Name: 使用 1-Cyano-4-二甲基亚胺四氟化物 （CDAP） 激活和结合可溶性聚糖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习使用CDAP试剂对多糖进行可控活化，实现与蛋白质的高效偶联，用于疫苗和诊断试剂的制备。该方法操作简便、重现性好，偶联产率可超过75%，适用于多种多糖的功能化修饰。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究所述工作由 Fina Biosolutions LLC 资助。

<ol><li>Ellis, R. W., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEllis%2C+RW+%22Development+and+clinical+uses+of+Haemophilus+B+conjugate+vaccines%22">Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines</a>. , CRC Press. (1994).</li>
<li>Goebel, W. F., Avery, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-immunological+studies+on+conjugated+carbohydrate-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.</a> Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).</li>
<li>Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+independent+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell independent antigens.</a> Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Conjugate+Vaccines%22">Conjugate Vaccines</a>. Cruse, J. M., Lewis, R. E. 10, Karger. Basel. (1989).</li>
<li>Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents.</a> Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).</li>
<li>Shafer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-4-dimethylaminopyridinium+tetrafluoroborate+%28CDAP%29+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+II.+Selective+crosslinking+of+proteins+to+CDAP-activated+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides.</a> Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).</li>
<li>Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization%2C+and+immunogenicity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+polysaccharide-protein+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates.</a> Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).</li>
<li>Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+soluble+polysaccharides+with+1-cyano-+4-dimethylaminopyridine+tetrafluoroborate+%28CDAP%29+for+use+in+protein-polysaccharide+conjugate+vaccines+and+immunological+reagents.+III+Optimization+of+CDAP+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation.</a> Vaccines. 8 (4), 777(2020).</li>
<li>Qi, X. -Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+determination+of+hydrazine%2C+hydrazides%2C+and+their+mixtures+with+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).</li>
<li>Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+neutral+sugars+by+a+resorcinol+sulfuric+acid+micromethod%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod.</a> Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).</li>
<li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+G+%22Bioconjugate+Techniques.+3rd+ed%22">Bioconjugate Techniques. 3rd ed</a>. , Academic Press. (2013).</li>
</ol>

Andrew Lees 是 Fina Biosolutions 的创始人和所有者。他拥有多项与 CDAP 化学相关的专利，并从该化学技术及 CDAP 偶联技术的知识授权中获益。

CDAP 是一种用于衍生化和偶联多糖的便捷试剂。本文描述了使用 CDAP 将多糖与酰肼基团进行衍生化（PS-ADH）的通用方法，并纳入了近期发表的改进措施8。首先，该技术强调了维持目标 pH 值以控制活化过程的重要性。我们发现，尽管许多常用缓冲液会干扰 CDAP 活化反应，但 DMAP 可成功用作调节 pH 的缓冲剂8。此外，DMAP 本身就是 CDAP 活化反应的副产物。最后，在加入 CDAP 前先用 DMAP 对多糖溶液进行缓冲，有助于精确调控并维持反应体系的 pH 值。如文中所述，调整浓储备 DMAP 溶液的 pH 值是可取的，以便在稀释后达到目标 pH 值。其次，在低温条件下进行该过程可减缓反应速度，使活化过程更为平缓且容错性更高。较低温度降低了 CDAP 水解的速率，在 pH 9 条件下的最佳活化时间从约 3 分钟延长至约 15 分钟。此外，与室温下操作相比，达到相同活化程度所需的 CDAP 用量更少。
ADH 衍生化的多糖可使用碳二亚胺类试剂（例如 EDAC）与蛋白质偶联7。例如，多种已获许可的b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae b，Hib）疫苗即采用经ADH衍生化的聚核糖基核糖醇磷酸酯（PRP），并通过EDAC将其与破伤风类毒素偶联。早期曾使用CNBr，但CDAP作为该用途的试剂操作简便得多。根据我们的经验，ADH衍生化的理想目标范围为每100 kDa多糖引入10–30个肼基，或按重量计约含1–3%的ADH。
通过将ADH替换为二胺，可采用相同的方法使含有伯胺的多糖发生衍生化。建议使用己二胺对多糖进行胺基衍生化8。胺基化多糖（PS-NH2）可利用专为蛋白质偶联开发的试剂进行偶联11。通常，将PS-NH2用马来酰亚胺试剂衍生化（例如：琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯（SMCC）或N-γ-马来酰亚胺丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS）），同时对蛋白质进行巯基化处理（例如：使用琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯（SPDP））。巯基-马来酰亚胺化学反应效率非常高。
蛋白质也可通过赖氨酸残基上的ε-氨基直接偶联到CDAP活化的多糖上。尽管所用的活化方案通常与本文所述相似，但仍需优化活化程度、多糖和蛋白质浓度，以及蛋白质与多糖的比例5,6,8。
由于葡聚糖含有相对高密度的羟基，因此它是使用CDAP活化最简便的多糖之一，但某些多糖（如Vi抗原）则较难处理。因此，并不存在一种适用于所有蛋白质的CDAP直接偶联“最佳”方案。我们建议首先建立一个能够实现适当活化程度（通过肼基衍生化程度确定）的方案，然后进行蛋白质与CDAP活化多糖的直接偶联。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure was updated.
Figure 4 was updated from:
<img alt="Hydrazide standard curve, resorcinol assay graphs, tabulated data for glucose and dextran analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig04.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig04large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Resorcinol/sulfuric acid assay graph and table; hydrazide TNBS standard; data comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62597/activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4">Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)</a>. A figure&#160;was updated.

Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

结合疫苗，例如由多糖共价连接至载体蛋白构成的疫苗，是疫苗学领域的重要进展之一1,2。多糖作为T细胞非依赖性抗原，在婴儿中免疫原性较弱，且无法诱导免疫记忆、抗体类别转换或抗体亲和力成熟3。这些缺陷在多糖结合疫苗中得以克服4。由于大多数多糖缺乏便于偶联的化学基团，因此必须首先使其具有反应性，即&#34;活化&#34;。活化后的多糖可直接与蛋白质（或经修饰的蛋白质）连接，或在偶联前进一步功能化以实现额外衍生化4。目前大多数已获批准的多糖结合疫苗采用还原胺化法或氰化法来活化多糖中的羟基。溴化氰（CNBr）曾被用于活化层析树脂，最初也被用于多糖的衍生化。然而，CNBr需要高pH条件（通常约为pH 10.5或更高），以部分去质子化多糖的羟基，使其具有足够的亲核性以攻击氰基。这种高pH条件可能对碱不稳定的多糖造成损害，且CNBr本身以及最初形成的活性氰酯在如此高的pH下均不够稳定。
CDAP（1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐；图1）由Lees等人首次提出，用作多糖活化的氰基化试剂5,6。CDAP为结晶性物质，易于操作，可在比CNBr更低的pH条件下活化多糖，且副反应更少。与CNBr不同，CDAP活化的多糖可直接与蛋白质偶联，从而简化了合成过程。CDAP活化的多糖可通过二胺（如己二胺）或二酰肼（如己二酸二酰肼，ADH）进行功能化修饰，生成氨基或酰肼基修饰的多糖。使用高浓度的同双功能试剂可抑制多糖之间的交联。氨基化多糖随后可通过多种已知的蛋白质偶联技术进行偶联。酰肼基修饰的多糖通常使用碳二亚胺试剂（如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDAC））与蛋白质偶联7。Lees等人已对CDAP介导的多糖活化方法进行了进一步优化8，本方案中已整合了这些优化步骤。
CDAP 偶联概述 
CDAP 方法可分为两个阶段：（1）多糖的活化，以及（2）将活化的多糖与蛋白质或配体进行偶联（图 2）。第一步的目标是高效地活化多糖，第二步的目标则是高效地与活化的多糖发生偶联反应。活化的多糖将这两个步骤联系在一起。这种分步概念有助于聚焦每个步骤中的关键要素。图 2 进一步扩展了这一概念，展示了期望发生的活化与偶联反应，以及伴随发生的水解反应和副反应。
在活化阶段，主要关注三个问题：CDAP 的稳定性、CDAP 与多糖羟基的反应，以及活化多糖的稳定性（图3）。CDAP 的水解随 pH 升高而增加，活化多糖的水解及副反应亦如此。然而，提高 pH 有助于 CDAP 与多糖的反应。使用 CDAP 高效活化多糖需要在以下两方面之间取得平衡：1）多糖与 CDAP 的反应活性；2）试剂及活化多糖的水解与副反应。
在Lees等人5描述的原始CDAP活化方案中，多糖的CDAP活化是在未缓冲的pH 9溶液中于室温下进行的。在此条件下，活化反应速率较快，通常在3分钟内即可完成。然而，该反应伴随CDAP的快速水解，导致未缓冲反应体系的pH迅速下降。在如此短的时间内快速调节并维持反应pH至目标值具有较大挑战性。在该方案中，通过将CDAP从100 mg/mL的储备液加入未缓冲的多糖溶液中进行活化，30秒后加入&#34;等体积的0.2 M三乙胺&#34;以提高pH值，随后在活化反应进行2.5分钟后加入待偶联的蛋白质。值得注意的是，该活化步骤的pH控制并不理想，极有可能在初始阶段超过目标pH值。由于反应迅速且需及时调节pH，使得活化过程难以精确控制，并给放大生产带来困难。
与原始方案相比，此处描述的改进方案具有两项主要改进。首先，在加入CDAP之前，使用DMAP作为缓冲液，将多糖溶液的pH预先调节至目标活化pH。DMAP的pKa为9.5，因此在pH 9左右具有良好的缓冲能力；与其他许多缓冲液不同，DMAP不会促进CDAP的水解8。此外，DMAP本身已是反应过程中的中间体，因此不会向反应体系中引入新的组分。在加入CDAP前预先调节pH，可消除反应初期剧烈的pH波动，并使反应过程中目标pH的维持更加高效。第二项改进是将活化反应在0 °C下进行，此时CDAP的水解速率显著低于室温条件。由于在0 °C下试剂半衰期更长，活化时间从3分钟延长至15分钟，以补偿低温下较慢的活化速率。延长的反应时间反过来更有利于反应pH的稳定控制。采用0 °C还能减缓对pH敏感的多糖的降解，从而使得此类多糖的偶联物制备成为可能。这些方案改进使活化过程更为平稳、易于控制、可重复性更高，并更易于实现放大生产。
本文介绍了在0 °C及指定目标pH条件下进行多糖的CDAP可控活化，并随后用ADH对活化的多糖进行衍生化的改进方案。同时描述了一种基于Qi等9方法的三硝基苯磺酸（TNBS）测定法，用于测定修饰后多糖上的肼基含量。此外还介绍了一种基于间苯二酚和硫酸的己糖改良测定法10，可用于测定更广泛种类的多糖。有关CDAP活化与偶联的更多详细信息，读者可参考Lees等人的早期文献5,6,8。