Name: 光学镊子研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学习使用光学镊子结合共聚焦显微镜研究RNA与蛋白质相互作用的方法。本方案详细展示了如何实时监测RNA解折叠过程中的力学变化及翻译调控中的结合事件。

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感谢Anuja Kibe和准教授Redmond Smyth对稿件的审阅。感谢Tatyana Koch提供的专业技术支持。感谢Kristyna Pekarkova在实验视频录制过程中提供的帮助。我们实验室的工作得到了亥姆霍兹协会以及欧洲研究理事会（ERC）资助项目编号948636（资助对象：NC）的支持。

1. 样品制备
<ol>
	<li>将目标序列克隆至含有λ DNA片段的载体中，这些λ DNA片段作为手柄序列图2)43,50.</li>
	<li>首先生成用于后续的DNA模板 体外 通过PCR进行转录图2B；反应1）。在此PCR步骤中，T7启动子被添加至正义DNA分子的5'端32,33,43,50. 按照以下条件设置PCR反应 表1. 在PCR仪中运行PCR程序 50 µL 在热循环仪中用适当的循环次数分装等量样品。</li>
	<li>通过两次独立的PCR反应制备引物表1, 图2B；反应2和3）。首先，通过PCR生成5'端接头。然后，使用5'端标记地高辛的引物，扩增生成3'端接头并同时用地高辛进行标记32,33,43,50.</li>
	<li>PCR反应后，使用硅胶柱离心法纯化DNA。</li>
	<li>进行 体外 使用T7 RNA聚合酶进行转录反应表2)32,33,43,50. 将反应置于孵育 37 °C 根据RNA长度，孵育2-4小时。随后向反应体系中加入DNase I，并在指定条件下孵育 37 °C 孵育30分钟以消化DNA模板。使用硅胶离心柱纯化RNA。</li>
	<li>在5'端手柄的标记反应过程中（表3），通过T4 DNA聚合酶在手柄的3'端添加生物素-16-dUTP38,50在室温下反应1-2小时。随后使用硅胶离心柱纯化DNA。 
	注意：由于5'手柄必须在其3'端进行标记（图2B），标记无法在PCR过程中进行。</li>
	<li>将上述组分——5'端接头（3'端标记生物素）、3'端接头（5'端标记地高辛）和RNA——按1:1:1的摩尔比在退火缓冲液（80%甲酰胺，400 mM NaCl，40 mM HEPES，pH 7.5，0.5 mM EDTA，pH 8）中混合，以获得所需的RNA/DNA杂交分子表4）。将退火混合物加热至 85 °C 10分钟，然后缓慢冷却至 4 °C.</li>
	<li>将退火后的样品与1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5）、3倍体积的预冷乙醇混合，于-80 °C 至少 1 小时或在 -20 °C 过夜。</li>
	<li>将样品在15,000 × g 30 分钟 4 °C弃去上清液，并在真空下干燥沉淀（通常不可见）。</li>
	<li>最后，将沉淀重悬于 50 µL 加入无RN酶水并分装。将分装样品于 -80 °C 直至使用。短期储存时，样品也可存放于 -20 °C.</li>
</ol>
2. 仪器设置
注意：以下实验方案已针对 LUMICKS 公司的商用光镊仪器 C-Trap 进行优化。因此，在使用其他光镊仪器时，可能需要对所述步骤进行相应调整。若未使用，仪器的微流控系统应保存在次氯酸钠溶液（漂白剂）中，使用前必须进行清洗。
<ol>
	<li>弃去漂白剂，并用 1 mL 无 RNase 水填充注射器。</li>
	<li>向至少 1 mL 无 RNase 水中加入 50 µL 的 0.5 M 硫代硫酸钠，彻底冲洗系统（1 bar，至少 0.5 mL），以清除系统中残留的漂白剂。</li>
	<li>弃去注射器中的硫代硫酸钠溶液。更换为新的注射器，并用至少 0.5 mL 无 RNase 水冲洗系统。 
	注意：务必小心，确保微流控系统始终不干燥，以避免系统中产生气泡。</li>
	<li>在物镜顶部滴加 2 滴浸油（折射率为 1.33）或约 70 µL 水。</li>
	<li>将流动池放入固定架中并定位。</li>
	<li>在流动池顶部滴加 2 滴浸油（折射率为 1.51）。</li>
	<li>开启光镊设备中的激光装置。待其运行后，在软件界面中将捕获激光调至 100%。</li>
	<li>使用诊断相机（Z-finder），通过旋转微调螺丝调节 Z 轴，使其位于第二和第三反射面（界面）之间的腔室中部，此处折射环最大。 
	注意：每次物镜靠近测量腔室，且物镜焦平面穿过两相界面时，在 Z-finder 模式下均可观察到反射现象。可能存在四个界面：(i) 水/浸油与底部玻璃；(ii) 底部玻璃与腔室内缓冲液；(iii) 腔室内缓冲液与顶部玻璃；(iv) 顶部玻璃与聚光镜浸油。</li>
	<li>调节聚光镜位置（将捕获激光设为约 50%），使聚光镜接触测量腔室顶部的浸油。</li>
	<li>缓慢上下移动聚光镜以调节焦点，使“月牙模式”（诊断相机）下显示约 10 条光带。</li>
</ol>
3. 样品测量
<ol>
