穆林肺瓣膜相关成像的手术和样品处理
August 5th, 2021
在这里，我们描述了一个相关的工作流程的切除，加压，固定和成像的粘液肺瓣，以确定总构象和局部细胞外矩阵结构。
此协议意义重大，因为它旨在回答有关粘膜肺瓣膜结构函数相关性的问题，由于其固有的异质性，这通常比较棘手。受控固定和相关成像用于在多个长度尺度上捕获结构。然后，可以映射到肺瓣上的精确解剖位置。
展示手术的将是全国儿童医院再生医学中心显微外科主任泰毅博士。首先自动解剖鼠标所需的工具，包括细剪刀、微力、微血管夹、夹子、微刀架、弹簧剪刀和缩回器。对成年C57BL/6小鼠实施安乐死后，将其放在托盘上的侧卧位置，用胶带固定其四肢，并进行胸腔切除术。
通过去除多余的脂肪组织和筋膜来暴露心脏，然后取出右中庭，用室温盐水溶液灌注左心室。切除高级静脉腔、劣质静脉腔、肺动脉和主动脉，切除整个心脏，并在心室结上方切开约两毫米，作为加压的导管。取出左右心室，使腔室暴露在大气压力下，通过移除心室确保肺干结构不受影响。
肺动脉的氨糖加压管，在管状结和管末端之间留下约一毫米的距离，以适应传单和肺干的巨大运动。将储层提升到类似的生理压力，并填充盐水溶液。测试流经系统，以确保没有堵塞或气泡。
将止损孔连接到气管肺瓣上，通过切换流出通道确保管道的充足流动。一旦流量充足，将流出开关到血管化肺瓣，并确保通过树干阻隔识别的肺干加压。确认肺干加压后，逐步采用初级固定液，直至盐水溶液25%的储层容量被清除。
在组织样品上放置固定浸泡纱布，以防止干燥。将固定剂敷料三小时，重新填充储层以保持恒定压力。灌注后，将心脏瓣膜存放在四摄氏度的固定溶液中，直至使用一周。
对于染色，用冷0.15摩尔可可酸酯缓冲器将固定心脏瓣膜样品清洗三次，浸入1.5钾铁氰化物、0.15摩尔可可二酸酯、2毫摩尔氯化钙和2%硅四氧化硅溶液中，在冰上浸泡1小时。用室温双蒸馏水清洗样品，将样品放入管中五分钟，轻微搅拌。再洗三次后，将样品放入室温下过滤的硫碳水化合物溶液中。
20 分钟后，用之前证明的水清洗样品三次。接下来，将样品在室温下放置在 2% 的四氧化硫中。30分钟后，用水清洗三次，每次5分钟，并在4摄氏度的1%醋酸酯中孵育样品过夜。
同时，准备硝酸铅的解决方案。第二天，像之前一样进行三次洗涤，然后在60摄氏度的铅阿斯巴酸盐溶液中孵育心脏瓣膜组织30分钟。再清洗样品三次，然后用新鲜制备的20、50、70和90%乙醇在冰上进行连续脱水处理，每次5分钟，然后用100%乙醇进行两次后续治疗。
脱水后，将组织移至冰冷丙酮，然后在室温下将其放入新鲜丙酮中10分钟。要嵌入，根据制造商的规格制作树脂混合物。将组织放在随后的治疗25至75，50至50和75至25树脂到丙酮混合物两个小时。
最后，将组织放在100%树脂过夜。第二天，将组织放入新鲜的100%树脂中。两小时后，将组织转移到嵌入胶囊中，加入新鲜的100%树脂，并将其放入60摄氏度的烤箱中48小时进行治疗。
这里显示了水静压应用前后的切除的肺动脉。肺干在径向上分散，表明肺瓣膜的传单处于封闭配置中。微计算断层扫描确认了肺瓣确认。
传单被关闭，环形是圆形的，同时观察到不同程度的肺瓣加压不足，无论是固定或动脉塌陷。渲染虚拟横截面的微型 CT 音量与光学图像相关，以确认切片方向和位置。高分辨率 SBF SEM 图像是在传单中的局部区域拍摄的，当时标本块位于所需的位置和方向。
此处显示微型 CT 卷渲染虚拟切片、低分辨率和高分辨率 SBF SEM 图像之间的相关图像。在肺瓣膜细分区域的3D表示中，可以识别细胞外组件，如内皮细胞、瓦尔维拉间位细胞和细胞外纤维。在尝试此协议时，请记住，执行加压至关重要，并将确保产量尽可能高。
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概述
本协议概述了小鼠肺动脉瓣切除、加压、固定和成像的相关工作流程。其目的是阐明其总体构形和局部细胞外基质结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 再生医学
背景
- 由于其固有的异质性，小鼠肺动脉瓣提出了挑战。
- 了解其结构-功能关系对各种生物医学应用至关重要。
- 受控固定和成像技术对于准确的结构分析至关重要。
- 本研究利用高分辨率成像来绘制多个长度尺度的结构图。
研究目的
- 开发一个可靠的研究小鼠肺动脉瓣的协议。
- 捕捉瓣膜结构的详细图像。
- 将高分辨率图像与精确的解剖位置相关联。
使用的方法
- 对小鼠准备工具进行高压灭菌。
- 安乐死并将小鼠定位以进行开胸手术。
- 进行肺动脉瓣的切除和固定。
- 利用相关成像技术进行结构分析。
主要结果
- 成功捕捉到肺动脉瓣在各种尺度上的结构。
- Tai Yi博士演示了该协议。
- 将局部高分辨率图像映射到解剖位置。
- 对瓣膜细胞外基质结构的洞察。
结论
- 开发的工作流程对于研究小鼠肺动脉瓣是有效的。
- 高分辨率成像为瓣膜结构提供了宝贵的见解。
- 这种方法可以增强对瓣膜功能和病理学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multiscale structural characterization of the murine pulmonary valve enables precise mapping of anatomical and ultrastructural features, addressing a key challenge in cardiovascular target validation. Correlative imaging workflows integrating micro-computed tomography (μCT) and serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM) provide high predictive confidence for structure-function relationships in preclinical models. This capability supports risk-adjusted advancement of cardiovascular discovery programs and informs translational biomarker strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of heart valve structure-function hypotheses in disease-relevant murine models.
- Supports biological de-risking by resolving spatial heterogeneity at multiple length scales.
- Facilitates functional target validation through precise anatomical localization of ultrastructural features.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio triage in cardiovascular research.
Screening & Assay Development
- Establishes validated reference systems for quantitative imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation and imaging protocols for reproducibility across studies.
- Enables high-resolution mapping of extracellular matrix and cellular components for screening readiness.
- Supports scalable imaging workflows for reliable compound evaluation in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural characterization with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Provides a framework for correlating imaging biomarkers with functional outcomes in preclinical studies.
- Reduces mechanistic ambiguity in model selection and validation.
- Enables risk-adjusted decisions for advancing candidates targeting heart valve pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This correlative imaging protocol bridges early discovery and preclinical validation by enabling quantitative, multiscale analysis of heart valve structure in murine models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through precise anatomical and ultrastructural mapping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides 3D reference data and high-resolution readouts for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical imaging endpoints with clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow adaptable to other biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiovascular target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and sample processing for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiovascular discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine microsurgery, tissue fixation, and advanced imaging techniques.
- Demands access to μCT and SBF-SEM instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to other organ systems with appropriate protocol modifications.
- Critical dependence on precise pressurization and fixation to ensure data quality.