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>Sigma</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>己二酸二酰肼</td><td>Sigma</td><td>A0638</td><td>MW 174</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 10 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td>分子量截留值对于200 kDa PS可为30 kDa</td></tr><tr><td>分析天平</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动滴定器或电子移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧杯&amp;nbsp; 2-4 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDAP</td><td>SAFC</td><td>RES1458C</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>107700</td><td>MW 122.2</td></tr><tr><td>片冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>VWR</td><td>BDH7202-1</td><td></td></tr><tr><td>微型搅拌子</td><td>VWR</td><td>76001-878</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（用于CDAP）</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td>Sigma</td><td>1099130001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 10 M</td><td>Sigma</td><td>SX0607N-6</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 探针</td><td>Cole Parmer</td><td>55510-22</td><td>6 mm × 110 mm 环氧单结</td></tr><tr><td>pH 温度探针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器 &amp;和技巧</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水或 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-20 mL 小烧杯</td><td>VWR</td><td>10754-696</td><td>10 mL 烧杯为 pH 探针留出空间 &amp;和移液器</td></tr><tr><td>小型冰桶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型刮勺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;间苯二酚测定法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combitip</td><td>Eppendorf</td><td>10 ml</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析管</td><td>Repligen</td><td>132650T</td><td>Spectra/Por 6-8 kDa</td></tr><tr><td>透析袋夹子</td><td>Repligen</td><td>142150</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重复移液器</td><td>Eppendorf</td><td>M4</td><td></td></tr><tr><td>间苯二酚</td><td>Sigma</td><td>398047</td><td></td></tr><tr><td>糖标准品</td><td></td><td>视情况而定</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;75% 硫酸</td><td>VWR</td><td>BT126355-1L</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;TNBS 测定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>己二酸二酰肼</td><td>Sigma</td><td>A0638</td><td>MW 174</td></tr><tr><td>硼硅酸盐试管 12 x 75</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M pH 9 硼酸钠</td><td>Boston Biologicals</td><td>BB-160</td><td></td></tr><tr><td>TNBS 5% w/v</td><td>Sigma</td><td>P2297</td><td>MW 293.17</td></tr></tbody></table>

使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（cdap）活化和偶联可溶性多糖

Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)