	<li>将抗地高辛素包被的磁珠（AD）与样品构建体（3 µL 的 0.1% (w/v) AD 磁珠悬浮液 + 4 µL 样品）以及 1 µL RNase 抑制剂和 8 µL 检测缓冲液（300 mM KCl，5 mM MgCl2，20 mM HEPES，pH 7.6，0.05% Tween 20，5 mM DTT）在室温下孵育 10–20 分钟。孵育结束后，用 500 µL 检测缓冲液稀释样品。 
	注意：建议在缓冲液中添加氧气清除剂，特别是在进行荧光检测时，以防止氧化损伤。本实验采用含葡萄糖（8.3 mg/mL）、葡萄糖氧化酶（40 U/mL）和过氧化氢酶（185 U/mL）的氧气清除系统。</li>
	<li>将 0.8 µL 的 1% (w/v) 链霉亲和素包被（SA）磁珠与 1 mL 检测缓冲液混合。</li>
	<li>弃去注射器中的水，并用相应的悬浮液/溶液填充注射器。在约 1 bar 压力下清洗至少 2 分钟，然后开始捕获磁珠。 
	注意：根据实验设置，可使用不同的通道排列方式（图3）。通常，一个流动通道填充携带 RNA 分子的抗地高辛素磁珠，第二个通道填充链霉亲和素包被的磁珠，缓冲液通道用于形成分子拴系。第四个通道可用于加载 RNA 结合蛋白（图3C），或者也可将 RBP 直接加入缓冲液通道中（图3B）。</li>
	<li>为捕获磁珠，将光镊相互分开。首先移动至 AD 通道，并在光镊 1 中捕获一个 AD 磁珠；接着将载物台移至 SA 通道，利用光镊 2 捕获单个 SA 磁珠。 
	注意：应尽量停留在缓冲液与磁珠通道的界面处，以避免已捕获的磁珠丢失，或防止同一光镊捕获多个磁珠。</li>
	<li>一旦捕获到合适尺寸的磁珠，即移至缓冲液通道并停止层流。随后进行力校准以检测光镊刚度。x/y 轴方向的刚度值差异不应超过 10–15%。 
	注意：根据磁珠大小调整激光功率或光镊之间的激光分配。只要磁珠模板匹配（相似性评分 &gt; 0.9），无需对每一对磁珠都进行力校准。但应定期校准，或至少在每次检测条件改变时进行一次校准。</li>
	<li>通过将两个磁珠靠近、等待数秒后再将其拉开的方式开始“钓鱼”以形成拴系，重复此过程直至形成拴系。当两个磁珠被拉开时，若检测到测量力增加，则表明已形成拴系。 
	注意：为避免形成多个拴系，磁珠不应靠得过近。在两个磁珠之间形成拴系后，可通过寻找过拉伸平台来检查拴系质量。单个拴系的平台力应在 50 至 60 pN 之间。</li>
	<li>获得拴系后，开始测量。根据所研究的现象选择不同的测量设置（图1B-D）。 
	注意：通常在实验开始时先进行力斜坡实验，以检查拴系质量并探测其行为特征。之后可进一步开展恒力或恒位置实验，以深入研究状态转变。当对某一 RNA 样品完成足够数量的测量以确定其行为特征后，可向系统中加入标记因子以进行共聚焦检测。</li>
	<li>进行荧光检测时，开启光镊仪器中的共聚焦激光器和光子计数单元。</li>
	<li>在软件界面中开启所需波长的激发激光，并根据荧光染料类型将激光功率设为 5% 或更高。 
	注意：在不进行检测时，应将激发激光功率调至 0%，以避免对样品造成过度光损伤。</li>
	<li>使用软件中的成像功能开始对样品成像。 
	注意：为获得清晰聚焦的图像，需对共聚焦显微镜与光镊的焦平面进行对齐。为此，可利用聚苯乙烯磁珠在蓝光激光通道中的自发荧光信号。沿 z 轴上下移动光镊的焦平面，直至磁珠图像达到最大直径。在此位置，可测量拴系于两磁珠之间的分子的荧光信号。</li>
	<li>使用 kymograph 功能时，设定 kymograph 轴的 x-y 位置，使其能够检测到两磁珠之间的拴系。</li>
	<li>在整个测量过程中，可通过将磁珠移动至不同通道，或改变微流控系统中供给的缓冲液组成，轻松调节缓冲液成分。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>原始数据预处理
	<ol>
		<li>使用一个简单的脚本对原始数据进行足够的降采样，以（i）加快后续的数据处理速度，同时（ii）仍保留所有关键信息（图4A）。通常，100–5000 Hz 的采样频率适用于此目的。 
		注意：光镊实验中的数据采集频率通常高于分析所需——在本研究展示的实验中，默认数据采集频率设置为 78 125 Hz。由于存储空间有限，降低数据的采样率既方便又节省时间。此处，原始数据被以30倍因子进行降采样。</li>
		<li>接下来，使用信号滤波器以减少信号中的高频测量噪声（图4A）。根据不同的实验情况，调整滤波器的阶数和截止频率参数，以优化数据输出（图5）。 
		注意：在各类信号滤波器中，巴特沃斯滤波器（Butterworth filter）51 是应用最广泛的之一。补充数据中提供了一个自编写的 Python 脚本，可用于原始数据的预处理。降采样和信号滤波参数（截止频率、滤波器阶数）需根据不同实验进行优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于力斜坡（force-ramp）数据的分析，请按以下步骤进行。
	<ol>
		<li>通过在力轨迹图上手动标记对应点，或使用自编写的脚本，标记出展开台阶。在力-距离（FD）曲线中，展开台阶的特征表现为力的突然下降，同时伴随距离的增加。</li>
		<li>一旦标记出展开事件，使用适当的模型对 FD 曲线的不同区域进行拟合（图4D）。 
