利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

本方案可帮助您鉴定由单导向RNA和CAS9诱导的双链断裂修复过程中发生的突变。该技术的主要优势在于，它是一种经济高效且可靠的方法，可用于检测特定位点基因组上的突变。我们以人角质形成细胞为例，但本方案可适用于任何可转染的细胞系。

本实验方案由本实验室的本科助理 Taylor Bugbee 演示。首先，在含有角质形成细胞培养基、人角质形成细胞生长添加剂以及 1% 青霉素-链霉素的培养环境中，将 HFK LXSN 和 HFK 8E6 细胞接种于 10 厘米培养皿中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下的隔套式培养箱中进行培养。随后，弃去原培养基，加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C 孵育 3 分钟。

然后，用等体积的含胎牛血清的培养基中和胰蛋白酶。将细胞转移至15毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。用10毫升添加了人角质形成细胞生长添加剂的角质形成细胞培养基重新悬浮细胞，并用血细胞计数板测定细胞浓度。

随后，将 HFK LXSN 和 HFK 8E6 细胞分别接种至两个培养皿中，每皿加入 4 mL 含有人角质形成细胞生长添加剂和 1% 青霉素-链霉素的角质形成细胞培养基。接种后，将细胞置于 37°C、5% CO₂ 的隔套式培养箱中孵育。转染当天，更换为 3 mL 无抗生素的补充培养基，在隔套式培养箱中 37°C 孵育 2 小时。

转染细胞时，先将转染试剂恢复至室温，并在使用前轻轻吹打混匀。为每种细胞系取两支无菌的1.5毫升离心管，分别加入适量的转染缓冲液，并标记为管一和模拟转染管（或管二）。然后，向管一中加入2微克表达CAS9和靶向人CD4的单导向RNA的质粒DNA，并轻轻吹打以充分混匀。

向二号管中加入等体积的无菌水。向含DNA混合物的一号管以及对照转染或二号管中加入适量的转染试剂。使用移液器轻轻充分混匀，并在室温下孵育15至30分钟，以形成复合物。

将转染混合物逐滴加入培养板中，并轻轻摇晃培养板一分钟，以使转染混合物均匀分布。通过胰酶消化法收集细胞时，弃去培养基，加入一毫升胰酶-EDTA溶液，于37摄氏度孵育三分钟。随后，加入等体积含FBS的培养基以中和胰酶活性。

对于每孔细胞，将细胞悬液等量转移至两支微量离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。离心后，将其中一支管中的细胞沉淀用1毫升PBS重悬，用于测序；另一支管中的细胞沉淀则用预冷的PBS重悬，用于免疫印迹实验。通过免疫印迹实验比较未转染与转染HFK细胞中CAS9的表达水平。

结果显示，未转染和转染的 HFK 细胞表达了相似量的 CAS9，表明两种细胞系之间的转染效率相似。获得了 SgRNA/CAS9 转染细胞及未转染对照细胞中磷酸化组蛋白 H2AX S139 的免疫荧光显微镜图像。结果表明，CAS9 SgRNA 诱导了两个双链断裂。

在HFK LXSN和HFK 8E6中，基因组变异按突变事件类型进行分组，并比较了每组基因组变异及总变异数量。结果显示，8E6可增加CAS9诱导的双链断裂周围200千碱基范围内的基因组变异，表明HPV 8E6会破坏双链断裂修复过程，从而增加基因组不稳定性。免疫印迹的目的是检测转染效率，在数据分析时应考虑此因素。

除了转染效率外，还可利用免疫荧光显微镜技术，以磷酸化 H2AX 作为标志物，来确认双链断裂的诱导情况。我们以 beta 属人乳头瘤病毒 8E6 为例进行说明。该技术也可用于检测其他试剂（如小分子抑制剂）所引起的突变频率或突变类型的变化。