Name: 细胞模拟支持和悬浮脂质双分子层模型的组装用于分子相互作用研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学习构建支持型和悬浮型脂质双分子层模型，用于研究药物与环境毒素的膜相互作用。该方法可评估化合物渗透性和嵌入特性，适用于神经科学与生物物理学研究。

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本材料基于美国国家科学基金会（National Science Foundation）资助项目（授予 A.S.，项目编号 1942418）以及授予 C.M.B.H. 的美国国家科学基金会研究生研究奖学金（项目编号 1644760）所支持的工作。本文中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。作者感谢 Noel Vera-González 博士在脂质囊泡表征数据采集方面的帮助。作者感谢布朗大学 Robert Hurt 教授提供 Zetasizer 仪器的使用。作者感谢布朗大学质谱中心，特别是 Tun-Li Shen 博士，在脂质组成定量分析方面的协助。

作者声明不存在利益冲突或竞争性经济利益。

本方案可用于制备脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层。本文介绍了形成这三种结构的关键步骤。在制备脂质囊泡时，必须在脂质的相变温度以上进行挤出39。当温度低于相变温度时，脂质以有序的凝胶相物理存在39。在此有序相中，脂质的烃链完全伸展，能够紧密堆积，导致挤出困难39。当加热至相变温度以上时，脂质分子排列变得更加无序，形成液晶相39。在此温度下，脂质的烃链流动性增强，有利于成功挤出39。脂质的特性，如头部基团组成、饱和度和电荷，均会影响其相变温度。此外，在形成脂质膜时彻底去除氯仿至关重要，因为残留的氯仿会在再水化后对囊泡的形成及其性质产生不利影响。
使用QCM-D技术形成支撑脂双层时，确保涂有二氧化硅的石英晶体传感器处于完美状态至关重要。传感器可重复使用，但每次使用前必须检查是否存在划痕、碎屑或其他磨损，一旦发现任何缺陷即应弃用，因为传感器的缺陷会影响...

细胞膜主要由磷脂、胆固醇和蛋白质组成，是所有活细胞的关键组分1由脂质两亲性驱动的结构组织使细胞膜发挥保护屏障功能，并调控细胞与其周围环境的相互作用2多种细胞过程依赖于膜的脂质和蛋白质组成1,2例如，细胞膜相互作用对于有效的药物递送至关重要3药物、生物制剂、纳米材料、生物毒素和环境毒物可能影响细胞膜的完整性，从而影响细胞功能4. 构建 体外 基于细胞膜脂质组成构建的细胞模拟膜模型有望为研究这些材料对细胞的潜在影响提供简便有效的工具。
模型脂质双层包括脂质体、支撑脂质双层和悬浮脂质双层。支撑脂质双层是磷脂细胞膜的一种模型，常用于生物技术应用中，其中脂质体在支撑基底材料上破裂形成双层结构5,6,7,8,9。一种常用于监测双层膜形成的技術是带耗散监测的石英晶体微天平（QCM-D），该技术可原位比较囊泡吸附与整体液体性质的变化in situ8,10,11,12,13,14。先前的研究已利用QCM-D证明，在流动条件下，当表面磷脂酰胆碱（PC）脂质体达到临界覆盖度时，它们会自发破裂并形成刚性脂质双层15。以往的研究还探讨了不同脂质组成16、脂质蛋白的引入17,18,19以及使用聚合物缓冲层20对支撑脂质双层形成的影响，从而获得能够模拟细胞膜多种功能特性的支撑脂质双层。
通过改变磷脂、胆固醇和糖脂组分，脂质双分子层已被用于模拟从亚细胞到器官水平的各种生物屏障，包括线粒体、红细胞和肝细胞膜21。这些更复杂的多脂质囊泡可能需要额外的方法来实现囊泡破裂，具体取决于脂质组成。例如，先前的研究利用了一种源自丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的α-螺旋（AH）肽，通过破坏吸附的脂质囊泡来诱导双分子层的形成22,23。利用这种AH肽，已有研究成功构建了模拟胎盘细胞的支撑脂质双分子层24。支撑脂质双分子层在生物医学应用方面展现出巨大潜力，相关研究涵盖分子和纳米颗粒的转运25, 26、环境毒物相互作用27、蛋白质组装与功能17,18,19、肽的排列与插入28, 29、药物筛选30以及微流控平台31。
通过平行人工膜渗透性测定法（PAMPA），悬浮脂双层已被用于药物筛选研究，其中脂双层被支撑在多孔疏水性插入膜上32,33,34,35。已针对不同的生物界面开发了相应的PAMPA脂质模型，包括血脑屏障、颊部、肠道和透皮界面36。结合支撑脂双层与PAMPA技术，可对化合物在特定组织或细胞类型脂质组分中的吸附、渗透及嵌入行为进行深入研究。
本方案描述了制造与应用 体外 细胞膜脂双层模型用于研究多种分子相互作用。本文详细描述了单组分脂质和多组分脂质支撑型及悬浮型脂双层的制备方法。为构建支撑型脂双层，首先采用薄膜水化与挤出法制备脂质体，随后进行理化表征。文中讨论了利用QCM-D监测技术形成支撑型脂双层，以及为PAMPA应用制备悬浮脂膜的方法。最后探讨了用于构建更复杂细胞模拟膜的多组分脂质体。通过上述两类人工脂膜，本实验方案展示了该工具在分子相互作用研究中的应用。总体而言，该技术可高重复性、高灵活性地构建细胞模拟脂双层。

