大鼠单侧坐骨神经 crush 损伤后运动行为的多因素评估

本实验方案的总体目标是描述实施不可逆性坐骨神经 crush 损伤的操作步骤，并提供一套用于评估外周创伤后运动行为的实验方法。选择一套强大且可靠的运动行为测试组合对于全面覆盖多种行为学指标至关重要，且需根据所使用的动物模型和科学研究问题而定。本方案详细介绍了如何实施坐骨神经 crush 损伤，并提供了一套用于评估大鼠运动功能障碍的行为学测试组合，包括开放场地实验、CatWalk 步态分析、横梁行走任务和梯状杆行走任务。

动物实验均依照适用的国家和机构关于动物护理与使用的指南进行。整个手术过程中须保持无菌环境。准备手术台并配备必要的器械。

在密闭柜中使用异氟烷对大鼠进行深度麻醉，并剃除右后肢大面积区域的毛发。随后，将大鼠置于麻醉面罩中，并继续使用异氟烷维持深度麻醉状态。用胶带固定大鼠的躯干和双侧后肢。

将双侧后肢置于对称伸展的位置，并使每只足掌平放于手术台上。使用适当的消毒剂对剃毛区域的皮肤进行消毒。寻找髂骨的坐骨切迹。

使用手术刀从坐骨切迹向足部方向做皮肤切口。如果后肢已固定且皮肤切口位置正确，可在臀大肌与股二头肌之间的筋膜平面观察到一个呈白色线条状的腔隙。将闭合的超细止血钳插入该腔隙，然后撑开止血钳。

筋膜平面应充分打开，同时避免损伤任何肌肉组织。将橡胶带拉钩置于肌肉下方，以保持皮肤切口开放。轻柔地清除坐骨神经周围的组织和血管，直至完全暴露坐骨神经。

在整个操作过程中，切勿拉伸或牵拉神经。使用无齿钳以稳定且快速的可用压力夹伤坐骨神经。具体操作为：打开钳子，将神经置于钳子的下钳口上，然后将钳子锁闭至第一档位置，持续 3 × 10 秒。

挤压损伤后，小心地重新打开止血钳。坐骨神经的挤压部位呈半透明状。移除橡胶带牵开器。

使用可吸收缝线缝合筋膜层切口，使用体表皮肤缝钉闭合皮肤切口。可通过旷场实验分析大鼠的运动活动及行为活动。

开放旷场实验装置应设置在黑暗且安静的环境中，包括自动化视频追踪系统EthoVision XT和一个具有抗刮擦、可清洁黑色表面的实验 arena。将 arena 和摄像机放置于正确位置，并设置好 EthoVision XT 软件。将大鼠轻柔地置于测试 arena 的中央。

记录过程中，实验人员应远离旷场实验装置，以避免对大鼠造成干扰。进行旷场实验的数据分析时，请前往左侧边栏的“分析”部分，在“结果”选项卡下选择“轨迹可视化”。接着，将所需参数导出至 XL。在软件中，从不同类别中选择多个变量用于数据分析。

通过CatWalk XT系统进行步态分析，可帮助评估动物模型足迹、站立和步态相关的多种不同参数。该系统利用绿色光源照射玻璃行走通道，动物足迹散射的光线由位于通道下方的高速摄像机捕获。所获得的信号可通过CatWalk XT软件进行分析。

实验必须在避光条件下进行。首先设置 CatWalk XT 系统，选择实验设置。

将相机放置到位并调整焦距。设置检测参数。安装 CatWalk 系统的通道侧壁，并确保侧壁与行走通道保持平行。

确定步道的长度并校准步道。接下来拍摄背景图像。背景图像需要干净且无遮挡的步道。

大鼠应无中断地穿过走道。根据预设的运行标准，每只大鼠需要完成三次符合标准的运行，方可进行数据分析。在正式开始实验前，应至少训练动物八天。

应每周至少进行一次 CatWalk 实验，每次完成 6 到 10 次运行，以确保任务表现的连续性。进行数据分析时，仅评估符合标准的运行数据。使用 CatWalk XT 软件自动分类足印。

