使用下一代测序来鉴定与CD4启动子附近CAS9诱导的双链断裂修复相关的突变

该协议可帮助您识别在修复由单导RNA和CAS9诱导的双链断裂过程中发生的突变。这种技术的主要优点是，它是一种经济高效且可靠的方法来检测特定基因组位点的突变。我们以人角质形成细胞为例，但该方案可以适应任何可转染的细胞系。

演示该协议的将是我们实验室的本科生助理Taylor Bugbee。首先，在含有角质形成细胞培养基的夹克培养箱中，在10厘米板中以37摄氏度与5%二氧化碳培养HFK LXSN和HFK 8E6细胞进行培养，该培养箱中含有人角质形成细胞生长补充剂和1%青霉素链霉素。用三毫升胰蛋白酶-EDTA代替培养基，并在37摄氏度下孵育三分钟。

然后，用等体积的FBS补充培养基中和胰蛋白酶。现在，将细胞转移到15毫升离心管中，并以300倍G离心5分钟。用10毫升角质形成细胞培养基用人角质形成细胞生长补充剂重新悬浮细胞，并用血细胞计数器测定细胞浓度。

之后，在四毫升角质形成细胞培养基中分别接种两块用于HFK LXSN和HFK 8E6细胞的平板，并补充人角质形成细胞生长补充剂和1%青霉素链霉素。接种后，将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下在夹套培养箱中孵育。在转染当天，用三毫升不含抗生素的补充培养基替换培养基，并在夹套培养箱中以37摄氏度孵育两小时。

要转染细胞，请将转染试剂加热至室温，并在使用前轻轻移液。将适量的转染缓冲液放入每个细胞系的两个无菌1.5毫升离心管中，并将其标记为试管1和模拟转染或试管2。然后，加入两微克质粒DNA表达，CAS9，单导，RNA靶向人CD4到试管一个，轻轻移液以完全混合。

向管二中加入等体积的无菌水。将适量的转染试剂加入带有DNA混合物的试管1和模拟转染或试管2中。使用移液器，轻轻地将它们完全混合，并在室温下孵育15至30分钟以形成复合物。

将转染混合物滴加到培养皿中，轻轻摇动培养板一分钟，使转染混合物均匀分布。要通过胰蛋白酶消化收获细胞，用一毫升胰蛋白酶EDTA替换培养基，并在37摄氏度下孵育三分钟。然后，用等体积的FBS补充培养基中和胰蛋白酶。

对于每板细胞，将细胞悬浮液转移到两个具有相等等分试样的微量离心管中，并以300倍G离心五分钟。离心后，将细胞沉淀从一个管中重新悬浮在一毫升PBS中进行测序，并在另一个管中，用冰冷的PBS重新悬浮细胞颗粒以进行免疫布团。进行免疫布洛特测定以比较未转染和转切的HFK细胞中的CAS9表达。

结果表明，未转染和转切的HFK细胞表达的CAS9量相似，表明两个细胞系之间的转染效率相似。获得SgRNA/CAS9转染细胞中磷酸化组蛋白H2AX S139的免疫荧光显微镜图像和未转染对照。结果表明， CAS9 SgRNA诱导了两次双链断裂.

基因组变异按HFK LXSN和HFK 8E6突变事件的类型分组，其中每组基因组变异和HFK LXSN和HFK 8E6之间的变异总数进行比较。结果表明，8E6增加了CAS9诱导的双链断裂周围200千碱基内的基因组变异，表明HPV 8E6解除了双链断裂修复的调节，增加了基因组的不稳定性。免疫布洛特的目的是测量转染效率，在数据分析过程中应考虑这一点。

除了转染效率外，免疫荧光显微镜还可用于确认使用磷酸盐H2AX作为标记物的双链断裂诱导。我们以β HPV 8E6为例。该技术可用于检测由其他试剂（如小分子抑制剂）引起的突变频率或类型的变化。