结合疫苗是疫苗学领域的重大进步。在制备多糖结合疫苗时，可使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）这一易于操作的氰基化试剂，方便地对多糖进行功能化修饰，并将其连接至疫苗载体蛋白。CDAP在pH 7–9条件下与多糖的碳水化合物羟基反应，从而活化多糖。CDAP的稳定性和反应活性高度依赖于pH值。由于CDAP在活化过程中发生水解，反应体系的pH会随之下降，因此良好的pH控制是实现可重复活化的关键。最初的CDAP活化方案是在室温下、未缓冲的pH 9溶液中进行的。
由于在此条件下反应迅速（&#60;3 分钟），且伴随CDAP快速水解导致pH迅速下降，因此在短时间内快速调节并维持目标反应pH具有挑战性。本文所述的改进方案在0 °C下进行，可减缓CDAP的水解，使活化时间从3分钟延长至约15分钟。此外，使用二甲基氨基吡啶（DMAP）作为缓冲剂，在加入CDAP试剂前预先将多糖溶液调节至目标活化pH。更长的反应时间，结合较慢的CDAP水解速率以及DMAP缓冲体系的使用，使得在整个活化过程中更容易维持活化pH。该改进方案使活化过程更为平稳、可重复性更高，并更易于放大操作。

为说明使用CDAP化学法对多糖进行活化和衍生化的过程，采用每毫克葡聚糖分别加入0.25和0.5 mg CDAP的条件对葡聚糖进行活化。每次反应中，将10 mg/mL的葡聚糖水溶液置于冰上冷却，并加入1/10体积的CDAP溶液th 加入2.5 M DMAP储备液（按第3节所述方法配制）的适量体积，然后通过添加0.1 M NaOH将最终溶液的pH调至9 10 µL 分装。将溶液冷却并搅拌，加入CDAP，并通过添加物维持pH值在9。 10 µL 0.1 M NaOH 中孵育 15 分钟。仅加入 0.25 mL pH 9 的 0.5 M ADH（少于常规用量），反应在过夜条件下进行 4 °C.
然后按照第6节所述，将标记的葡聚糖依次用1 M NaCl、0.15 M NaCl和水进行透析。随后采用间苯二酚-硫酸法（第7.2节）测定ADH-葡聚糖中的葡聚糖含量。以葡萄糖作为糖标准品绘制的典型标准曲线如图4A所示。采用第7.3节所述的TNBS法测定腙基含量。以ADH作为标准品绘制的典型腙基标准曲线见图4B。
在图4A、B中展示了葡聚糖在两种活化水平下的代表性计算结果。数据分别以每100 kDa葡聚糖聚合物所含的肼基数以及ADH占葡聚糖的重量百分比表示，如图4C中第7.9.3.4节和第7.9.3.5节所述。随着CDAP比例加倍，衍生化程度也近似增加了一倍。
<img alt="化学结构图：[Chemical Name]；有机化合物、离子、甲基团包含情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：CDAP的化学结构。CDAP = 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CDAP、DMAP、异脲参与的多糖活化反应示意图；蛋白质交联方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：CDAP活化与偶联过程。 该过程在概念上分为两个阶段，两者均以活化的多糖为共同中间体。在碱性条件下，CDAP活化多糖上的羟基并释放DMAP（反应1）。CDAP的水解也会释放DMAP（反应3）。尽管图中显示为氰基酯，但这可能并非真实的中间体。因此，该中间体被统称为（CDAP）“活化”的多糖。在第一阶段的活化过程中，活化的多糖可能发生水解（反应4）或副反应（反应5）。在第二阶段的偶联过程（反应2）中，活化的多糖与胺反应，除发生反应4和5外，还形成稳定的异脲键。缩写：CDAP = 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐；DMAP = 4-二甲基氨基吡啶；R-NH2 = 胺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CDAP活化示意图；pH对多糖稳定性与反应性平衡的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：CDAP活化与偶联。 该过程需要平衡CDAP与多糖之间的反应性、CDAP及活化多糖的稳定性，以及活化多糖与胺之间的反应性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="间苯二酚硫酸法测定图、酰肼标准TNBS法测定图以及葡萄糖/葡聚糖的数据表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：CDAP活化葡聚糖的代表性结果。（A）间苯二酚/硫酸法和（B）TNBS法测定的典型标准曲线。结果显示了以0.25和0.5 mg CDAP/mg葡聚糖活化的葡聚糖的测定结果。间苯二酚法测定以葡萄糖作为标准品。葡聚糖浓度（mg/mL）除以100 kDa，得到摩尔浓度。酰肼浓度通过以ADH作为标准品测定，结果以µM Hz表示。（C）酰肼：葡聚糖比例的计算。为了便于比较不同平均分子量的聚合物，衍生化程度以每100 kDa葡聚糖所含的酰肼数量来计算。g ADH/g葡聚糖的重量百分比是根据ADH的分子量为174 g/mol计算得出的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62597/62597fig4v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

