Name: 处理技巧，以减轻老鼠的压力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习3D操作技术以减少小鼠的焦虑样行为并改善动物福利。该方法通过渐进式互动降低应激反应，提高实验数据的可重复性，适用于神经科学和精神病学研究。

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作者感谢CAMH动物护理委员会对本工作的支持，以及CAMH的动物护理人员，他们就该操作的实用性提供了大量反馈意见，推动了所述实验的实施，并促使本详细方案提交供其他用户使用。本工作部分由授予TP的CAMH BreakThrough挑战基金以及CAMH的内部资金资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究及方法开发基于以下观察：小鼠的操作技术目前仍被科学界忽视，一些实验室仍不愿意在实验前采用适应性训练或操作技术来降低动物的应激反应和过度敏感性。尽管动物操作需要投入一定时间，但它对动物具有积极影响，有助于提高后续实验的成功率，并避免因数据变异性或动物过度反应而导致实验需重复进行。采用3D操作技术可减少小鼠的逃脱尝试。在我们6月龄的雄性小鼠中，该技术还增加了其与实验人员的互动，并减少了类似焦虑的行为表型。此外，在仅经过最初3天的操作后，3D操作技术即可降低2.5月龄雌性小鼠的数据变异性及其皮质酮水平。该方法依赖于轻柔的操作方式，使小鼠逐步适应实验人员的接触，从而实现更顺畅的转移和更便捷的干预操作。
从三维操作技术中值得强调的一点是，操作方法的逐步推进应根据小鼠的反应性而定，具体取决于上述内容及表1中所述各阶段目标的达成情况。动物在进入下一步操作之前，应已对当前操作步骤表现出较低的反应性。若对尚未充分适应的小鼠过早推进至&#34;遮蔽&#34;或&#34;鼻触&#34;步骤，可能会导致应激反应增加，进而降低该操作程序的有效性。同样，在每次操作过程中...

小鼠和大鼠是多种目的临床前研究中的重要资源1,2，包括内分泌、生理、药理或行为学研究2。随着涉及动物的研究数量不断增加，人们发现包括人类互动在内的未受控环境变量会影响生物医学研究的多种结果3,4,5。这导致不同实验和研究实验室之间出现显著的变异性4,5，成为动物研究中的一个主要隐患。
已采用多种方法以期限制环境应激源的影响并降低动物对人类互动的反应性。例如，为减少环境应激源的影响，可对饲养条件进行标准化，并采用自动化饲养系统。6,7 已在各实验室中实施。在涉及与人类互动方面，常用的动物抓取和运输方法很少考虑动物的不适和应激反应。例如，通过尾巴抓取动物或使用镊子8 增加基线焦虑水平9,10,11，减少探索行为9,12 并对研究内部及研究之间的个体间差异具有重要影响13,14因此，其他方法被相继开发出来，例如 杯具操作 技术，适用于小鼠和大鼠。在此方法中，动物被 &#34;凹陷的&#34; 从笼子中取出，并由实验人员用手掌呈杯状握住9,10,11另一种有用的替代尾部抓取的方法是使用聚碳酸酯隧道来转移小鼠9,10,15该方法避免了小鼠与实验人员之间的直接接触。杯式和隧道式操作方法均能有效减少焦虑样行为以及因厌恶性抓取技术（如抓尾法）可能加剧的对实验人员的恐惧。9,10.
因此，越来越多的证据表明，正确的实验小鼠操作方法有助于减少个体间的差异性9,11，并改善动物福利10。然而，上述技术仍存在一定的局限性。杯式操作法的实施周期从10天（2周内进行10次操作16）到长达15周不等17，这对于动物设施工作人员和实验人员而言耗时较长。此外，杯式操作的效果因品系而异9，且在开放手掌中进行常规杯式操作时，未经训练的小鼠或特别易跳跃的品系可能会从小鼠手中跳脱9,18。相比之下，隧道操作法在温和驯化方面通常能获得更一致且更快的效果19。隧道还可作为笼内环境丰富化装置，有助于动物快速适应操作，并提供额外的丰富化益处。然而，隧道操作在将动物转移至不同实验装置时存在一定限制。有趣的是，Hurst 和 West9 以及 Henderson 等人20 证明，采用轻柔且短暂的手动操作将动物从隧道转移至实验装置，不会影响其表型。
为了提供一种可在较短时间内实现有效适应的替代方法，本文介绍了一种基于杯式抓握技术的创新方法，因此无需使用特殊设备。该方法通过设定关键阶段来评估小鼠对抓握操作的适应程度。该技术在降低小鼠应激反应和压力（包括行为学和激素水平）方面具有显著效果，有助于日常操作，并有助于减少个体间的差异。本文详细阐述了该技术的具体操作步骤，并通过两项独立研究（针对雄性和雌性小鼠）证明了其在减少焦虑样行为、改善与实验人员互动以及抑制外周应激激素（皮质酮）释放方面的有效性，同时与隧道抓握法（阳性对照）和尾部抓握法（阴性对照）进行了比较。