<table><tbody><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱&amp;nbsp;（POPC，16:0-18:1 PC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂-L-丝氨酸（钠盐）（POPS，16:0-18:1 PS）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（16:0-18:1 PE）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰-sn-甘油-2-磷脂-L-丝氨酸（DOPS，18:1 PS）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DOPC，18:1 (&amp;Delta;9-顺式) PC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（DOPE，18:1 (&amp;Delta;9-顺式) PE）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷脂胆碱（氯化物盐）（18:0 EPC (Cl Salt)）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890703</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>40 mL 样品瓶，琥珀色，带聚四氟乙烯（PTFE）/橡胶衬垫</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>W224605</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-821-781</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC70221</td><td></td></tr><tr><td>C18，3.5 µm × 50 mm 色谱柱，SunFire</td><td>Waters</td><td>&amp;nbsp;186002551</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC288306</td><td></td></tr><tr><td>UV 微量比色皿 LCH 8.5 mm，50 µm，RPK</td><td>Sarstedt</td><td>67.758.001</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）</td><td>Millipore Sigma</td><td>36735</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC472301</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>滤膜支撑片，10 mm</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td>适用于小型挤出器</td></tr><tr><td>折叠毛细管ζ电位池</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764-4L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>Kimberly Clark</td><td>34256</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰肌醇（大豆）（Soy PI）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840044</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱（蛋黄，鸡源）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051</td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast &amp;reg; LF-50</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337 - 4L</td><td></td></tr><tr><td>带支架/加热块的小型挤出装置套装</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen-IP 滤膜板，0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m，透明，无菌</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAIPS4510</td><td>用于PAMPA研究</td></tr><tr><td>高纯氮气</td><td>TechAir</td><td>NI T5.0</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 亲水性膜，聚碳酸酯，19 mm，0.1 µm</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td>适用于小型挤出器</td></tr><tr><td>Nuclepore 亲水性膜，聚碳酸酯，25 mm，0.1 µm</td><td>Whatman</td><td>110605</td><td>适用于大型挤出器</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507X</td><td>稀释至1倍使用</td></tr><tr><td>Qsoft 401 软件</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带耗散检测的石英晶体微天平 Q-Sense 分析仪</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶，硼硅酸盐玻璃瓶，20 mL</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>986561</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅，薄层Q传感器</td><td>Biolin Scientific</td><td>QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSACS5886</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>耐溶剂移液器吸头</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8064</td><td></td></tr><tr><td>鞘磷脂（蛋黄，鸡源）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 基础缓冲液</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSACT1503</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-乙二胺四乙酸</td><td>Caisson Labs</td><td>TRL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 排液盘，25 mm</td><td>Whatman</td><td>230600</td><td>适用于大型挤出器</td></tr><tr><td>Zetasizer ZS90</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer 7.01 软件</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

模型细胞膜是一种有用的筛选工具，其应用范围涵盖早期药物发现到毒性研究。细胞膜是所有细胞类型的关键保护屏障，将细胞内组分与细胞外环境分隔开来。这些膜主要由脂质双层构成，包含外侧的亲水性头部基团和内侧的疏水性尾部基团，并含有多种蛋白质和胆固醇。脂质本身的组成与结构在调控生物学功能中起着关键作用，包括细胞与细胞微环境之间的相互作用，而微环境中可能含有药物、生物毒素以及环境毒物。本研究描述了制备单一种类脂质和多种脂质组成的、支持型与悬浮型细胞模拟脂质双层的方法。此前，已开发出单一种类磷脂酰胆碱（PC）脂质双层以及受胎盘滋养层细胞启发的多种脂质组成的脂质双层，用于研究分子间相互作用。本文将介绍实现上述两类双层模型的实验方法。对于模拟细胞的多脂质双层，首先通过从原代细胞或细胞系中提取脂质，并结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）确定目标脂质组成。基于该组成，采用薄膜水化与挤出法制备脂质体，并对其流体动力学直径和泽塔电位进行表征。随后，分别利用带耗散监测功能的石英晶体微天平（QCM-D）在固体基底上形成支持型脂质双层，或在多孔膜上构建悬浮型脂质双层，以用于平行人工膜渗透性测定（PAMPA）。代表性结果突出了该方法的可重复性与多功能性 体外 细胞膜脂质双层模型。所介绍的方法有助于快速、简便地评估各种分子和大分子与细胞膜之间的相互作用机制（如渗透、吸附和嵌入），从而助力药物候选物的筛选及潜在细胞毒性的预测。

