动物模型来研究ECM在心脏瓣膜正常功能与功能障碍中的作用2,3,4,5。
小鼠动物模型长期以来被视为分子研究的标准模型，因为与其他物种相比，小鼠的转基因模型更容易获得。小鼠转基因模型为心脏瓣膜相关疾病的研究提供了多功能的平台6。然而，表征心脏瓣膜几何结构和细胞外基质（ECM）组织所需的外科技术与仪器设备，一直是推动心脏瓣膜病（HVD）研究的主要障碍。文献中的组织学数据能够揭示小鼠心脏瓣膜细胞外基质的组成，但仅限于二维图像形式，无法描述其三维结构7,8。此外，心脏瓣膜在空间和时间上均具有异质性，若取样位置和构象未标准化，则难以在不同实验之间对ECM组织得出一致结论。传统的三维表征方法，如磁共振成像（MRI）或三维超声心动图，无法提供分辨ECM组分所需的分辨率9,10。
本研究详细描述了一种完全关联的工作流程，通过流体静力跨瓣压力固定小鼠肺动脉瓣的构象，解决了由心动周期引起的时间异质性问题。通过在不同成像模式（特别是微计算机断层扫描（µCT）和连续块面扫描电子显微镜）之间对感兴趣区域进行取样并配准跨多个长度尺度的数据集，精确控制了空间异质性。此前已有研究提出利用µCT进行前期 scout 扫描以指导后续取样，但由于肺动脉瓣存在时间上的动态变化，因此在手术层面需要额外的控制措施11。
描述小鼠心脏瓣膜生物力学的体内研究较为匮乏，目前主要依赖计算模型来描述其变形行为。将纳米尺度下的局部细胞外基质数据与心脏瓣膜的几何结构和位置相关联至关重要。这能够提供可量化的、空间定位的机械性贡献ECM蛋白分布图谱，可用于强化现有的心脏瓣膜生物力学模型12,13,14。

<table><tbody><tr><td>25% 戊二醛（水溶液）</td><td>EMS</td><td>16210</td><td>主要固定剂组分</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>22G 针头</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td>MX5311L</td><td></td></tr><tr><td>4% 四氧化锇</td><td>EMS</td><td>19150</td><td>染色组分</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（水溶液）</td><td>EMS</td><td>157-4-100</td><td>主要固定剂组分</td></tr><tr><td>可吸收性止血剂</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>EMS</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>黑色聚酰胺单丝缝线，10-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td>TI38402</td><td></td></tr><tr><td>黑色聚酰胺单丝缝线，6-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td>SN-1956</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>约 1 岁</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>持夹钳</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 细镊</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM 树脂</td><td>EMS</td><td>14040</td><td>用于包埋</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Heliscan 微型 CT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>微型 CT</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-84-8</td><td>染色组分</td></tr><tr><td>硝酸铅</td><td>EMS</td><td>17900</td><td>染色组分</td></tr><tr><td>低真空背散射探测器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VSDBS</td><td>SEM 背散射探测器</td></tr><tr><td>微型 Adson 镊</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 滤器，0.22 µm，PES 33 mm，非无菌</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>无纺纱布</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>六氰合铁(II)酸钾三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14459-95-1</td><td>染色组分</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>压力监测管路</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td>MX562</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>3 号 BEEM 包埋胶囊</td><td>EMS</td><td>69910-01</td><td>包埋容器</td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6131-99-3</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>Solibri 牵开器</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>溅射、碳镀和电子束镀膜仪</td><td>Leica</td><td>EM ACE600</td><td>金镀膜仪</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>硫代碳酰肼（TCH）</td><td>EMS</td><td>21900</td><td>染色组分</td></tr><tr><td>Tish 持针器/镊子</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>修整仪</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>染色组分</td></tr><tr><td>VolumeScope 扫描电子显微镜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VOLUMESCOPESEM</td><td>连续块面扫描电子显微镜</td></tr><tr><td>赛拉嗪无菌溶液</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

心脏瓣膜相关疾病（HVD）的根本病因尚不明确。小鼠动物模型为研究HVD提供了优秀的工具，然而，要精确量化多个尺度下结构与组织的特征，需要高超的手术技巧和仪器操作能力，这在一定程度上限制了该领域的发展。本研究详细描述了小鼠心脏的解剖、整块染色、样品处理以及多尺度下心脏瓣膜成像的关联成像流程。采用静水跨瓣压力控制时间异质性，通过化学固定维持心脏瓣膜的构象。利用显微计算机断层扫描（µCT）确认心脏瓣膜的几何形态，并为后续用于连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的样品处理提供参考依据。采集并重建了细胞外基质（ECM）的高分辨率连续扫描电镜图像，以获得其局部组织结构的三维表征。随后将µCT与SBF-SEM成像方法进行关联，以克服肺动脉瓣跨区域的空间差异。尽管本研究所展示的内容仅针对肺动脉瓣，该方法可推广应用于描述生物系统中的层级结构组织，对于实现多尺度下的结构表征具有重要意义。