手动检查脚印标签。修正错误的脚印标签，添加未检测到的脚印标签，并删除任何噪声和错误标签。以 XL 表格显示数值结果，展示一系列基本参数。

要获取每个足迹的更详细信息，请对后肢脚趾进行分类。此分析需要使用交互式足迹测量模块。请手动设置足迹分析的标记点。

在所有三次符合要求的运行中，分析每只后足的足印。从第一趾中心到第五趾中心画一条线，以测量趾展宽度。从第二趾中心到第四趾中心画一条线，以测量中间趾展宽度。

从后肢第三趾中心向足跟画一条线，以测量爪印长度。查看在单独工作表中显示的交互式足迹测量的数值结果。通过平衡木行走实验可评估步态缺陷。

本研究主题中的平衡木行走任务将侧重于运动协调性的分析，而非运动平衡能力的评估。进行平衡木行走任务需要准备一根平衡木、间隔器、桌子、均匀背景和一台摄像机。使用一根长度为90厘米、宽度为1.7厘米、高度为2厘米的木质平衡木。

对动物进行为期七天的训练。将大鼠放置在横梁的起始平台上，大鼠应连续三次无中断地穿过横梁。

即使大鼠在前3次运行中已达到3次合格运行，也应完成至少6到10次运行，以确保任务表现的连续性。从录像中选取3次合格运行的视频片段，并确定所选3次合格运行的开始时间点和结束时间点。

此处，起始时间点以横梁上的黑线标记，后肢首次置于黑线后方定义为运行的起始时间点。运行结束时，后肢首次接触横梁末端平台的位置定义为结束时间点。接下来，计算大鼠通过横梁所需的时间。

使用软件的放大和慢放功能，分别对后肢三次符合要求的运行过程中的步数和错误次数进行评分。错误包括完全足滑和半足滑。完全足滑定义为足部放置后发生深度滑动，导致受影响的爪子与横梁失去接触。

半滑是指足部从横梁侧壁滑落但未完全脱离接触。计算足部打滑次数占通过横梁所需步数的百分比。梯格行走任务可用于评估运动功能、前肢和后肢的落脚位置以及肢体间的协调性。

进行此项行为学实验需要梯子横档装置、垫片、桌子、均匀背景和摄像机。水平字母形横档装置由金属横档和透明聚碳酸酯侧壁组成。对动物进行为期八天的训练。

将大鼠放置于梯 rung 装置的起始区域。大鼠需连续三次穿越梯 rung 装置100厘米的行走路径，且中途不得停顿，方可视为一次合格的运行。从录像中选取三次合格运行的视频片段。

确定所选三次合格运行的开始时间点和结束时间点。当后肢置于装置侧壁上第一条黑线后方时，定义为运行的开始时间点；当前肢中第一个肢置于装置侧壁上第二条黑线后方时，定义为运行的结束时间点。

接下来，计算在走道上行走过程的持续时间。使用软件的慢动作或逐帧播放功能，根据Mets及其同事提出的7级评分标准，对三次符合要求的行走过程进行评分。针对每个肢体，分别根据该评分标准的各个类别，确定步数和错误次数。

该量表区分以下类别：完全失误、严重疏漏。

轻微滑动。替换。校正。部分放置。以及正确放置。

接下来，计算每一步的误差。5分钟开放场地实验的代表性结果表明，在手术后五周，神经 crush 损伤对运动活动没有影响。使用 CatWalk XT 系统进行步态分析可生成多种不同参数。

在神经损伤的右后爪的平均跑步速度、步长和足迹面积方面，可检测到显著变化。与未受损伤的野生型大鼠相比，神经损伤的野生型大鼠在损伤后五周穿越横梁的潜伏时间显著延长。作为横梁行走任务的另一项读数，统计了神经损伤后肢的完全滑落和半滑落次数，并将其视为统计分析中的错误指标。

与野生型未损伤大鼠相比，坐骨神经损伤的野生型大鼠其右侧后肢每步行一步的错误率显著升高。梯格行走任务的代表性数据显示，在穿越梯格装置行走通道的潜伏时间方面，或在坐骨神经损伤右侧后肢每步的错误率方面，均未显示显著改变。对坐骨神经损伤后肢每步错误率的分析，仅考虑了Mets及其同事提出的7级评分标准中0至2分的评分结果。

观看本视频后，您应能够充分理解如何实施坐骨神经 crush 损伤，以及如何对单侧坐骨神经 crush 损伤后的 rats 进行多因素运动行为评估。为了在坐骨神经 crush 损伤后获得一致、可重复且可比较的结果，必须采用标准化的方法来诱导神经损伤，以及进行标准化的表型特征分析。针对特定行为学测试的适当培训，有助于在实验评估过程中节省时间并获得更优的结果。