减少小鼠应激的处理技术

我叫 Dr. Thomas Prevot。我是成瘾与心理健康中心（CAMH）的科学家，同时也是多伦多大学精神病学系的助理教授。我的研究团队特别关注降低小鼠的基础焦虑水平和应激反应，以减少数据变异性并改善动物福利。

小鼠在基础科学和临床前研究中已被证明是不可或缺的重要资源，然而，全球极少有实验室会控制实验动物的基础焦虑水平及其应激反应性，从而导致不同实验室之间的数据重复性受到严重影响。影响基础焦虑水平的一个主要因素是未加控制的环境变量，例如饲养条件、环境丰富度以及应激暴露。尽管标准化饲养条件和环境丰富化措施已在一定程度上改善了这一问题，但实验人员与小鼠互动过程中所引发的应激暴露仍未得到充分关注。

抓尾操作，即通过尾巴提起小鼠的方法，尽管会给小鼠带来显著应激，目前仍是广泛使用的小鼠操作技术。尽管已出现多种替代方法，包括使用转移隧道和手捧法，但这些技术的推广应用仍较为缓慢。

本文介绍了一种类似于杯式抓取的新技术，该技术仅需三天的适应期即可实施，因此称为3D抓取法。通过逐步增加与小鼠互动的程度和复杂性，并根据小鼠对特定抓取节点的反应进行调整，我们能够降低其应激水平，从而促进日常操作。我们通过行为学实验评估了3D抓取法在小鼠中的有效性，检测了类似焦虑的行为、与实验人员的互动情况以及外周应激激素皮质酮的水平，并将其与隧道抓取法和尾部抓取法进行了比较。

轻轻打开笼子，将笼盖放在一侧。在尝试抓取小鼠之前，先将戴着手套的手放入饲养笼中。让小鼠适应手的存在约30秒。

然后尝试用手掌轻轻捧起小鼠。如果小鼠不易被捧起，可将双手合拢，用双手引导小鼠移动至笼子的角落，再用双手将其捧起。

将小鼠从笼子中取出后，尽量保持双手平展且张开。让小鼠自由探索。这为小鼠提供了平坦的站立平台，并降低被咬伤的风险。

将手张开并放平，掌心向上。将另一只手放在小鼠旁边，让小鼠能够在双手之间自由移动，不要施加任何限制。用平展的手掌操作一分钟后，放松手掌，轻轻将小鼠拢成杯状握于手中，然后轻柔地在双手之间滚动小鼠。

持续四分钟，交替进行双手间的轻柔滚动和在张开的双手间自由探索。在最后两分钟内，进行庇护测试：让小鼠移动到手的边缘，然后将两只手合拢。

非常缓慢地将双手拢成杯状，使小鼠能处于双手形成的遮蔽空间内。注意留出开口，以便小鼠在需要时可以逃脱。尽量在不施加任何约束的情况下，让小鼠在该遮蔽空间内停留5到10秒。

在最后两分钟内重复进行3到4次躲避测试。不要急于完成该过程。如果小鼠因被限制在手中而表现出应激反应，则继续用手掌间滚动和自由探索30秒，然后再次尝试躲避测试。

让小鼠自由探索30秒，然后轻轻将其放回笼中。使用70%乙醇或适当的清洁溶液清理台面上的粪便和尿液。根据需要清洁手套上的粪便和尿液，更换新笼子时，用70%乙醇冲洗手套或更换手套。

到第二天，应已可将小鼠用手掌捧出笼子。如果小鼠表现出较明显的反应性，可让其在手掌平放的状态下自由探索开放空间30秒至1分钟。否则，直接进行双手间翻转及庇护测试。

从第一天开始，将手与躲避装置之间的适应步骤重复进行两到三分钟，每个步骤重复数次。如果小鼠在躲避测试中表现得较为放松，可尝试抚摸其背部和头部。

如果小鼠未试图逃避接触，则进行鼻触测试。轻轻触碰小鼠鼻尖。若其未出现啃咬或试图转头的行为，则表明适应良好。

进行抚摸和鼻触测试时，不要急于求成。如果小鼠因被手束缚而表现出应激反应，或不愿被触碰，可继续用手掌间滚动安抚数分钟后再尝试。若动物对躲避处、头部抚摸和鼻触反应良好，约三分钟的操作后即可停止本次操作。