本方案详细介绍了形成支撑型和悬浮型脂双层的方法（图1）。形成支撑型脂双层的第一步是制备脂质囊泡。微型挤出器可用于制备小体积的脂质囊泡（1 mL 或更少），而大型挤出器则可在单次操作中制备 5–50 mL 的脂质囊泡。微型或大型挤出器所形成的单层脂质囊泡的尺寸分布如 图2A 所示。由于大型挤出器采用高压 N2 气体将囊泡溶液推过聚碳酸酯膜，所得脂质囊泡的平均流体动力学直径接近目标值 100 nm。微型挤出器同样可产生均一的尺寸分布，尽管囊泡的流体动力学直径略大于聚碳酸酯膜的孔径，这是此类手动挤出方法的典型特征。
图2B-D 比较了单一脂质卵磷脂PC囊泡与两种多脂质囊泡在粒径、多分散性及zeta电位方面的差异。表1 对比了每种脂质囊泡组成的平均流体动力学直径。第一种多脂质囊泡（ML1）的组成模拟胎盘滋养层来源的脂质囊泡，其组成为卵磷脂（PC）:磷脂酰乙醇胺（PE）:磷脂酰肌醇（P...

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。

模型细胞膜是一种有效的筛选工具，其应用范围涵盖早期药物发现到毒性研究。细胞膜是一种至关重要的...

