细胞模拟支持和悬浮脂质双分子层模型的组装用于分子相互作用研究

该协议中描述的脂质双层膜的构建可用于获取有关膜与药物，环境毒物甚至生物化合物相互作用的关键信息。这些技术可用于制造具有不同液体复杂性的膜，并评估膜内的化合物渗透性，吸收和嵌入。首先，将适当体积的脂质储备溶液加入干净的玻璃瓶中，以在补液后达到每毫升2.5毫克的最终囊泡浓度。

使用氮气流从脂质溶液中除去氯仿。为确保完全去除氯仿，将干燥的脂质膜连接到真空中至少四个小时。用所需体积的Tris氯化钠缓冲液重新水合干燥的脂质膜，以产生每毫升2.5毫克的最终囊泡浓度，并涡旋约15至30秒。

将囊泡悬浮液转移到装有干冰的容器中，直到冷冻约30分钟。样品完全冷冻后，在30至40摄氏度的水浴中解冻悬浮液。涡旋解冻的囊泡悬浮液。

要制造一毫升或更少的囊泡，请获得一台小型挤出机。用超纯水预湿过滤器支架，然后将其放置在O形圈内的膜支撑表面上。对第二个内部膜支撑重复上述步骤。

将一个内部膜支架定位到挤出机外壳中。将一个100纳米聚碳酸酯膜直接放在过滤器支撑上方的内部膜支架上。将第二个内部膜支架定位到挤出机外壳中，O形圈和过滤器支撑侧面向聚碳酸酯膜。

将聚四氟乙烯轴承连接到保持架结中，并用挤出机外壳将其拧紧。将挤出机夹入加热块中。将脂质囊泡悬浮液装入其中一个注射器中，并将注射器放入挤出机加热块中，将针头完全插入挤出机的一端。

将第二个空注射器插入另一侧，并使用加热块上的臂夹锁定两个注射器。慢慢地将囊泡悬浮液推入空注射器中，然后推回原始注射器中。重复20次，总共21次通过聚碳酸酯膜。

将脂质囊泡转移到干净的玻璃瓶中储存。要挤出5至50毫升的囊泡，通过将大孔筛支撑，中心盘，排水盘和聚碳酸酯膜放入挤出机下部支撑物中的空间中来组装大型挤出机。使用四个螺钉连接挤出机的上部和下部支撑并拧紧。

将挤出机单元连接到样品筒上，方法是将其擦洗到底部并用扳手拧紧以固定。在将样品加入样品筒中之前，用超纯水填充样品筒并通过挤出机单元挤出水。将脂质囊泡悬浮液加入样品筒中，并将顶部拧紧。

缓慢增加压力，直到样品开始以每秒约两到三滴的速度从挤出机单元滴入干净的玻璃中。一旦所有样品都被挤出，关闭氮气供应，并通过缓慢打开泄压阀释放样品筒中的压力。将脂质囊泡倒回样品筒中，并重复上一步9次，共10次挤出。

将囊泡悬浮液装入适当的比色皿中，然后插入动态光散射仪，输入样品详细信息，并使用相关软件进行测量。将zeta细胞放入样品室中，确保电极接触，并合上样品盒盖。在相关软件中，输入样品详细信息并收集测量值。

将二氧化硅编码的石英晶体传感器插入流动模块，确保晶体上的T形与模块上的T形对齐，并将流动模块拧紧。在具有多个腔室的仪器中，可以平行形成额外的双层。将入口和出口管连接到流量模块和泵。

将管道放入保温罩中，然后关闭分析仪系统的盖子。在泵的出口处放置一个废物容器，以收集废液。要进行清洁，请首先打开泵并将流速设置为每分钟400微升。

将进气管插入超纯水中，流经模块5至10毫升。将管道切换到 SDS，并通过模块流动 5 至 10 毫升。将管道切换回超纯水，并通过模块流动10至20毫升。

最后，将空气流过模块，直到没有剩余的溶液被收集。从流量模块中取出传感器，然后用超纯水冲洗传感器。用氮气流驱动传感器和流量模块，确保电极始终没有任何液体。

在化学通风橱中，将二氧化硅涂层的石英晶体传感器插入紫外线或臭氧清洁仪器中。打开仪器，让治疗至少两分钟。小心地卸下传感器，然后将其放回流量模块中。

打开分析仪以连接相关软件，并将温度设置为所需值以形成支撑脂质双层。允许温度稳定到所需的输入。在开始测量之前，配置测量并查找所有传感器共振频率以及泛音3、5、7、9、11和13的耗散。

让Tris氯化钠流经模块5至10分钟，确保液体中的基线频率变化或ΔF和耗散变化或Delta D值保持稳定。停止泵，从Tris氯化钠溶液中取出入口管，并小心地将其插入脂质囊泡溶液中。回流五秒钟以除去进气管中的任何气泡，然后继续向前流动。

在软件中重新启动测量以将基线归零。流动脂质囊泡，直到在数据采集软件中实时观察到双层形成。然后重复此步骤，将入口管从脂质囊泡更换回Tris氯化钠缓冲液。

将五微升脂质溶液加入供体室中，这是一个多孔聚偏二氟乙烯96孔多屏过滤板，孔径为0.45微米。立即将滤板浸入受体室，该受体室是含有300微升磷酸盐缓冲盐水的运输接收器板。将200微升磷酸盐缓冲盐水加入转运供体室。

按照前面的步骤停止泵并将入口管更换为脂质囊泡溶液并观察双层形成，然后将入口管更换为α螺旋或AH肽溶液。将溶液引入流量模块，直到从新的解决方案添加中观察到频率变化和耗散变化。停止泵，让AH肽与囊泡一起孵育10分钟。

将入口管切换到Tris氯化钠，并开始流动以从破裂的囊泡中除去AH肽，从而成功形成脂质双层。首先，流动分子溶剂，然后将入口管切换到含有目标分子的溶液中并流动至少五分钟。如果需要，停止流动，让含有所需分子的液体与双层一起孵育。

将进气管更换回分子溶剂。流动至少五分钟，然后将入口管切换到Tris氯化钠，并流动至少五分钟。在软件中，停止测量，保存文件，然后停止泵。

对于单脂悬浮双分子层或多脂悬浮双分子层，立即从供体滤板室中取出PBS，并用200微升的测试溶液替换。立即浸没在装有300微升PBS的新型传输接收器板中。在25摄氏度下温和摇动孵育两小时后，从供体和受体室收集150微升溶液。

根据该分子的性质，使用适当的方法测量两个样品中的分子浓度。比较了单脂卵PC囊泡的大小，多分散性和Zeta电位，以及两种多脂质囊泡组合物。卵PC囊泡和多脂一囊泡的大小分布几乎相同。

卵子和PC多脂一囊泡均带负电荷，而多脂两囊泡带正电荷。单脂卵PC囊泡容易被表面吸收，如频率变化减小，消散变化增加，随后自发破裂。多脂囊泡被表面吸收，但需要加入AH肽才能使囊泡破裂，导致脂质双层形成。

使用支持的脂质双分子层，可以在引入目的化合物之前和之后分析频率变化和耗散变化。例如，研究了DEHP和环境毒物与单层和多层的相互作用。两种脂质双层类型的DEHP吸收水平相似。

然而，在双分子层之间观察到耗散变化的差异，与多脂一双层相比，蛋PC双层的耗散变化更大。单脂和多脂一双层的渗透很少。按照这一过程，可以开发各种细胞模拟脂质双分子层，以实现与从药物到环境毒物等化合物的分子相互作用的无细胞筛选。