		注意：在第一个展开台阶之前的区域，可将连接链视为“双链”结构，通常使用可延展的蠕虫状链模型（extensible Worm-like-chain model, WLC）进行拟合47,52,53。第一个展开事件之后的部分则被视为双链核苷酸（手柄区）与单链核苷酸（展开的 RNA 分子）的组合。因此，数据拟合更为复杂——通常采用两个 WLC 模型的组合，或 WLC 与自由连接链模型（Freely-jointed chain, FJC）的组合36,39,52。可延展的 WLC 模型有两个主要拟合参数：轮廓长度（LC）和持久长度（LP）。轮廓长度对应于分子完全拉伸时的长度，而持久长度则定义了目标分子的弯曲特性。该模型可用以下方程（1）描述。 
		(1) <img alt="Worm-like chain model equation, \(X_{WLC}=L_C[1-\frac{1}{2}(\frac{k_BT}{F\cdot L_p})^{1/2}+\frac{F}{S}]\)." src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 
		其中 x 为延伸长度，LC 为轮廓长度，F 为力，LP 为持久长度，kB 为玻尔兹曼常数，T 为热力学温度，S 为拉伸模量。 
		另一种称为自由连接链（Freely-jointed chain, FJC）的模型常用于描述展开后的单链区域的行为。该模型使用类似的聚合物参数，但将“链”的每个单元视为刚性杆，此处对应于展开单链区域的核苷酸。以下方程（2）描述了该模型： 
		(2) <img alt="Flexible polymer chain extension formula; static equilibrium equation; research use." src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2"> 
		注意：我们实验室最近开发了一种可批量处理原始力斜坡数据的算法，名为“实用光镊分析工具”（Practical Optical Tweezers Analysis TOol, POTATO）54。该算法对数据进行降采样和滤波，识别可能的展开台阶，并最终完成数据拟合。POTATO 采用用户友好的图形界面（GUI）构建（https://github.com/REMI-HIRI/POTATO）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下方式处理恒力（constant-force）数据： 
	注意：以下说明可类比应用于恒位置（constant-position）数据。
	<ol>
		<li>对于恒力数据，绘制距离随时间的变化图（图5）。绘制显示不同构象频率（计数）随相对位置变化的直方图，是表征各种主要和次要状态的有效方法（图7）。</li>
		<li>使用（多个）高斯函数对直方图进行拟合，以估算在给定力下各构象体的总体百分比（图7C）。高斯拟合的均值位置和标准差可揭示不同群体之间的力相关关系。 
		注意：补充数据中提供了一个自编写的 Python 脚本，可用于恒力数据的预处理及基本的双峰高斯拟合。参数（截止频率、滤波器阶数、预期均值、标准差值和振幅）需根据不同实验进行优化。</li>
		<li>接下来，采用隐马尔可夫模型（Hidden Markov model）进一步分析状态，可能揭示额外的折叠中间态（构象体）55。有关恒力实验和隐马尔可夫模型的更多详细信息，可参考文献55,56,57,58。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了使用荧光耦合光镊研究RNA分子与各种配体之间相互作用及动态行为的方法。下文将讨论该技术的关键步骤及其局限性。
实验方案中的关键步骤 
与许多其他方法一样，样品的质量对于获得可靠数据至关重要。因此，为了获得尽可能高质量的样品，投入时间优化样品制备流程是十分必要的。优化步骤包括引物的合理设计、退火温度的确定，以及RNA和蛋白质的纯化步骤。
在整个实验过程中，使用带滤芯的吸头和溶液对于维持无RNase环境至关重要。此外，微流控系统在不使用时应保存在漂白剂中。开始测量前，必须用硫代硫酸钠和无RNase水对系统进行充分清洗，以彻底去除系统中的漂白剂。
如果在整个实验过程中使用相同尺寸的微珠，则无需每次进行力校准。然而，为了确保实验的可重复性，应定期进行力校准检查。
方法的改进与故障排除 
荧光团稳定性和光漂白 
荧光测量...

遗传信息通过mRNA从DNA传递到蛋白质的过程是一种复杂的生化过程，细胞内大分子相互作用在各个水平上对其进行精确调控。在翻译调控中，RNA-蛋白质相互作用对于快速响应各种刺激和信号具有关键作用1,2。某些RNA-蛋白质相互作用影响mRNA的稳定性，从而改变RNA处于可翻译状态的时间。另一些RNA-蛋白质相互作用则与重编码机制相关，例如终止密码子通读、跳跃翻译或程序性核糖体移码（PRF）3,4,5,6,7。最近研究表明，多种RNA结合蛋白（RBPs）能够与刺激性mRNA元件及翻译机制相互作用，决定细胞内重编码发生的时间和程度7,8,9,10,11。因此，要深入解析RNA结合蛋白在翻译过程中的作用及其对RNA结构与稳定性的调控机制，关键在于详细研究这些RNA-蛋白质复合物的相互作用原理和力学特性。
