DNA甲基化生物信息学分析的样品制备:肥胖和相关性状研究的关联策略

大规模组学技术越来越多地用于关注肥胖的研究。表观遗传学可能是暴露与健康结果之间的联系。这种类型的研究会产生大量的数据。

鉴于此，重要的是要标准化协议，以使数据在技术上具有可比性。在这项研究中，我们将提出一个管道，以获得和分析DNA甲基化数据。相同的协议可以应用于400K和史诗版本。

第一天:亚硫酸氢盐治疗。首先使基因组DNA变性，然后加入转化试剂。有必要遵循套件的建议。

并用二磷酸盐处理变性DNA。然后将样品在热循环仪中孵育。使用洗涤缓冲液执行洗涤步骤。

第二天:甲基化测定后扩增，手动方案。将杂交炉预热至37摄氏度，让温度平衡。将20微升MA1分散到板的孔中。

将四微升的DNA转移到板上的相应孔中。将四微升氢氧化钠溶液分散到板孔中。用塑料密封密封板。

涡旋板以将试剂与样品混合。在室温下孵育10分钟。将68微升RPM分散到每个孔中，然后分散75微升MSM而不除去先前的溶液。

使用新的密封件覆盖板。涡旋板一分钟。在37摄氏度的杂交炉中孵育20至24小时。

第三天:甲基化测定后的杂交，手动方案。通过将板插入37摄氏度来预热块。小心地从杂交炉中取出板。

脉冲离心板。从板上取下密封件。向每个样品容器中加入50微升FMS。

涡旋板一分钟。离心板需要。然后将密封板放在37摄氏度的加热块上一小时。

向每个含有样品的孔中加入100微升PM1。再次密封板。涡旋板一分钟。

在37摄氏度下孵育五分钟。然后在离心机中脉冲一分钟，然后用样品向每个孔中加入300微升100%2-丙醇。再次密封板。

将所有内容物倒置至少10次。在4摄氏度下孵育30分钟，然后在4摄氏度下离心20分钟。从板上取下密封件。

在适当的位置快速倒置板，丢弃上清液。用力敲击几次，直到您注意到所有孔都不含液体。在室温下，将盘子倒置并揭开一小时。

干燥所有液体后，有必要在井的底部看到蓝色托盘。然后向每个孔中加入46微升RA1。将热封涂在板上。

紧紧握住以均匀地进行密封。将盘子放入48摄氏度的杂交炉中一小时，然后涡旋一分钟。在离心机中脉冲，并将板在95摄氏度下加热一小时。

一起准备BeadChip Hyb Chambers。在下一步中，将400微升PB2分散到Hyb室的储液器中。用PB2填充Hyb室储液器后，立即盖上盖子。

小心地将每个样品从板中加载到微阵列的样品入口处。将含有微阵列的 Hyb 室插入物加载到 Hyb 室中。横向关闭 Hyb 室，以避免可能移动 Hyb 室。

第四天:甲基化测定后染色，手动方案。夜间孵育后，从插入物中取出所有微阵列。并缓慢而轻柔地清洗微阵列，共10次，上下。

将微阵列移动到第二个 PB1 容器，并上下重复 10 次。将流动室的框架放置在正确的位置，然后放置每个微阵列。在每个垫片的顶部使用透明垫片。

对齐杆需要放置在对齐附件上。玻璃背板需要放在垫片的顶部。然后将金属夹具连接到流室。

使用剪刀修剪流室垫片的末端。将带有微阵列的流动室放入腔室机架中。移液器150微升RA1。

孵育30分钟，重复五次。移取450微升XC1，孵育10分钟。移取450微升XC2并孵育10分钟。

移液器200微升TEM。孵育 15 分钟。移液器450微升95%甲酰胺。

孵育一分钟，重复两次。孵育五分钟。移液器450微升XC3。

孵育一分钟，然后重复。在此步骤中，将分配以下试剂，250微升STM，450微升XC3和250微升ATM。执行以下重复方案。

在所有重复和孵育之后，将微阵列放在站立的架子上，然后将它们浸入洗涤容器中。缓慢而轻柔地移动，上下移动，10次。使用真空干燥器干燥微阵列50至55分钟。

一旦微阵列干燥，继续用扫描对微阵列进行成像。在此图像中，我们可以看到使用的所有方案，从选择参与者到处理在甲基化实验的最后一天获得的IDAT文件。这些文件被传输到进行生物信息学分析的计算机。

使用R Studio和生物导体ChAMP包处理分析。确保您的计算机上至少有八 GB 的 RAM。进行了其他生物信息学分析，例如基因富集，以更好地向读者呈现数据。

在此表中，我们可以观察本研究中使用的两组，肥胖和非肥胖。变量，体重指数，腹围，千克脂肪量和脂肪量百分比的组间存在差异。观察此图中呈现的方案，我们能够理解拟议的协议对于我们的数据是足够的。

在生物信息学分析之后，在进行过滤器后，总共出现了409，887个探针。密度图显示，所有样本的β分布密度相似。根据这些分析，没有排除任何样本。

归一化数据的奇异值分解分析表明，BMI、双C和FM显著影响了DNA甲基化数据的变异性。细胞类型估计显示，自然杀伤细胞，NK和B细胞在肥胖女性中都较高。肥胖女性和非肥胖女性之间的DNA甲基化水平在细胞类型校正前后不同。

校正前，观察到43， 463个不同的甲基化位置。在那之后，3， 329 CPG仍然显着。与非肥胖相比，共有162个CPG被低甲基化，576个在肥胖者中被高甲基化。

这些数据可在GEO数据库中获得，注册号为GSE166611。我们介绍了与在SVD中观察到的参与者的特定特征相关的CPG站点。对于脂肪量，发现了13， 222个CPG位点。

在启动子区域有6， 159个脂肪质量相关的CPG。470次甲基化和94次甲基化。相关位点的相应基因被富集，现在被显示出来。

我们观察到，所提出的方案能够在您的甲基化模式中识别，并且在您的甲基化中建立联系是正确的。我们的研究结果证实，致肥胖的生活方式可以促进人类DNA的表观遗传变化。