使用接近-连接-测定法对不同流体剪切应力条件下TGFβ/BMP/SMAD信号传导的可视化和定量
September 14th, 2021
在这里，我们建立了一个方案，使用暴露于病理和生理流体剪切应激条件下的内皮细胞中的接近连接测定（PLA）同时可视化和分析多个SMAD复合物。
该协议使科学家能够定量比较不同剪切应激条件下转录因子复合物的数量，并且有利于血管生物学的研究。该协议的主要优点是使用微流体流道，允许同时研究多个抗体对，包括相应的对照。首先，通过将PBS中制备的0.1%猪皮明胶加入通道中，在37摄氏度下涂覆六通道载玻片30分钟。
从明胶溶液中清空通道，并在预编码的六通道载玻片中以2.5倍10到每毫升第六个细胞的密度在30微升M199完整培养基中播种Huvecs。让细胞在37摄氏度下在加湿的培养箱中粘附一小时。向每个储液槽中加入60微升预先警告的M199完整培养基。
在37摄氏度下将细胞在24小时后在加湿的培养箱中培养两天，并置换培养基。将硅管安装在流体单元上，用至少10毫升预先警告的M199完整介质填充储液罐。将带有管路的流体装置连接到泵系统，并在没有电池的情况下进行预运行，以平衡介质并去除任何剩余的空气。
使用串行连接管连接六个通道滑道上的单个通道。将滑块上的第一个和最后一个通道连接到安装在流体装置上的管子。对于细胞暴露于高水平的纯粹应力，请通过适应阶段逐步增加纯粹应力，以每30分钟每平方厘米5个测功元的增量设置步进。
在流体剪切应力暴露后，使用管道上的团块将载玻片从泵上拆下，避免培养箱中的介质溢出，并在冰上转移流动载玻片。将管道从储液槽中分离出来时，用手指关闭储液槽的另一侧，以避免将气泡困在通道中。保持流动在冰上滑动，小心地从储层中吸出培养基，而不是从细胞所在的通道吸出。
将PBS加入一个储液槽中，用90微升冷无菌PBS洗涤样品，并从另一个储液槽中小心地吸出，然后对所有通道重复。通过将90微升缓冲的4%PFA溶液添加到添加PBS的同一储液槽中来固定细胞，并如图所示从另一个储液罐中吸出液体。将细胞固定在所有六个通道中后，将样品从冰转移到室温，并孵育20分钟。
用PBS洗涤细胞三次，方法是将PBS添加到一个储液槽中，并在所有通道中小心地将其从另一个储液槽中吸出，注意不要使通道变干。通过将PBS中制备的90微升环境15毫摩尔氯化铵添加到其中一个储液槽中来淬火访问PFA。从另一个储液槽吸出并孵育细胞10分钟。
通过在空储液器中加入在PBS中制备的90微升0.3%Triton X 100来透化细胞。从另一个储液槽吸出每个通道并孵育10分钟，然后如前所述用PBS洗涤三次。在90微升无菌PLA封闭溶液到一个储液器。
从另一侧吸出每个通道，并在加湿室中以37摄氏度孵育一小时。在PLA抗体稀释剂和涡流中添加一抗。小心地从储液槽和通道中吸出阻塞溶液。
在加入溶液的同时，通过倾斜载玻片，立即将30微升一抗溶液加入空通道中。对所有通道重复上述步骤，并在加湿室中以4摄氏度孵育过夜或在37摄氏度下孵育一小时。稀释减去兔和加小鼠PLA探针一至五的PLA抗体稀释剂。
通过加入90微升洗涤缓冲液A并吸气来洗涤所有通道两次，如图所示。吸出洗涤缓冲液后，加入30微升PLA探针溶液，在加湿室中孵育。在D离子水中稀释连接缓冲液1至5，并在稀释的连接缓冲液中稀释一至40的莱格斯酶。
洗涤并完全吸出洗涤缓冲液A后，在倾斜载玻片的同时向空通道中加入30微升连接溶液，并在加湿室中孵育。在去离子水中稀释扩增缓冲液一至五，然后在冰上稀释的扩增缓冲液中稀释一至80聚合酶。洗涤并完全吸出洗涤缓冲液A后，在倾斜载玻片的同时向空通道中加入30微升扩增溶液，并将其在加湿室中孵育。
将DAPI稀释至500洗涤缓冲液B中，并通过加入90微升含有洗涤缓冲液B的DAPI并吸气以蒸煮细胞核来洗涤所有通道一次。然后用不含DAPI的洗涤缓冲液B洗涤所有通道一次。将洗涤缓冲液B在去离子水中稀释一至10，并用90微升稀释的洗涤缓冲液B洗涤所有通道一次.吸出洗涤缓冲液B后，立即向一个储液器中加入两到三滴液体安装介质，并倾斜载玻片以在所有通道中分布安装介质。
将样品以四摄氏度储存在潮湿的环境中，直到成像。Huvecs暴露在高和低的纯粹压力下。低剪切应激增加了细胞质基质和细胞核中的SMAD蛋白相互作用。
单抗体对照显示的信号很少，证明了实验的成功。抗体浓度的增加导致每个细胞的PLA事件数量增加，但高纯度和低纯度暴露细胞之间的PLA信号差异减小。用于封闭和抗体稀释的自制缓冲液可用作商业缓冲液的替代品。
对PLA事件进行商业和自制稀释剂和阻断溶液的定量，在胞质和核区域显示出相同的PLA信号模式。然而，使用商业解决方案时，每个细胞的PLA事件总数更高。SMAD Two/Three，SMAD Four抗体的组合用于SMAD Four抗体不适合免疫荧光实验的地方。
在实验性与对照条件下，PLA事件没有差异，表明选择正确的抗体组合检测PLA事件的重要性。所描述的方案可以适应于检测与SMAD不同的转录因子复合物的相互作用，因此有助于理解易发生和动脉粥样硬化保护条件下的基因调控。
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概述
该协议使得在不同剪切应力条件下能够在内皮细胞中可视化和分析多个SMAD复合物。它对血管生物学研究人员特别有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 血管生物学
- 细胞生物学
- 生物物理学
背景
- 理解SMAD复合物在内皮细胞中的作用对血管研究至关重要。
- 剪切应力影响细胞反应和信号传导途径。
- 近接连接分析（PLA）允许检测蛋白质相互作用。
- 微流控技术提高了实验精度。
研究目的
- 建立在不同剪切应力条件下分析SMAD复合物的协议。
- 促进转录因子复合物的定量比较。
- 改善对内皮细胞对流体动力学响应的理解。
使用的方法
- 用猪皮明胶涂覆微流控通道。
- 在预编码的六通道载玻片上接种Huvecs。
- 孵育细胞以促进粘附。
- 应用M199完全培养基维持细胞。
主要结果
- 成功可视化内皮细胞中的SMAD复合物。
- 剪切应力下转录因子相互作用的定量数据。
- 微流控流道有效性的证明。
- 对生理和病理条件下细胞反应的洞察。
结论
- 该协议提供了一种研究内皮细胞中蛋白质相互作用的稳健方法。
- 它增强了对血管生物学和剪切应力效应的理解。