数十年的研究工作为探索翻译这一多步骤、多组分的过程奠定了基础，该过程依赖于翻译机制中RNA与蛋白质组分之间复杂的相互作用，以实现高效性和准确性12,13,14理解复杂调控事件的一个关键下一步是高精度地确定翻译过程中的作用力、时间尺度和结构决定因素12,15,16,17RNA 构象动力学的研究，尤其是其如何 转单分子工具（包括光镊和零模波导）的出现，进一步阐明了在翻译过程中作用于RNA结构的辅助因子的功能机制。16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26.
光镊（OT）是一种高精度的单分子技术，已被用于研究多种依赖RNA的动态过程，包括转录和翻译26,27,28,29,30,31,32。光镊技术的应用使得研究人员能够详细探究这些过程中的分子相互作用、核酸结构以及热力学性质、动力学和能量学特征16,17,22,33,34,35,36,37,38,39。光镊实验基于聚焦激光束对微小物体的捕获原理。在典型的光镊实验中，目标分子被连接在两个透明（通常为聚苯乙烯）微球之间（图1A）27。这些微球随后被光阱捕获，光阱的作用类似于弹簧。因此，可通过测量微球相对于聚焦激光束中心（即光阱中心）的位移来计算施加在分子上的力。近年来，光镊已与共聚焦显微镜结合（图1B），实现了荧光或荧光共振能量转移（FRET）的检测40,41,42。这一结合开辟了全新的实验领域，使力谱学与荧光数据能够同时测量，从而实现精确关联分析。
在此，我们展示了利用光镊结合共聚焦显微镜研究调控翻译移码的蛋白质-RNA相互作用的实验方法。在物镜和聚光镜之间，一个具有五个通道的流动池可实现连续的样品施加，并形成层流。通过微流控通道，可直接注入多种组分，这不仅减少了操作时间，而且在整个实验过程中显著降低了样品消耗量。
首先，提出了一项用于指导光镊（OT）实验设计的基本准则，并讨论了不同实验装置的优势与潜在问题。接着，描述了样品的制备方法与实验操作流程，并提供了数据分析的详细方案。为举例说明，我们概述了通过RNA拉伸实验获得的结果，用于研究SARS-CoV-2核糖体移码RNA元件（图2A）与 转-作用因子锌指抗病毒蛋白（ZAP）的短亚型，可改变病毒RNA在替代阅读框中的翻译43此外，本文还展示了荧光标记的核糖体可用于该光镊共聚焦联用实验，这将有助于监测翻译机器的持续性和速度。本文所介绍的方法可用于快速测试不同缓冲液、配体或其他细胞组分对翻译过程各方面的效应。最后，讨论了常见的实验陷阱及其解决方案。以下概述了实验设计中的一些关键要点。
构建体设计 
原则上，有两种常用方法可构建适用于光镊（OT）的RNA构建体。第一种方法采用一条长RNA分子，通过与互补的DNA手柄杂交，形成包含两个RNA/DNA杂交区域、中间夹有单链RNA序列的结构（图2B）。该方法已被广泛应用于大多数光镊RNA实验中33,44,45。
第二种方法利用带有短（约20 nt）突出端的双链DNA手柄15,17。这些突出端随后与RNA分子杂交。尽管该方法在设计上较为复杂，但使用双链DNA手柄克服了DNA/RNA杂合系统的某些局限性。理论上，甚至可以使用非常长的手柄（&#62;10 kb），这更便于共聚焦测量。此外，RNA分子可通过连接至DNA手柄以增强拴系的稳定性。
末端标记策略 
必须通过强分子相互作用将构建体固定在微珠上。尽管已有将手柄共价连接至微珠的方法46，但在光镊实验中通常采用强但非共价的相互作用，例如链霉亲和素-生物素和地高辛-抗体系统15,33,35,45。在本方案中，构建体被标记上生物素或地高辛，相应地，微珠则包被链霉亲和素或抗地高辛抗体（图1A）。该方法适用于施加最高约60 pN（每根连接）的力47。此外，采用不同的5'端和3'端标记策略，可确定微珠之间形成的连接链的方向17。
用于荧光测量的蛋白质标记 
在共聚焦成像中，有几种常用的荧光标记方法。例如，荧光团可通过反应性有机基团共价连接到蛋白质中天然存在的氨基酸残基上，或通过定点突变引入的残基上。硫醇反应性染料和胺反应性染料可分别用于标记半胱氨酸和赖氨酸残基。已有多种可逆保护方法可用于提高标记的特异性48,49，但通常情况下，天然蛋白质会在多个残基位点被标记。尽管荧光团分子较小可能具有优势，但非特异性标记可能干扰蛋白质活性，从而导致信号强度发生变化49。此外，信号强度还可能因标记效率的不同而在各次实验之间存在差异。因此，在实验前应进行活性检测。
如果目标蛋白含有N端或C端标签（如His标签或Strep标签），则对这些标签进行特异性标记是另一种常用的方法。此外，针对标签的标记可降低荧光染料干扰蛋白活性的可能性，并可能提高蛋白的溶解度49。然而，标签特异性标记通常只能实现单荧光染料标记蛋白，这可能在检测上存在挑战。另一种实现特异性标记的方法是使用抗体。
微流控装置 
光镊技术与微流控系统的结合可实现不同实验条件之间的快速切换。此外，现有系统利用流体在流动池内保持层流状态，可防止液体在垂直于流动方向上的不同通道之间混合。因此，层流特性对实验设计尤为有利。