肺动脉与加压导管的吻合如图所示 图1A施加静水压后，肺动脉干径向扩张（图1B）表明肺动脉瓣瓣叶处于闭合状态。通过以下方式确认肺动脉瓣的构象： µCT。在这种情况下，瓣叶对合（闭合），且瓣环呈圆形。图2A). 图2B，C 显示不同程度的肺动脉瓣加压不足，原因可能是固定（图2B）或动脉塌陷（图2C).
样本块修整依据µCT体积渲染结果进行。本例中，选择与窦-瓣交界平行的平面作为切片方向。通过解剖标志，将µCT体积渲染的虚拟横断面与光学图像（图3）进行比对，以确认切片方向和位置。
当样本...

本文介绍了一种相关性工作流程，用于切除、加压、固定和成像小鼠肺动脉瓣，以确定其宏观构象及局部细胞外基质结构。

心脏瓣膜疾病（HVD）的潜在病因尚不明确。小鼠动物模型为研究HVD提供了优良的工具，然而，……

本方案具有重要意义，因为它旨在解答关于小鼠肺动脉瓣结构与功能关联的问题，而这一问题通常因其固有的异质性而难以研究。通过采用受控固定和关联成像技术，可在多个长度尺度上捕捉其结构特征。随后，可将局部高分辨率图像精确回溯至肺动脉瓣上的特定解剖位置。本操作将由全美儿童医院再生医学中心显微外科主任 Tai Yi 博士进行演示。首先，对小鼠解剖所需器械进行高压灭菌，包括精细剪刀、显微镊、微血管夹、施夹镊、显微持针器、弹簧剪和牵开器。处死一只成年 C57BL/6 小鼠后，将其置于解剖盘上呈仰卧位，用胶带固定四肢，然后进行开胸术。通过去除多余的脂肪组织和筋膜暴露心脏，随后去除右心房，并用室温生理盐水灌注左心室。切断上腔静脉、下腔静脉、肺动脉和主动脉，将整个心脏取下，并在心室-心房交界处上方约两毫米处剪断，该部位将作为加压的通道。去除左心室和右心室，使心腔暴露于大气压下，同时确保去除心室时不影响肺动脉干结构。将加压管路与肺动脉吻合，使管路末端与窦管交界处之间保留约一毫米的距离，以适应瓣叶和肺动脉干的大幅度运动。将储液器抬升至相应的生理压力，并用生理盐水溶液填充。测试流通系统，确保无堵塞或气泡存在。将三通阀连接至吻合的肺动脉瓣，并通过切换流出道确保管路中有足够的灌注流量。当流量充足后，将流出道切换至吻合的肺动脉瓣，并通过观察肺动脉干的扩张确认其已加压。确认肺动脉干加压后，逐渐加入初始固定液，直至盐水溶液的储液容量被置换出25%。将浸有固定液的纱布覆盖在组织样本上，以防止干燥。用固定液灌注三小时，并及时补充储液器中的固定液，以维持恒定压力。灌注完成后，将心脏瓣膜置于固定液溶液中，在4°C条件下保存，可保存至多一周，以备后续使用。染色时，用冰冷的0.15摩尔卡考基late缓冲液清洗固定的心瓣膜样本三次，每次五分钟，然后将心瓣膜完全浸入冰上预冷的溶液中，该溶液包含1.5摩尔铁氰化钾、0.15摩尔卡考基late缓冲液、2毫摩尔氯化钙和2%四氧化锇，孵育一小时。将样本转移至室温双蒸水中，在管中轻轻振荡清洗五分钟。再经过三次清洗后，将样本置于室温过滤后的硫代碳酰肼溶液中。20分钟后，用水清洗样品三次，方法如前所述。接着，将样品置于室温下的2%四氧化锇溶液中。30分钟后，用水清洗三次，每次5分钟，并将样品在4摄氏度下于1%醋酸铀酰溶液中过夜孵育。同时，配制硝酸铅溶液。次日，按之前演示的方法进行三次洗涤操作，然后将心脏瓣膜组织在60摄氏度的铅天冬氨酸溶液中孵育30分钟。再次洗涤样本三次，随后在冰上依次用新配制的20%、50%、70%和90%乙醇对心脏瓣膜组织进行梯度脱水处理，每次5分钟，最后再用100%乙醇处理两次。脱水后，将组织转移至冰冻丙酮中，然后置于室温新鲜丙酮中10分钟。包埋时，按照制造商说明书配制树脂混合液。将组织依次放入树脂与丙酮比例为25:75、50:50和75:25的混合液中处理，每步各2小时。最后，将组织置于100%树脂中过夜。次日，将组织转移至新鲜的100%树脂中。两小时后，将组织转入包埋胶囊，加入新鲜100%树脂，并置于60摄氏度烘箱中固化48小时。此处显示的是在施加静水压之前和之后切除的吻合肺动脉。肺动脉主干呈径向扩张，表明肺动脉瓣叶处于关闭状态。微计算机断层扫描证实了肺动脉瓣的闭合状态。瓣叶处于闭合状态，瓣环呈圆形，同时观察到不同程度的肺动脉瓣压力不足，原因可能是固定所致或动脉塌陷。通过将显微CT容积渲染的虚拟横截面与光学图像进行对照，以确认切片的方向和位置。当样本块处于理想位置和方向时，对瓣叶内局部区域进行高分辨率SBF-SEM成像。此处展示了微计算机断层扫描（micro CT）体积渲染虚拟切片、低分辨率和高分辨率连续块面扫描电子显微镜（SBF SEM）图像之间的关联图像。在肺动脉瓣分段区域的三维表征中，可识别出内皮细胞、瓣膜间质细胞以及细胞外纤维等细胞外成分。在实施本方案时，请注意加压步骤至关重要，可确保获得尽可能高的产出率。