<table><tbody><tr><td>23 G x 1 英寸 BD PrecisionGlide 普通用途无菌皮下注射针头。普通管壁类型和普通斜面。</td><td>BD</td><td>2546-CABD305145</td><td>用于血液采集的针头</td></tr><tr><td>BD Vacutainer&amp;reg; 静脉血采集 EDTA 管，带紫色 BD Hemogard&amp;trade; 盖，2.0 ml（13 x 75 mm），每包 100 支</td><td>BD</td><td>367841</td><td>用于血液采集的 EDTA 涂层管</td></tr><tr><td>Bed&amp;rsquo;o cobs &amp;frac14;&amp;rdquo; 玉米芯实验室动物垫料</td><td>Bed-O-Cobs</td><td>BEDO1/4</td><td>用于新奇抑制摄食实验的新型垫料</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5424 R</td><td>用于血液离心</td></tr><tr><td>皮质酮 ELISA 试剂盒</td><td>Arbor Assays</td><td>K003-H1W</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Panasonic</td><td>HC-V770</td><td>用于记录高架十字迷宫/实验者交互行为</td></tr><tr><td>高架十字迷宫</td><td>自制</td><td>n/a</td><td>定制迷宫，由四个黑色聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）臂组成（两个开放臂（29 cm 长 × 7 cm 宽）和两个封闭臂（29 cm 长 × 7 cm 宽，带 16 cm 高侧壁）），呈十字形排列，两个开放臂相对，整体离地 55 cm</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Medstore 自有品牌</td><td>39753-P016-EA95</td><td>用蒸馏水稀释至 70%，用于清洁</td></tr><tr><td>Ethovision XT 15</td><td>Noldus</td><td>n/a</td><td>自动化动物追踪软件</td></tr><tr><td>实验室啮齿动物饲料</td><td>LabDiet</td><td>啮齿动物饲料 5001</td><td>标准啮齿动物饲料</td></tr><tr><td>存储卡</td><td>Kingston Technology</td><td>SDA3/64GB</td><td>用于视频录制和文件传输</td></tr><tr><td>新奇抑制摄食实验箱</td><td>自制</td><td>n/a</td><td>定制透明聚甲基丙烯酸甲酯实验箱，底部和侧壁透明，尺寸为长 62 cm、宽 31 cm、高 40 cm</td></tr><tr><td>聚碳酸酯管</td><td>自制</td><td>n/a</td><td>长 13 cm，直径 5 cm</td></tr><tr><td>Purina Yesterday&amp;rsquo;s News 再生纸屑垫料</td><td>Purina</td><td>n/a</td><td>标准垫料</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biotek</td><td>Epoch 微孔板读板仪</td><td></td></tr></tbody></table>

减少小鼠应激的处理技术

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

实验动物会经历科学家或动物护理人员的多次操作。这些操作所引发的压力可能对&#160;动物福利产生深远影响，同时也可能成为焦虑等实验变量的混杂因素。多年来，人们已开发出多种旨在减少操作相关压力的抓取技术，但这些研究主要集中在大鼠，对小鼠的关注较少。然而，已有研究表明，通过适当的抓取技术，可以使小鼠逐步适应人为操作。使小鼠习惯于被抓取能够减轻其压力，便于日常操作，改善动物福利，降低数据变异性，并提高实验的可靠性。尽管温和抓取具有诸多益处，但目前仍广泛使用特别容易引发应激的提尾抓取法。本文详细介绍并演示了一种新开发的小鼠抓取技术，旨在最大限度地减少动物在与人类互动过程中所经历的压力。该手动操作技术需持续3天（简称3D抓取技术），重点在于促进动物对实验人员的适应能力。本研究还比较了既往建立的隧道抓取技术（使用聚碳酸酯隧道）和提尾抓取技术的效果，具体评估了这些方法对类焦虑行为（通过高架十字迷宫和新奇抑制摄食行为学测试）、小鼠与实验人员的自发互动行为以及生理指标（皮质酮水平）的影响。结果显示，3D抓取技术和隧道抓取技术均可减少类焦虑表型。在第一项实验中，使用6月龄雄性小鼠，3D抓取技术显著改善了小鼠与实验人员的互动行为；在第二项实验中，使用2.5月龄雌性小鼠，该技术降低了皮质酮水平。因此，3D抓取技术适用于需要或倾向于与实验人员进行互动的实验场景，或在实验过程中无法使用隧道抓取的情况。

