从胚胎发育到退变的椎间盘光学切片与可视化

椎间盘退变会导致严重的功能障碍和疼痛。我们的实验方案能够从形态学角度研究椎间盘的发育过程及其在退变中的变化。由于椎间盘含有致密的I型胶原纤维网络，通常难以通过显微镜对其进行分析。

通过光学切片技术，我们可以研究软骨细胞在不同组织内的三维排列。首先，在术中获取椎间盘（IVD）样本后，立即将其置于添加了2%（体积分数）青霉素-链霉素和1.2%（体积分数）两性霉素B的DMEM培养基中，并在4°C条件下保存，直至进一步处理。若样本为冷冻保存，则在室温下解冻人椎间盘样本，并根据显微特性（如胶原密度和取向）确定人椎间盘组织的来源。

为采集牛椎间盘组织，取包含椎间盘（IVD）及其两个相邻椎体的运动节段，使用15号手术刀从软骨下骨处分离整个牛椎间盘，翻转椎间盘以获取中心区域。在辨认软骨的不同区域后，使用20号或22号手术刀从整个椎间盘中切取目标区域。对于胚胎牛的椎间盘（IVD），若其顶臀长小于20厘米，则无需解剖，直接进行处理。

按照文稿中所述方法进行组织脱钙。若20号针头可无明显阻力地刺入椎间盘组织，或在适用情况下刺入椎体，则表明脱钙成功。将组织样本置于十倍体积的4%多聚甲醛PBS溶液中，在4°C下固定过夜。

第二天，将组织置于冷冻切片机旋钮上的水溶性包埋介质中，使切面为轴向平面或垂直于Ⅰ型胶原正常走向的平面。使用标准冷冻切片机对包埋的组织进行切片，人源样本切片厚度为 70 微米，牛源样本切片厚度为 40 微米。将切片收集到玻片上，用 PBS 漂洗三次，随后加入合适的荧光染料，再滴加封片剂，并用盖玻片覆盖切片。

将带有染色组织切片的载玻片放置在荧光显微镜的样品台上，启动结构照明装置，使用荧光滤光片和适当的照明条件进行单视野成像。利用与荧光显微镜兼容的图像优化软件，通过调整亮度和强度对图像进行处理。为整体观察切片，可采用拼接成像技术：从工具栏面板打开60倍采集设置，并在“拼接”选项卡中调整拼接参数。

为此，需定义视野图像的列数和行数，这些图像后续将合并为一幅整体图像，点击“setup”并调整各个图像块的焦点校正。通过优化图像的强度和亮度进行后期处理。为分析软骨细胞的空间组织结构，使用软件内置的3D功能，通过“start/stop”按钮调节Z轴层扫设置，定义扫描参数，如Z轴的起始和终止位置以及层间距离。

识别单个细胞的排列模式，并使用细胞计数插件对细胞模式进行定量分析，通过将计数的细胞数除以所选感兴趣区域的大小来计算细胞密度。在轴向和矢状面拍摄的拼接图像中，可以辨识出椎间盘的结构特征，即纤维环中致密的胶原纤维网络以及较柔软的髓核。在拼接图像的放大区域中，可观察到软骨细胞不同的空间组织模式，例如：单个细胞、成对细胞以及串状排列。

对牛纤维环不同发育和成熟阶段的研究显示，在胚胎期椎间盘发育过程中，细胞密度持续下降。另一方面，在成人人类椎间盘退变过程中，观察到细胞密度增加并形成细胞簇。在牛纤维环和牛髓核的椎间盘发育早期，细胞密度迅速降低，直至出生时为止。

通过Epitome对椎间盘进行通道成像，可实现完整椎间盘中软骨细胞单个或成对分布的细胞质和细胞核等空间结构三维构象的可视化观察。而在退变的纤维环中则发现细胞簇的存在。最具挑战性的步骤是将组织准确定位至其原始位置，并对包埋用于切片的样本进行校正。

这是获得可靠结果的关键。正确分离并选取来自不同阶段和来源的椎间盘组织，可为进一步的生物化学和生物力学分析（如酶联免疫吸附测定或原子力显微镜）提供基础，从而加深研究分析。