含有氨基的蛋白质和配体可通过氰化试剂1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化的多糖共价连接，形成共价的蛋白质（配体）-多糖偶联物。本文介绍了一种改进的实验方案，可在0 °C及不同pH条件下实现对CDAP活化过程的精确控制，并对活化后的多糖进行后续偶联反应。

使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化和偶联可溶性多糖

结合疫苗是疫苗学领域的重大进展。在多糖结合疫苗的制备过程中，多糖可以……

多糖的免疫原性较差，除非与蛋白质连接，且需要活化后才能进行衍生化或与蛋白质偶联。本方法中，使用CDAP作为活化试剂。CDAP可活化多糖的羟基，用于后续衍生化，或与蛋白质连接，以用于疫苗或诊断试剂。CDAP 在很大程度上已取代溴化氰，成为多糖偶联的交联试剂。CDAP 使用更简便、效率更高，且可在比溴化氰更低的 pH 条件下使用。它是一种更为优良的活化试剂。与需要邻位羟基的还原胺化法不同，CDAP可用于大多数多糖。该化学方法既可直接也可间接与蛋白质偶联，并可用于制备诊断试剂。CDAP活化反应按最初描述的方法进行时，反应速度极快且难以控制。本文提供的方案使该化学反应更易于操作，且重现性显著提高。在开始实验前，边搅拌边逐滴加入200微升二甲基氨基吡啶储备液，将多糖溶液的pH值调节至9。在整个活化过程中，将反应体系置于冰水浴中保持低温。在搅拌的同时，将100微升氰基二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）转移至多糖溶液中，进行CDAP活化。启动计时器，并在15分钟的整个活化过程中监测pH变化。通过迅速添加0.1摩尔氢氧化钠溶液（每次10微升），将反应维持在目标pH值。当达到最佳活化时间后，立即将2毫升0.5摩尔的己二酸二酰肼一次性加入活化的多糖中。检查pH值是否处于羟基功能化所需的范围内。反应混合物持续搅拌至少一小时后，将反应混合物转移至4摄氏度环境中。为了降低产物中的ADH浓度，使用透析装置对粗制的衍生化多糖溶液进行透析。从透析过程中回收衍生化多糖，并测定多糖和酰肼的浓度，以计算酰肼与多糖的比率。配制浓度为1毫克/毫升的未修饰多糖溶液作为标准品。将加热模块预热至140摄氏度，持续至少一小时，以达到稳定且均匀的温度。在加热模块的下方及周围使用防护垫，以防酸液溢出。取不同体积的1毫克/毫升碳水化合物标准品，加入已标记的13×100硼硅酸盐试管中，每组设三个重复，并用蒸馏水补足至100微升，以获得所需的标准浓度。同样，通过向三个样品管中各加入含有五微克衍生化多糖的体积来建立样品检测。向每根试管中加入100微升新配制的6毫克/毫升间苯二酚溶液。使用重复移液器，向每根试管中加入300微升已配制的75%硫酸，剧烈涡旋振荡试管，管口朝外，随后按顺序以稳定的速度将所有试管放入预热块中，并立即设置计时器为三分钟。三分钟后，按照相同顺序取出试管，立即放入盛有冰水的试管架中。将冰冻的试管取出，使其在室温下平衡五分钟。使用光程为10毫米的比色皿，在紫外-可见分光光度计上于430纳米处测定所有试管的吸光度。为建立检测反应，将标记好的标准品管按浓度递增的顺序在试管架中进行排序和排列。使用校准过的微量移液器，向每支对应的试管中加入 100 µL 标准品。对于零标准品，加入 100 µL 样品缓冲液。同样地，准备并排列好样品管。然后使用已校准的1,000 µL微量移液器，向所有测定管中加入875 µL的测定缓冲液。为启动测定反应，在五分钟内按照预先确定的顺序，向每个测定管中加入25 µL的1%三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid）。将检测管在高速下涡旋震荡两秒钟，确保液体旋转至距离管口约半英寸的高度。记录检测开始时间，并将计时器设为两小时。随后将检测管架置于室温避光处静置两小时。时间结束后，涡旋混匀各管，然后进行数据采集。采用间苯二酚硫酸法测定ADH葡聚糖中的葡聚糖含量。以葡萄糖作为糖标准品绘制了一条典型的标准曲线管。使用TNBS法测定衍生化多糖或葡聚糖中的肼基含量。衍生化程度以每100千道尔顿葡聚糖所含的肼基数计算，以便于比较不同平均分子量的聚合物。此处所述方案可能需要根据特定多糖进行调整。CDAP化学法可用于对多糖进行功能化修饰，以便与多种偶联试剂联用。例如，可利用该方法对多糖进行生物素标记，用于ELISA实验。蛋白质可直接连接至CDAP活化的多糖，但通常需要针对特定多糖进行一定的优化。偶联产率可超过75%。CDAP化学方法的应用使得低成本结合疫苗的制备成为可能，例如印度血清研究所生产的疫苗。