目前通常使用具有多达5个通道的流动池（图3）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 HB101</td><td>实验室合集</td><td>N/A</td><td>载体的克隆</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品和酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>罗氏</td><td>11093070910</td><td>生物素标记</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>氧气清除系统</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>牛胰腺来源的DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>体外转录</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>氧气清除系统</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>氧气清除系统</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>卡尔·罗斯</td><td>HN78.3</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>卡尔·罗斯</td><td>2189.1</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>Phusion DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Gibson 组装，克隆</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>默克</td><td>529552-1KG</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA聚合酶</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>焦磷酸酶，耐热型，无机</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>体外转录</td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Molox</td><td>1000379515</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>rNTPs</td><td>life technologies</td><td>R0481</td><td>体外转录</td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>漂白剂失活</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>共聚焦测量</td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>生物素标记</td></tr><tr><td>T5核酸外切酶</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Gibson 组装，克隆</td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>自行生产</td><td>N/A</td><td>体外转录</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq连接酶</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Gibson 组装，克隆</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monolith 蛋白质标记试剂盒 RED-NHS 第二代（胺反应性）</td><td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>用于核糖体标记</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>用于标记的核糖体</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;寡核苷酸&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' 手柄 T7 正向引物</td><td>Microsynth</td><td>定制订单</td><td>5&amp;rsquo; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC&lt;br/&gt; CTTTCTGTGGACGCC - 3&amp;rsquo;用于在PCR 1中体外转录生成光镊实验模板</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; 处理逆转</td><td>Microsynth</td><td>定制订单</td><td>5' -&amp;nbsp; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3'，用于在PCR1中生成光镊体外转录模板</td></tr><tr><td>5' 手柄正向引物</td><td>Microsynth</td><td>定制订单</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3'，用于在PCR 2中生成5'接头</td></tr><tr><td>5&amp;rsquo; 