分别对C57BL/6小鼠开展了两项独立研究。研究#1包括来自杰克逊实验室（货号：000664）的6月龄雄性小鼠，研究#2包括同来源的2.5月龄雌性小鼠（每项研究N=36）。小鼠在2月龄时抵达实验动物设施。研究#2的雌性小鼠在到达后两周即开始进行操作与测试，而研究#1的雄性小鼠由于全球大流行导致的实验室关闭，延迟至6月龄时才开始操作与测试。在此期间，研究#2中有一只小鼠在开始操作实验前死亡。研究#1的雄性小鼠由动物设施工作人员负责饲养。所有小鼠均维持在12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间：7:00，关闭时间：19:00）条件下，自由获取食物和水 随意摄取它们的笼舍中填充了再生报纸作为垫料，同时也用作筑巢材料。小鼠被单独饲养，以限制群养雄性在操作过程或采血、行为学测试等实验操作后可能出现的攻击性行为。小鼠被随机分为三组： 尾部抓取，隧道式抓取 和 3D操作，并根据各自分组的设计在开放房间内进行处理（图2）。隧道管养组在开始抓取操作前1周先接触隧道作为环境丰容。随后，在行为学测试前连续10天进行抓取操作。不同抓取操作结束后...

本文介绍了一种在小鼠中应用的操作技术——3D操作技术，该技术通过减少类似焦虑的行为来促进常规操作，并详细描述了两种现有的相关技术（隧道操作和尾部操作）。

实验动物会接受科研人员或动物护理人员的多种操作。这些操作所引发的压力可能产生深远影响……

我叫 Dr. Thomas Prevot。我是成瘾与心理健康中心（CAMH）的科学家，同时也是多伦多大学精神病学系的助理教授。我的研究团队特别关注降低小鼠的基础焦虑水平和应激反应，以减少数据变异性并改善动物福利。小鼠在基础科学和临床前研究中已被证明是不可或缺的重要资源，然而，全球极少有实验室会控制实验动物的基础焦虑水平及其应激反应性，从而导致不同实验室之间的数据重复性受到严重影响。影响基础焦虑水平的一个主要因素是未加控制的环境变量，例如饲养条件、环境丰富度以及应激暴露。尽管标准化饲养条件和环境丰富化措施已在一定程度上改善了这一问题，但实验人员与小鼠互动过程中所引发的应激暴露仍未得到充分关注。抓尾操作，即通过尾巴提起小鼠的方法，尽管会给小鼠带来显著应激，目前仍是广泛使用的小鼠操作技术。尽管已出现多种替代方法，包括使用转移隧道和手捧法，但这些技术的推广应用仍较为缓慢。本文介绍了一种类似于杯式抓取的新技术，该技术仅需三天的适应期即可实施，因此称为3D抓取法。通过逐步增加与小鼠互动的程度和复杂性，并根据小鼠对特定抓取节点的反应进行调整，我们能够降低其应激水平，从而促进日常操作。我们通过行为学实验评估了3D抓取法在小鼠中的有效性，检测了类似焦虑的行为、与实验人员的互动情况以及外周应激激素皮质酮的水平，并将其与隧道抓取法和尾部抓取法进行了比较。轻轻打开笼子，将笼盖放在一侧。在尝试抓取小鼠之前，先将戴着手套的手放入饲养笼中。让小鼠适应手的存在约30秒。然后尝试用手掌轻轻捧起小鼠。如果小鼠不易被捧起，可将双手合拢，用双手引导小鼠移动至笼子的角落，再用双手将其捧起。将小鼠从笼子中取出后，尽量保持双手平展且张开。让小鼠自由探索。这为小鼠提供了平坦的站立平台，并降低被咬伤的风险。将手张开并放平，掌心向上。将另一只手放在小鼠旁边，让小鼠能够在双手之间自由移动，不要施加任何限制。用平展的手掌操作一分钟后，放松手掌，轻轻将小鼠拢成杯状握于手中，然后轻柔地在双手之间滚动小鼠。持续四分钟，交替进行双手间的轻柔滚动和在张开的双手间自由探索。在最后两分钟内，进行庇护测试：让小鼠移动到手的边缘，然后将两只手合拢。非常缓慢地将双手拢成杯状，使小鼠能处于双手形成的遮蔽空间内。注意留出开口，以便小鼠在需要时可以逃脱。尽量在不施加任何约束的情况下，让小鼠在该遮蔽空间内停留5到10秒。在最后两分钟内重复进行3到4次躲避测试。不要急于完成该过程。