- 这种方法可以应用于各种涉及流体动力学的研究场景。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of TGFβ/BMP/SMAD signaling under defined fluid shear stress conditions addresses a critical need for mechanistic de-risking in vascular target validation. This workflow enables precise measurement of transcription factor complex formation, supporting predictive confidence in early discovery and translational vascular research. The approach is directly relevant for portfolio decisions in atherogenesis and vascular pathology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of TGFβ/BMP pathway activation under physiologically relevant shear stress conditions.
- Supports functional target validation by quantifying SMAD complex formation in endothelial cells.
- Facilitates mechanistic de-risking for vascular disease targets by distinguishing atheroprone and atheroprotective signaling states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated endothelial cell systems for downstream screening of pathway modulators.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of transcription factor interactions using PLA and fluorescence microscopy.
- Enables simultaneous analysis of multiple antibody pairs and controls within microfluidic flow channels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro shear stress models with disease-relevant vascular conditions for translational biomarker studies.
- Provides continuity from discovery-stage pathway interrogation to preclinical validation of vascular targets.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting TGFβ/BMP signaling in vascular pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for vascular biology, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Quantifies SMAD complex formation to clarify pathway activation under defined shear stress.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible endothelial systems for compound evaluation.
- Analytics: Generates spatial and quantitative readouts of protein-protein interactions for comparative analysis.
- Translational Research: Models disease-relevant shear stress to inform biomarker and target validation strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable workflow for other transcription factor complexes and signaling pathways in vascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales quantitative protein interaction assays across multiple conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in vascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets and candidate advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture and microfluidic system operation.
- Needs access to fluorescence microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous antibody validation and control selection for PLA specificity.
- Adaptable to different transcription factor complexes and fluid shear stress models.
- Performance may vary with antibody combinations and buffer formulations, as shown by control experiments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:40
Cell Culture and Fluid Shear Stress Exposure
2:55
Fixation
4:58
Blocking and Incubation with Primary Antibody
6:28
Incubation with PLA Probe and Ligation
7:34
Amplification and Mounting
9:14
Results: Effect of Shear Stress on the SMAD Protein Interactions
11:02
Conclusion