处理逆转</td><td>Microsynth</td><td>定制订单</td><td>5&amp;rsquo; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA&lt;br/&gt; TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&amp;rsquo;，用于在PCR 2中生成5'接头</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; 处理正向</td><td>Microsynth</td><td>定制订单</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC&lt;br/&gt; AG - 3'，用于在PCR 3中生成3'接头</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo; 反向手柄 5&amp;rsquo;用地高辛标记</td><td>Microsynth</td><td>定制订单</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3'，用于在PCR 3中生成3'接头</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DNA 载体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMZ_OT</td><td>自行制备</td><td>N/A</td><td>进一步描述见 &quot;Cardiovirus 2A 蛋白的结构研究揭示了 RNA 识别与翻译调控的分子基础&quot;&lt;br/&gt; Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley&lt;br/&gt; bioRxiv 2020.08.11.245035；doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与算法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>原子</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>POTATO</td><td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNA结构</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>斯派德</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的聚苯乙烯微粒，1.5–1.9 &amp;micro;m，5 ml，1.0%（w/v）</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛包被的聚苯乙烯微粒，2.0-2.4 &amp;micro;m, 2 ml, 0.1% w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&amp;nbsp;共聚焦显微镜耦合的光镊</td></tr></tbody></table>

利用光镊研究翻译调控中的rna-蛋白质相互作用

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA 采用多种多样的结构折叠形式，这些结构对其功能至关重要，因而能够影响细胞内的多种过程。此外，RNA 的结构和功能可受到多种反式作用因子的调控，例如蛋白质、代谢物或其他 RNA。例如，移码 RNA 分子是一类位于编码区的调控性 RNA，可引导正在翻译的核糖体进入替代的开放阅读框，从而发挥基因开关的作用。这些 RNA 在与蛋白质或其他反式作用因子结合后，也可能形成不同的折叠构象。为了深入解析 RNA 结合蛋白在翻译过程中的作用及其对 RNA 结构与稳定性的调控机制，同时研究这些 RNA-蛋白质复合物之间的相互作用及其力学特性显得尤为关键。&#160;本研究展示了如何利用单分子荧光耦合光镊技术，以高分辨率探究 RNA-蛋白质复合物的构象变化及热力学特征。以 SARS-CoV-2 程序性核糖体移码元件与锌指抗病毒蛋白短亚型这一反式作用因子的相互作用为例进行了详细阐述。此外，通过共聚焦单元对荧光标记的核糖体进行实时监测，最终有望实现对翻译延伸过程的研究。这种荧光耦合光镊检测方法可广泛应用于探索多种调控翻译的 RNA-蛋白质复合物或反式作用因子，有助于推动基于 RNA 的基因调控研究。

本节主要介绍利用荧光光镊测量RNA-蛋白质/配体相互作用的方法。有关常规RNA光镊实验及其代表性结果的描述，请参见32。关于RNA/DNA-蛋白质相互作用的更详细讨论，还可参见1,2,26,59,60。
原则上，RBP 或任何其他分子的结合 转录-作用的目标因子对RNA可起到稳定、去稳定作用，或可能改变分子的构象。以下展示了每种效应对应的机械可观测参数。然而，特定RNA-蛋白质复合物所表现出的实际效应并不局限于上述几种情况。
稳定化 
RNA 结构可被蛋白质或其他配体特异性识别并结合<sup clas...