如果小鼠因被限制在手中而表现出应激反应，则继续用手掌间滚动和自由探索30秒，然后再次尝试躲避测试。让小鼠自由探索30秒，然后轻轻将其放回笼中。使用70%乙醇或适当的清洁溶液清理台面上的粪便和尿液。根据需要清洁手套上的粪便和尿液，更换新笼子时，用70%乙醇冲洗手套或更换手套。到第二天，应已可将小鼠用手掌捧出笼子。如果小鼠表现出较明显的反应性，可让其在手掌平放的状态下自由探索开放空间30秒至1分钟。否则，直接进行双手间翻转及庇护测试。从第一天开始，将手与躲避装置之间的适应步骤重复进行两到三分钟，每个步骤重复数次。如果小鼠在躲避测试中表现得较为放松，可尝试抚摸其背部和头部。如果小鼠未试图逃避接触，则进行鼻触测试。轻轻触碰小鼠鼻尖。若其未出现啃咬或试图转头的行为，则表明适应良好。进行抚摸和鼻触测试时，不要急于求成。如果小鼠因被手束缚而表现出应激反应，或不愿被触碰，可继续用手掌间滚动安抚数分钟后再尝试。若动物对躲避处、头部抚摸和鼻触反应良好，约三分钟的操作后即可停止本次操作。如果动物表现出愿意探索你的双手，且无任何应激迹象（例如试图逃跑、从手中跳下或回避与手的接触），则可继续操作。如果小鼠持续表现出应激反应，或对庇护测试或鼻触测试反应不佳，则应继续该次训练，直至达到五分钟，与第一天相同。随后将小鼠放回其笼中，并清洁实验台面和手套。第三天，重复第二天的相同步骤。用手掌拿起小鼠，将小鼠在双手之间转移。用手掌轻轻固定小鼠。如果小鼠对这些步骤反应良好，可尝试抚摸小鼠并进行鼻触测试。到第三天时，小鼠应已足够放松，能够安静地停留在手掌中而不移动，此时您应能在大约两到三分钟内顺利完成这些步骤。将小鼠放回笼中，并清洁实验台面和手套。第三天，如果动物因实验需要进行束缚处理，例如口服灌胃或腹腔注射，可对小鼠实施颈背部捏压测试。用拇指和食指捏住小鼠颈背部，将其提起至手上方约五厘米处，保持两到三秒钟。此姿势对成年小鼠通常不太舒适，若小鼠几乎保持不动，则表明其已良好适应抓握操作，后续注射时易于固定。随后将小鼠放回手掌平面，使其自由活动一分钟。通过实验评估了动物自愿与实验人员互动的意愿以及在实验环境中的易操作性。在研究一中，采用管式抓取或3D抓取方式处理的小鼠，当实验人员试图抓取时，逃跑的可能性较低。此外，使用3D抓取法处理的小鼠在实验人员手所在象限停留的时间更长，表明其更愿意与实验人员互动。在研究二中，与抓尾法处理的小鼠相比，采用管式处理或3D处理的小鼠在实验人员试图抓取时更不容易逃跑。然而，在研究二中，处理方法对小鼠停留在实验人员手所在象限的时间无显著影响。在两项评估类似焦虑行为的实验——新奇环境抑制摄食实验和高架十字迷宫实验中，比较了3D处理和隧道处理与抓尾法处理的效果。在第一项研究中，新奇抑制摄食实验显示，使用管状抓握和3D抓握方式处理的小鼠表现出焦虑程度降低的趋势。在高架十字迷宫实验中，抓握方式的总体处理效应不显著。当以Z分数进行汇总时，与尾部抓握小鼠相比，管状抓握和3D抓握小鼠的总体焦虑水平显著降低。在研究二中，新奇抑制摄食实验和高架十字迷宫实验中的焦虑指标均未显示出操作方式的整体影响。当以Z分数进行汇总时，操作技术对焦虑水平无总体影响。作为应激的生理学指标，我们在短暂操作后15分钟采集了尾部抓握、三维抓握和隧道抓握小鼠的血清，并检测了皮质酮水平。在研究一中，操作方式未产生总体效应。在研究二中，与抓尾操作相比，三维操作显著降低了小鼠的皮质酮水平。鉴于观察到小鼠操作技术在科学界尚未被广泛认知，我们描述了一种新型操作技术的应用。在所展示的两项研究中，使用鼠道和三维抓取方式减少了小鼠被捉拿时的逃跑尝试，可能有助于常规操作。此外，在老年雄性小鼠中，该技术降低了类似焦虑的行为，并增加了与实验人员的互动。在年轻雌性小鼠中亦观察到类似趋势。该技术降低了因操作处理所引起的小鼠皮质酮水平。采用该技术有望减少数据变异，改善动物福利，并促进日常操作处理。

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