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穆林肺瓣膜相关成像的手术和样品处理

高频多普勒超声是一种用于评估局部心肌功能的新型技术。本研究首次证明了这种多功能成像平台在缺血-再灌注（IR）小鼠心脏中重复测量心肌应变、dp/dt及二尖瓣反流的可行性。...

高频高分辨率超声心动图：非侵入性重复测量缺血-再灌注小鼠心脏心肌应变、收缩力及二尖瓣反流的首次证据

在本视频中，我们描述了通过灌注加压法将小鼠肺动脉瓣固定在闭合构象并进行化学固定的分离步骤。...

小鼠肺动脉瓣膜的加压固定：一种在闭合构象下分离并化学固定的实验方法

右心室（RV）功能障碍在心血管疾病的发病机制中至关重要，但目前可用于评估右心室功能的方法十分有限。近年来超声成像技术的进步为长期纵向研究右心室提供了无创且准确的选择。本文中，我们详细描述了一种利用右心室压力超负荷小鼠模型进行的逐步超声心动图检测方法。...

经胸超声心动图评估肺动脉缩窄小鼠模型中右心室结构与功能

为了理解组织工程心脏瓣膜中新生组织形成和狭窄发展的细胞与分子机制，研究人员建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。采用异位心脏移植技术，将肺动脉瓣移植至受体动物体内。...

异位心脏移植小鼠模型中肺动脉瓣移植

本方案详细描述了用于小鼠心脏及心脏瓣膜功能全面表型分析的超声心动图方法。...

小鼠瓣膜性心脏病全面表型特征的超声心动图方法与方案

本文提供了一种研究右心室衰竭机制的有效方法。通过使用自制的手术器械，建立了一种更为简便且高效的肺动脉缩窄方法。此外，还提供了利用超声心动图和导管插入术评估该方法质量的技术。...

通过肺动脉缩窄诱导小鼠右心室衰竭及右心室功能评估

本文报道了一种由二尖瓣反流引起的左心容量超负荷的啮齿动物模型。在超声引导下，将特定尺寸的针插入正在跳动的心脏的二尖瓣前叶，从而诱导出可控严重程度的二尖瓣反流。...

一种通过图像引导经心尖二尖瓣叶穿刺建立大鼠二尖瓣反流致容量负荷过重的可控模型

本文介绍了一种用于保存小鼠肺切片（PCLS）组织血管收缩功能的方案，可获得肺血管系统和气道的复杂三维图像，且该组织样本的活性可维持长达10天，适用于多种实验操作。...

精准切割肺组织切片作为一种高效工具用于 离体 肺血管结构与收缩性研究

本方案展示了在显微镜引导下分离小鼠肺静脉并进行免疫荧光染色的方法。我们制备包含左心房、肺静脉及相应肺组织的样本，并对心肌肌钙蛋白T和连接蛋白43进行染色。...

小鼠肺静脉心肌袖的显微解剖与免疫荧光染色

我们描述了一种通过肺动脉干缩窄诱导右心室压力超负荷的小鼠模型。本文包含了气管插管、手术操作以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。气管插管和手术过程中使用了自制的器械，可实现模型的快速建立且成本低廉。...

通过肺动脉干缩窄建立压力超负荷诱导的小鼠右心室肥厚与衰竭模型

学习小鼠肺瓣膜多尺度结构成像方法，采用静水压固定、整体染色及μCT与SBF-SEM联合成像技术，实现高分辨率超微结构数据与解剖位置的精确对应，为心脏瓣膜疾病的机制研究提供可靠技术支撑。

小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理

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