半翅目昆虫肠道中植物病毒与昆虫媒介蛋白的免疫荧光标记

该方案可用于研究昆虫的各种运动、昆虫蛋白质的功能以及病毒与媒介昆虫在体内的相互作用。该方法高效且信息丰富。利用激光扫描共聚焦显微镜观察时，昆虫肠道及辅助细胞的结构清晰可见。

本实验操作将由本实验室的 Lu Zhang 博士进行演示。首先，在防虫网覆盖下，将非带毒昆虫从玻璃烧杯转移到新鲜的南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）感染的水稻植株上，进行为期两天的获毒获取期。随后，将昆虫收集到含有新鲜水稻幼苗的玻璃烧杯中。

两天后，使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集昆虫，用于解剖并切除肠道。按照文本稿件中的描述，配制 0.01 摩尔 PBS、4% 多聚甲醛和 2% Triton X-100。用移液器将 100 微升 PBS 滴加到玻璃载片上，并将载片置于光学显微镜的载物台上。

使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集感染SRBSDV的成虫，并将其放入预冷的1.5毫升离心管中置于冰上，以麻痹昆虫。将一只麻痹的成虫转移至载玻片上含100 µL PBS的液滴中，使腹部朝上。用镊子夹住虫体，并用另一把镊子去除头部。

用一把镊子夹住腹部两侧，另一把镊子夹住尾部的产卵器或交配器官，然后小心地撕开一个腹节的节间膜，缓慢暴露腹部内的肠道。继续撕除节间膜，逐渐将完整的肠道从腹部拉出。轻柔地拉下与肠道末端相连的尾部，以取出完整的肠道。

将切除的肠道放入一个200微升离心管中。向管中加入200微升PBS，并用移液器彻底清洗肠道。用移液器取100微升PBS滴加到玻璃载玻片上，然后将载玻片置于光学显微镜的载物台上。

使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集感染SRBSDV的若虫，并将其放入置于冰上的1.5毫升离心管中，以麻痹昆虫。将一只麻痹的若虫转移至载玻片上含有100微升缓冲液的区域，使腹部朝上。剪除若虫尾部，然后用一对镊子轻轻夹住虫体以固定，同时用另一对镊子夹住头部。

在保持头部与肠道连接的同时，轻轻将头部从身体拉开，使头部与身体分离，但肠道仍附着在胸腹部。用镊子夹住身体保持固定，用另一把镊子小心移动头部，逐渐将肠道拉出。将肠道与头部分离，以获得完整的肠道，同时不损伤身体。

将切除的肠道组织放入离心管中。向管中加入 PBS，并用移液枪轻轻吸吹以充分清洗肠道。按照文稿中的描述准备抗体和封片介质。

将新解剖并用 PBS 清洗过的 WBPH 肠道组织放入 200 微升离心管中，加入 100 微升 4% 多聚甲醛溶液，在室温下固定。两小时后，弃去多聚甲醛溶液，加入 200 微升 PBS。10 分钟后，移除 PBS 以彻底清除残留的多聚甲醛，并重复 PBS 洗涤步骤两次。

经过两次 PBS 洗涤后，加入 200 µL 非离子型去垢剂 Triton X-100，在室温下对样品进行透化处理。30 分钟后，移除 Triton X-100，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟，以去除残留的去垢剂。用 50 µL 牛血清白蛋白将标记抗体稀释至 1:50。

将稀释后的抗体加入离心管中，在4°C条件下孵育样品过夜。去除抗体后的次日早晨，用PBS进行三次每次10分钟的洗涤，洗去残留的抗体稀释液。将1 µL DyLight 633-Phalloidin用50 µL PBS稀释，取50 µL稀释后的鬼笔环肽（phalloidin）加入离心管中，在室温下避光孵育2小时。

去除鬼笔环肽后，用 PBS 进行三次、每次 10 分钟的洗涤，彻底洗去残留的鬼笔环肽。在显微镜载玻片上滴加含 DAPI 的封片剂。将肠道组织转移至封片剂中，并轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。

用鬼笔环肽标记后，对成虫取下的WBPH肠道进行激光扫描共聚焦显微观察，结果显示肠道分为三部分：前肠、中肠和后肠。其中，中肠是SRBSDV的初始感染位点。肠道的单层上皮细胞结构有利于研究昆虫蛋白的细胞定位以及病毒蛋白与昆虫蛋白的共定位。

此处展示的是用DyLight 488标记的抗VAMP-7抗体染色的离体WBPH肠道，以及用DyLight 549标记的抗SRBSDV抗体染色的SRBSDV病毒粒子。VAMP-7与SRBSDV病毒粒子在细胞质中表现出共定位，提示VAMP-7可能在病毒的活体传播过程中发挥作用。在使用荧光素偶联抗体孵育后，应彻底清洗已透化的肠道组织，以降低背景信号和非特异性结合。

这是一种用于观察病毒、其他病原体以及昆虫蛋白质在昆虫体内定位的可靠方法，为深入研究病原体与昆虫之间的相互关系奠定了基础。