嗜碱性粒细胞活化试验在过敏诊断中的应用

嗜碱性粒细胞活化试验是一种用于评估IgE介导的过敏反应的补充性体外诊断方法，已被证明对药物、食物或吸入性过敏原引起的反应，以及某些类型的慢性荨麻疹具有应用价值。该试验基于通过流式细胞术检测嗜碱性粒细胞在过敏原或药物诱导IgE交联活化后的反应，以测定其活化标志物的表达水平。嗜碱性粒细胞活化试验可作为避免进行受控激发试验以确诊过敏的重要补充工具，尤其适用于曾发生严重危及生命反应的患者。

此外，与仅适用于少数药物和过敏原的其他体外检测方法相比，该检测的优势在于能够分析针对任何药物或过敏原的反应。该检测的主要局限性在于其敏感性未达到最佳水平，尤其是在药物过敏方面。此外，样本采集后必须在24小时内完成检测，且不同实验室之间以及诊断算法缺乏标准化。

首先，用九毫升肝素化试管采集外周血，并将样本置于转子中，于室温下保存，直至实验方案需要时使用。为阴性对照和阳性对照分别标记两支五毫升流式管。同时，为每种待测的过敏原或药物浓度分别标记一支试管。

然后将试管放入试管架中，确保试管完全贴合且不会滑动。对于第一个阳性对照，用含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液（PBS-T）配制4 µM的N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）溶液，以确认嗜碱性粒细胞的质量。对于第二个阳性对照，用PBS-T配制0.05 mg/mL的抗IgE溶液。

每20微升刺激缓冲液中加入1微升CCR3-APC、CD203c-PE和CD63-FITC抗体，配制染色混合液。然后将23微升该染色混合液加入每根试管中。向阴性对照管中加入100微升PBS-T。

向其中一个阳性对照管中加入100微升fMLP，并向另一个阳性对照管中加入100微升抗IgE E，向其余各管中分别加入100微升不同浓度的过敏原或药物，混匀后于37°C孵育10分钟。孵育结束后，轻轻向每管中加入100微升血液，避免溶血。

然后轻轻涡旋混匀各管，并在37摄氏度恒温水浴中以中等振荡强度孵育25分钟。将各管置于4摄氏度环境中至少5分钟，以终止脱颗粒反应。向每管中加入2 mL裂解缓冲液，以裂解红细胞。

涡旋混匀各管，然后在室温下孵育5分钟。在4°C条件下以300 g离心5分钟。随后将试管架倒置放入水槽中，倾倒上清液，同时细胞仍留在试管底部。

向每根试管中加入三毫升 PBS-T 以洗涤细胞，并涡旋振荡试管。使用相同的参数进行第二轮离心，然后将试管架倒置在水槽中弃去上清液。随后将样品置于 4 °C 避光保存，直至进行流式细胞术分析。

将流式细胞仪连接到计算机软件，并等待细胞仪准备就绪。按照文本稿件中的描述加载模板和仪器设置。开始样品采集过程。

为了筛选活化的嗜碱性粒细胞，首先从侧向散射-前向散射图中圈定淋巴细胞群。然后从淋巴细胞群体中圈定CCR3+CD203c+的嗜碱性粒细胞，并每管至少获取500个嗜碱性粒细胞。利用阴性对照管将CD63的阈值设定为约2.5%，随后分析样本。

通过使用变应原和药物进行嗜碱性粒细胞活化试验（BAT），研究了IgE依赖性超敏反应。通过在多个递减的变应原浓度下测定反应性来分析嗜碱性粒细胞的敏感性，以确定引起50%嗜碱性粒细胞反应的过敏浓度（EC50）。首先，从侧向散射-前向散射图中圈定淋巴细胞。

然后从淋巴细胞群体中圈选嗜碱性粒细胞，即CCR3+CD203c+细胞。接着使用CCR3-CD63图通过CD63作为活化标志物来分析两种药物及不同浓度变应原刺激下的嗜碱性粒细胞活化情况。该检测需采用新鲜全血进行，且必须在采血后24小时内完成。

检测中使用的刺激物不应包含任何辅料，且需要考虑药物的化学特性。其他用于诊断IgE介导的过敏反应的额外体外方法，或特异性IgE（sIgE）的检测，或组胺释放试验。