使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化和偶联可溶性多糖

多糖的免疫原性较差，除非与蛋白质连接，且需要活化后才能进行衍生化或与蛋白质偶联。本方法中，使用CDAP作为活化试剂。CDAP可活化多糖的羟基，用于后续衍生化，或与蛋白质连接，以用于疫苗或诊断试剂。

CDAP 在很大程度上已取代溴化氰，成为多糖偶联的交联试剂。CDAP 使用更简便、效率更高，且可在比溴化氰更低的 pH 条件下使用。它是一种更为优良的活化试剂。

与需要邻位羟基的还原胺化法不同，CDAP可用于大多数多糖。该化学方法既可直接也可间接与蛋白质偶联，并可用于制备诊断试剂。CDAP活化反应按最初描述的方法进行时，反应速度极快且难以控制。

本文提供的方案使该化学反应更易于操作，且重现性显著提高。在开始实验前，边搅拌边逐滴加入200微升二甲基氨基吡啶储备液，将多糖溶液的pH值调节至9。在整个活化过程中，将反应体系置于冰水浴中保持低温。

在搅拌的同时，将100微升氰基二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）转移至多糖溶液中，进行CDAP活化。启动计时器，并在15分钟的整个活化过程中监测pH变化。通过迅速添加0.1摩尔氢氧化钠溶液（每次10微升），将反应维持在目标pH值。

当达到最佳活化时间后，立即将2毫升0.5摩尔的己二酸二酰肼一次性加入活化的多糖中。检查pH值是否处于羟基功能化所需的范围内。反应混合物持续搅拌至少一小时后，将反应混合物转移至4摄氏度环境中。

为了降低产物中的ADH浓度，使用透析装置对粗制的衍生化多糖溶液进行透析。从透析过程中回收衍生化多糖，并测定多糖和酰肼的浓度，以计算酰肼与多糖的比率。配制浓度为1毫克/毫升的未修饰多糖溶液作为标准品。

将加热模块预热至140摄氏度，持续至少一小时，以达到稳定且均匀的温度。在加热模块的下方及周围使用防护垫，以防酸液溢出。取不同体积的1毫克/毫升碳水化合物标准品，加入已标记的13×100硼硅酸盐试管中，每组设三个重复，并用蒸馏水补足至100微升，以获得所需的标准浓度。

同样，通过向三个样品管中各加入含有五微克衍生化多糖的体积来建立样品检测。向每根试管中加入100微升新配制的6毫克/毫升间苯二酚溶液。使用重复移液器，向每根试管中加入300微升已配制的75%硫酸，剧烈涡旋振荡试管，管口朝外，随后按顺序以稳定的速度将所有试管放入预热块中，并立即设置计时器为三分钟。

三分钟后，按照相同顺序取出试管，立即放入盛有冰水的试管架中。将冰冻的试管取出，使其在室温下平衡五分钟。使用光程为10毫米的比色皿，在紫外-可见分光光度计上于430纳米处测定所有试管的吸光度。

为建立检测反应，将标记好的标准品管按浓度递增的顺序在试管架中进行排序和排列。使用校准过的微量移液器，向每支对应的试管中加入 100 µL 标准品。对于零标准品，加入 100 µL 样品缓冲液。

同样地，准备并排列好样品管。然后使用已校准的1,000 µL微量移液器，向所有测定管中加入875 µL的测定缓冲液。为启动测定反应，在五分钟内按照预先确定的顺序，向每个测定管中加入25 µL的1%三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid）。

将检测管在高速下涡旋震荡两秒钟，确保液体旋转至距离管口约半英寸的高度。记录检测开始时间，并将计时器设为两小时。随后将检测管架置于室温避光处静置两小时。

时间结束后，涡旋混匀各管，然后进行数据采集。采用间苯二酚硫酸法测定ADH葡聚糖中的葡聚糖含量。以葡萄糖作为糖标准品绘制了一条典型的标准曲线管。

使用TNBS法测定衍生化多糖或葡聚糖中的肼基含量。衍生化程度以每100千道尔顿葡聚糖所含的肼基数计算，以便于比较不同平均分子量的聚合物。此处所述方案可能需要根据特定多糖进行调整。

CDAP化学法可用于对多糖进行功能化修饰，以便与多种偶联试剂联用。例如，可利用该方法对多糖进行生物素标记，用于ELISA实验。蛋白质可直接连接至CDAP活化的多糖，但通常需要针对特定多糖进行一定的优化。

偶联产率可超过75%。CDAP化学方法的应用使得低成本结合疫苗的制备成为可能，例如印度血清研究所生产的疫苗。