本方案介绍了一种利用光镊研究RNA-蛋白质相互作用的完整实验流程。文中概述了多种可能的实验装置，包括光镊与共聚焦显微镜联用的设置。

利用光镊研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

RNA 采用多种多样的结构折叠形式，这些结构对其功能至关重要，因而能够影响细胞内的多种生物学过程。此外，……

以下方法文章的总体目标是展示一种利用与共聚焦显微镜联用的光镊技术来研究RNA与蛋白质或其他因子相互作用的实验方案。在过去十年中，已开发出多种复杂技术用于研究单个大分子的特性，其中一种技术便是单分子光镊技术。利用新型荧光辅助光镊技术，不仅可以详细监测RNA分子解折叠所需的力，还能详细观察翻译过程中的结合事件。本文重点介绍在有或无调控翻译的反式作用因子存在下拉伸RNA分子的测量方法。我们还展示了如何应用该技术通过标记的核糖体来监测翻译过程。本方案将由我团队中的两名研究生Lukas Pekarek和Stefan Park进行演示。在本视频中，我们将指导您完成光镊实验的搭建与操作过程，并概述简单的数据分析流程。该技术的优势在于其操作简便且结果可靠。将一个分子连接在两个微珠之间，并用激光束焦点固定，即可在所谓的力斜坡实验中精确测量位移引起的变化和受力情况。连接分子内部的二级结构会根据分子内部能量的不同，在特定的力作用下发生解折叠。通过恒定力测量可进一步研究多种结构之间的动态转变。此外，结合使用荧光成像技术可实时观察结合事件。在潜在反式作用因子结合并影响其稳定性后，膜纳米管独特的力-距离曲线可能会发生变化。首先，需要将目标 RNA 克隆到 DNA 载体中。在该序列的上游和下游，还需添加额外的片段，即用于将最终的 DNA-RNA 构建体固定在微珠之间的接头。在成功完成质粒的克隆与扩增后，需进行三种不同的 PCR 反应。每个PCR反应中，按照方案中的表一混合试剂。在合适的PCR仪中，以50微升的反应体系进行PCR扩增。第一个反应将获得包含T7启动子的完整构建体的双链DNA，用于后续的体外转录。第二次PCR产生5'端接头，而上一次反应则产生3'端接头。5'端和3'端接头均需根据所使用的磁珠进行标记。通过使用地高辛标记的反向引物，在PCR过程中对3'端手柄进行标记，而5'端手柄则需要通过生物素化在额外的步骤中进行标记。5'端手柄的3'端生物素化使用T 40和一种聚合酶完成，反应在室温下进行一至两小时。接下来，使用T7聚合酶进行体外转录。根据RNA的长度，将反应在37摄氏度下孵育两到四个小时。最后一步，将手柄序列与体外转录得到的RNA退火，以获得最终的DNA-RNA嵌合结构，其中双链手柄之间包含目标单链区域。为了退火所需的RNA-DNA杂交体，将接头与RNA在退火缓冲液中混合。将退火混合物加热至85摄氏度，持续10分钟，然后缓慢冷却至4摄氏度。向退火后的样品中加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠和三倍体积的预冷乙醇，于-80摄氏度孵育至少1小时。将样品在4 °C条件下以15,000 ×g离心30分钟。弃去上清液，并在真空下干燥沉淀。将重悬沉淀的小份样品在液氮中速冻，然后于-80 °C保存直至使用。首先将注射器中的漂白剂排出，并加入1 mL无RNase水。加入50微升0.5摩尔的硫代硫酸钠，用1 bar压力冲洗系统。注意确保微流控系统始终不干燥，以避免系统中产生气泡。接下来，弃去剩余的硫代硫酸钠溶液，并更换新的注射器。然后用至少 0.5 mL 无 RNase 水再次清洗。为搭建仪器的光学系统，向物镜上滴加两滴浸油。将流动池放置到位，并升起物镜，直至液体接触流动池。然后在流动池顶部滴加两滴浸油。现在打开光阱 steering 装置和捕获激光器。使用设备诊断摄像头的Z轴查找工具调节物镜。通过旋转微调螺丝，将Z轴调整至第二和第三反射面之间的腔室中点位置，此处折射环最大。将诊断相机切换至月球模式，并将捕获激光降低至约50%。然后降低聚光镜并调节其位置，使观察到约10条光带。测量室具有五个通道，在实验前应考虑不同的设置方案。对于简单的力-斜坡实验，珠-缓冲液-珠是一种方便的通道排列方式。对于第四种化合物的检测，例如荧光标记的核糖体或反式作用因子，采用 beads-beads-buffer 方式更为合适，但这会增加捕获磁珠的难度。将退火后的构建物取适量，与 3 µL AD 磁珠悬浮液、1 µL RNase 抑制剂以及 8 µL 检测缓冲液在室温下孵育 10 至 20 分钟。