activation-conjugation-soluble-polysaccharides-using-1-cyano-4

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用 1-Cyano-4-二甲基亚胺四氟化物 （CDAP） 激活和结合可溶性聚糖

本文介绍了一种高通量方法，用于合成寡糖并将其连接到聚酸酐纳米颗粒表面，以进一步用于靶向抗原呈递细胞上的特定受体。...

高通量合成碳水化合物及聚酸酐纳米颗粒的功能化

使用溶液法合成不对称的二茂铁化合物具有挑战性。本报告重点介绍通过固相合成法，采用简便且洁净的反应制备二茂铁-生物素生物偶联物的方法。实验表明，引入硫醇盐基团可赋予该化合物在金表面固定化的能力。...

通过固相树脂法合成不对称二茂铁衍生的生物共轭体系的方法学

展示了一种高效、三步合成基于RAFT的荧光糖聚合物的方法，包括糖单体的制备、共聚反应和后修饰。该方案可用于制备具有理想结构的基于RAFT的统计型糖聚合物。...

通过RAFT控制聚合简便高效地制备三组分荧光糖聚合物

本文介绍了一种用于制备和观察螺旋状聚碳二亚胺衍生的二级结构（例如，纤维、环状结构和纳米球）的实验方案。通过原子力显微镜（AFM）和扫描电子显微镜（SEM）表征的形貌表明，其形态依赖于分子结构、浓度以及所选溶剂。...

由螺旋聚碳二亚胺共聚物及其三唑衍生物获得的自组装形貌

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

2-叠氮-1-硝酸酯可通过一锅法转化为相应的2-叠氮-1-三氯乙酰亚胺酯。本文旨在展示微波反应器在碳水化合物合成中的应用价值。...

一锅法微波辅助将异头位硝酸酯转化为三氯乙酰亚胺酯

本文介绍了一种利用二溴马来酰亚胺对Qβ病毒样颗粒（VLP）上的二硫键进行荧光功能化的实验方法。我们描述了Qβ的表达与纯化过程、二溴马来酰亚胺功能化分子的合成，以及二溴马来酰亚胺与Qβ之间的偶联反应。所得到的黄色荧光偶联颗粒可作为细胞内的荧光探针使用。...

利用二溴马来酰亚胺-二硫键化学法制备偶联诱导荧光的聚乙二醇化病毒样颗粒

在此，我们介绍了通过区域选择性 O核糖核苷的糖基化 通过...

区域选择性O-糖基化核苷via硼酸酯对2',3'-二醇的临时保护合成双糖核苷

本方案展示了如何使用Auto-CHO软件进行寡糖的分级和可编程一锅法合成。同时描述了RRV测定 实验以及SSEA-4一锅法糖基化的一般操作流程。...

一锅法合成寡糖的层级化与程序化策略

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）的研发为清除有害抗体提供了新策略。本文详细描述了DCAF1分子的合成方案，该分子可选择性阻断4G2抗体，从而在登革病毒感染过程中消除抗体依赖性增强效应。...

抗原肽与Fc-III模拟物双功能偶联物（DCAF）介导的靶向抗体阻断

本实验方案中，采用荧光辅助碳水化合物电泳（Fluorophore-Assisted Carbohydrate...

使用荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）方法测定糖原的葡聚糖链长度分布

学习使用CDAP试剂对多糖进行可控活化，实现与蛋白质的高效偶联，用于疫苗和诊断试剂的制备。该方法操作简便、重现性好，偶联产率可超过75%，适用于多种多糖的功能化修饰。

使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化和偶联可溶性多糖

探索更多视频