如果动物表现出愿意探索你的双手，且无任何应激迹象（例如试图逃跑、从手中跳下或回避与手的接触），则可继续操作。如果小鼠持续表现出应激反应，或对庇护测试或鼻触测试反应不佳，则应继续该次训练，直至达到五分钟，与第一天相同。随后将小鼠放回其笼中，并清洁实验台面和手套。

第三天，重复第二天的相同步骤。用手掌拿起小鼠，将小鼠在双手之间转移。

用手掌轻轻固定小鼠。如果小鼠对这些步骤反应良好，可尝试抚摸小鼠并进行鼻触测试。到第三天时，小鼠应已足够放松，能够安静地停留在手掌中而不移动，此时您应能在大约两到三分钟内顺利完成这些步骤。

将小鼠放回笼中，并清洁实验台面和手套。第三天，如果动物因实验需要进行束缚处理，例如口服灌胃或腹腔注射，可对小鼠实施颈背部捏压测试。

用拇指和食指捏住小鼠颈背部，将其提起至手上方约五厘米处，保持两到三秒钟。此姿势对成年小鼠通常不太舒适，若小鼠几乎保持不动，则表明其已良好适应抓握操作，后续注射时易于固定。随后将小鼠放回手掌平面，使其自由活动一分钟。

通过实验评估了动物自愿与实验人员互动的意愿以及在实验环境中的易操作性。在研究一中，采用管式抓取或3D抓取方式处理的小鼠，当实验人员试图抓取时，逃跑的可能性较低。此外，使用3D抓取法处理的小鼠在实验人员手所在象限停留的时间更长，表明其更愿意与实验人员互动。

在研究二中，与抓尾法处理的小鼠相比，采用管式处理或3D处理的小鼠在实验人员试图抓取时更不容易逃跑。然而，在研究二中，处理方法对小鼠停留在实验人员手所在象限的时间无显著影响。在两项评估类似焦虑行为的实验——新奇环境抑制摄食实验和高架十字迷宫实验中，比较了3D处理和隧道处理与抓尾法处理的效果。

在第一项研究中，新奇抑制摄食实验显示，使用管状抓握和3D抓握方式处理的小鼠表现出焦虑程度降低的趋势。在高架十字迷宫实验中，抓握方式的总体处理效应不显著。当以Z分数进行汇总时，与尾部抓握小鼠相比，管状抓握和3D抓握小鼠的总体焦虑水平显著降低。

在研究二中，新奇抑制摄食实验和高架十字迷宫实验中的焦虑指标均未显示出操作方式的整体影响。当以Z分数进行汇总时，操作技术对焦虑水平无总体影响。作为应激的生理学指标，我们在短暂操作后15分钟采集了尾部抓握、三维抓握和隧道抓握小鼠的血清，并检测了皮质酮水平。

在研究一中，操作方式未产生总体效应。在研究二中，与抓尾操作相比，三维操作显著降低了小鼠的皮质酮水平。鉴于观察到小鼠操作技术在科学界尚未被广泛认知，我们描述了一种新型操作技术的应用。

在所展示的两项研究中，使用鼠道和三维抓取方式减少了小鼠被捉拿时的逃跑尝试，可能有助于常规操作。此外，在老年雄性小鼠中，该技术降低了类似焦虑的行为，并增加了与实验人员的互动。在年轻雌性小鼠中亦观察到类似趋势。

该技术降低了因操作处理所引起的小鼠皮质酮水平。采用该技术有望减少数据变异，改善动物福利，并促进日常操作处理。