随后将样品用 500 µL 检测缓冲液稀释，并加入相应的检测通道中。对于第二种微珠，将0.8微升检测微珠与1毫升检测缓冲液混合后加入相应的通道中。打开通道并用低压清洗。现在开启捕获激光。为了捕获微珠，将激光束相互分开，并在捕获阱一中捕获一个 AD 微珠。接着将载物台移动至 SA 微珠通道，并在捕获阱二中捕获一个微珠。为避免丢失微珠或在同一捕获阱中捕获第二个微珠，需将载物台移至缓冲液通道，并关闭所有通道。在缓冲液中进行捕获校准。被捕获的微球应设为后续测量的可视化模板，且各次测量间的相似性评分应保持在90%以上，以确保可比性。最后，将微珠相互靠近，即可开始捕获单根DNA拖带。操作时，先将微珠靠近数秒，然后缓慢地再次分开。当形成拖带时，随着两颗微珠被拉离彼此，所测得的力会增加。可通过寻找拉伸平台期，并将轨迹与自由连接链或蠕虫状链模型进行比较，来检查拴系分子的数量和质量。对于单个拴系分子，拉伸平台期应在 50 至 60 皮牛顿之间。进行荧光测量时，需打开共聚焦激光器、光子计数单元以及光镊设备。随后，打开所需波长的激发激光器及软件界面，并根据荧光染料的类型将激光功率设置为5%或更高。现在可使用软件的成像或明场图像函数开始成像。为了获得清晰聚焦的图像，务必确保共聚焦显微镜的焦平面与光镊的焦平面对齐。为此，可利用聚苯乙烯微球在蓝色激光通道中的自发荧光。上下移动光镊的焦平面，直至微球的自发荧光直径达到最大。在此位置，可检测到由被固定的分子产生的荧光信号。对于这两种功能，选择适当的感兴趣区域都非常重要。在整个测量过程中，可通过将微珠移动到不同的通道，或改变微流控系统中供给的缓冲液，来轻松改变缓冲液的组成。为避免光漂白，测量间歇应始终关闭激发激光器。设备输出的原始数据通常包含大量噪声。因此，为了进一步分析散射数据，必须首先对数据进行预处理。第一步是使用低通巴特沃斯滤波器对数据进行降采样和滤波，已获得良好的效果。对于力- ramp 实验，必须在第一个距离曲线的相应折叠和非折叠区域标记解折叠事件，然后可使用蠕虫状链或自由连接链模型进行拟合。对于恒定力数据，可绘制随时间变化的距离曲线，并生成直方图以量化在给定力下占主导的构象。此处表明，滤波参数对于区分不同的折叠状态至关重要。为了更好地理解该技术可实现的效果，以下展示一些代表性结果。这是一条来自力-递增实验的标准力-距离曲线。本例中，我们研究了严重急性呼吸综合征冠状病毒2的移码元件。我们在约15皮牛顿的力下观察到多步解折叠过程。当方向反转、磁珠再次靠近时，分子链在略低的力下重新折叠。当我们测量存在锌指抗病毒蛋白ZAP时的相同RNA，观察到类似的解折叠模式。但RNA的二级结构并未重新折叠。这是一个很好的例子，说明蛋白质结合对RNA动力学具有显著影响。通过分析恒定力数据，可以进一步研究其解折叠动力学。将不同作用力下的距离随时间变化绘制成图，并在右侧添加不同观测状态的直方图。在10皮牛顿时，RNA完全处于折叠状态；在11.5皮牛顿时，RNA在不同状态之间切换；而在13皮牛顿时，RNA则永久处于展开状态。然而，当测量SARS-冠状病毒-2的移码元件与ZAP结合时，RNA在11皮牛顿时完全处于解折叠状态，甚至在10皮牛顿时也几乎未出现向折叠状态转变的迹象。这表明ZAP结合于单链的移码元件，并阻止了二级结构的形成。最后，我们将分析一些结合共聚焦显微镜的光镊实验数据。在本实验中，使用了一种可非特异性结合双链核酸且结合强度逐渐增强的荧光染料。动态图像显示，当微珠被逐渐拉远时，荧光强度随之增加；而当连接的分子被过度拉伸并断裂后，荧光则完全消失。在最后一幅图中，通过第四通道加入了荧光标记的核糖体。在本实验中，观察到核糖体特异性结合到RNA系链上。希望本视频使您了解了光镊技术以及利用这一强大技术所能开展的研究工作。

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光学镊子研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

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利用光镊研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

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