本方案中描述的脂双层膜构建方法可用于获取关于膜与药物制剂、环境毒物甚至生物化合物相互作用的关键信息。这些技术可用于制备具有不同液相复杂性的膜，并评估化合物在膜中的通透性、吸收和嵌入情况。首先，将适量的脂质储备溶液加入洁净的玻璃小瓶中，以确保在水化后达到每毫升2.5毫克的最终囊泡浓度。使用氮气流去除脂质溶液中的氯仿。为确保完全去除氯仿，将干燥的脂质膜连接至真空泵至少四小时。用所需体积的Tris氯化钠缓冲液重新水化干燥的脂质膜，使囊泡终浓度为2.5毫克/毫升，并涡旋约15至30秒。将囊泡悬液转移至装有干冰的容器中，冷冻约30分钟。待样品完全冻结后，将其在30至40摄氏度的水浴中解冻。涡旋振荡解冻后的囊泡悬液。若要制备一毫升或更少的囊泡，请获取一个微型挤出器。用超纯水预润湿滤膜支撑架，然后将其放置在O形圈内的膜支撑表面。对第二个内部膜支撑架重复此步骤。将一个内膜支撑架放入挤出器外壳中。将一片100纳米的聚碳酸酯膜直接放置在内膜支撑架上的滤膜支撑部位。将第二个内膜支撑架放入挤出器外壳中，确保带有O型圈和滤膜支撑的一侧朝向聚碳酸酯膜。将聚四氟乙烯轴承插入固定结中，并用挤出机外壳拧紧。将挤出机卡入加热块中。将脂质囊泡悬浮液装入一支注射器中，将注射器置于挤出机加热块内，并将针头完全插入挤出机的一端。将第二个空注射器插入另一侧，并使用加热块上的臂夹固定两个注射器。缓慢将囊泡悬液推入空注射器，再推回原始注射器。重复此操作20次，共完成21次通过聚碳酸酯膜的操作。将脂质体转移至洁净的玻璃小瓶中储存。若要挤出5至50毫升的脂质体，需组装大型挤出器：将大孔筛板支撑架、中心圆盘、引流盘和聚碳酸酯膜依次放入挤出器下部支撑架的空腔中。使用四枚螺钉连接挤出器的上、下支撑架，并拧紧。将挤出装置通过旋转拧紧到底部，用扳手固定，连接到样品筒上。在向样品筒中加入样品之前，先用超纯水充满样品筒，并通过挤出装置将水挤出。随后将脂质体悬浮液加入样品筒中，并旋紧顶部盖子。缓慢增加压力，直至样品开始以每秒约两到三滴的速度从挤出装置滴入洁净的玻璃小瓶中。当所有样品均被挤出后，关闭氮气供应，并通过缓慢打开泄压阀释放样品筒内的压力。将脂质体重新倒回样品筒中，并重复上述步骤九次，共计进行10次挤出。 将囊泡悬液加入合适的比色皿中，插入动态光散射仪，输入样品信息，并使用配套软件进行测量。将Zeta电位池放入样品室，确保电极接触良好，然后关闭样品室盖。在配套软件中输入样品信息并采集测量数据。将二氧化硅编码的石英晶体传感器插入流动模块中，确保晶体上的T形标记与模块上的T形标记对齐，然后拧紧流动模块。对于具有多个腔室的仪器，可并行形成额外的双层膜。将进样管和出样管连接到流动模块和泵上。将管路放入固定夹中，并关闭分析系统的盖子。在泵的出口处放置一个废液容器，用于收集废液。进行清洗时，首先启动泵，并将流速设置为 400 µL/min。将进样管插入超纯水中，使5到10毫升水通过模块。将管路切换至SDS溶液中，使5到10毫升溶液通过模块。再将管路切换回超纯水中，使10到20毫升水通过模块。最后，让空气流过模块，直至无残留溶液流出。将传感器从流动模块中取出，并用超纯水冲洗传感器。用氮气气流吹干传感器和流动模块，确保电极始终不接触任何液体。在化学通风橱中，将涂有二氧化硅的石英晶体传感器插入紫外或臭氧清洗仪中。打开仪器，处理至少两分钟。小心取出传感器，并将其重新放回流动模块中。打开分析仪设备以连接相关软件，并将温度设置为形成支撑性脂双层所需的理想值。等待温度稳定至设定值。配置测量参数，并在开始测量前，获取三次、五次、七次、九次、11次和13次谐波的全部传感器共振频率及耗散值。让Tris氯化钠溶液流经模块5到10分钟，确保液体中的基线频率变化（Delta F）和耗散变化（Delta D）值保持稳定。停止泵流，将进样管从Tris氯化钠溶液中取出，小心插入脂质体溶液中。反向流动5秒以排除进样管中的任何气泡，然后继续正向流动。在软件中重新启动测量以校准基线。持续通入脂质囊泡，直至在数据采集软件中实时观察到双层膜的形成。然后重复此步骤，将进样管路从脂质囊泡切换回Tris氯化钠缓冲液。向供体区室中加入5 µL脂质溶液，该供体区室为一个孔径为0.45 µm的多孔聚偏二氟乙烯96孔多屏滤板。立即将滤板浸入受体区室中，受体区室为含有300 µL磷酸盐缓冲液的转运接收板。向转运供体区室中加入200 µL磷酸盐缓冲液。按照之前的步骤，停止泵运行，将进样管更换为脂质囊泡溶液，观察双层膜的形成，然后将进样管切换至α螺旋或AH肽溶液。将该溶液引入流动模块，直至观察到因加入新溶液而导致的频率变化和耗散变化。停止泵运行，使AH肽与囊泡孵育10分钟。将进样管切换至Tris氯化钠溶液，并启动流液以清除破裂囊泡中的AH肽，从而成功形成脂双层。首先，流入分子溶剂，然后将进样管切换至含有目标分子的溶液，并持续流动至少五分钟。如需要，可停止流动，使含有目标分子的液体与脂双层孵育一段时间。将进样管路重新切换回仅连接分子溶剂。流动至少五分钟，然后将进样管路切换至Tris氯化钠溶液，继续流动至少五分钟。在软件中停止测量，保存文件，并停止泵的运行。在完成单脂质悬浮双层或多重脂质悬浮双层的前述步骤后，立即从供体滤膜板腔室中移除 PBS，并替换为 200 微升的测试溶液。随后立即浸入含有 300 微升 PBS 的新转运接收板中。在 25 摄氏度下轻轻振荡孵育两小时后，分别从供体和受体腔室中各收集 150 微升溶液。根据该分子的性质，采用适当的方法测定两个样品中的分子浓度。比较了Uni-lipid蛋磷脂PC囊泡以及两种多脂质囊泡组成的粒径、多分散性及Zeta电位。蛋磷脂PC囊泡与多脂质囊泡的粒径分布几乎相同。卵磷脂和多脂类一型囊泡均带负电荷，而多脂类二型囊泡带正电荷。单脂类卵磷脂囊泡可迅速吸附至表面，表现为频率变化降低和耗散变化升高，并随之发生自发破裂。多脂类囊泡虽可吸附至表面，但需添加AH肽以促使其破裂，从而形成脂双层结构。利用支撑脂双层，可在引入目标化合物前后分析频率变化和耗散变化。例如，已有研究探讨了邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）及环境毒物与单层和多层支撑脂膜的相互作用。对于两种类型的脂双层，观察到的DEHP吸附水平相似。然而，在不同双分子层之间观察到耗散变化的差异，其中蛋磷脂酰胆碱（egg PC）双分子层的耗散变化大于多脂类双分子层。对于单脂类和多脂类双分子层，均观察到极少的渗透现象。通过该方法，可构建多种模拟细胞的脂质双分子层，从而实现无需细胞参与的分子相互作用筛选，适用于从药物到环境毒物等多种化合物的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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