Name: 一 种研究 并靶向乳腺癌脑转移性肿瘤生长的离体脑切片模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习利用离体脑切片模型研究乳腺癌脑转移性肿瘤生长并靶向治疗的方法。该技术可在维持脑肿瘤微环境生理相关性的条件下快速检测多种药物和放疗效果。

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感谢 Julia Farnan、Kayla Green 和 Tiziana DeAngelis 提供的技术支持。本工作部分由宾夕法尼亚州通用研究增强拨款计划（MJR、JGJ）、UO1CA244303（MJR）、R01CA227479（NLS）、R00CA207855（EJH）以及 W.W. Smith 慈善信托基金（EjH）资助。

本方案已获得德雷塞尔大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其动物护理指南。本研究使用了6至8周龄的雌性Nu/Nu裸鼠。
1. 肿瘤细胞的颅内注射
<ol>
	<li>将所有器械（镊子、剪刀、缝合剪、手钻）放入灭菌袋中，在高压灭菌器内进行干热灭菌循环，时间最长为45分钟，同时包含灭菌指示剂。若对多只动物进行手术，每次更换动物时需使用加热珠灭菌器对器械进行灭菌（最多3次）。</li>
	<li>根据使用者的动物护理方案对小鼠实施麻醉（例如异氟烷，诱导浓度4%，维持浓度1-2%），并在手术开始前给予镇痛处理（皮下注射，0.1 mL，剂量为0.1 mg/kg的缓释型丁丙诺啡SR-LAB）。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否适宜。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪中，使用标准耳杆固定头部（图1A），并在&#160;眼睛表面涂抹眼用软膏。</li>
	<li>在切口前，交替使用碘伏棉签和70%乙醇对头部表面进行三次重复消毒。</li>
	<li>使用手术刀沿假想中线（将小鼠大脑分为左右对称两半的虚拟线）呈轻微斜角做一条长约1 cm的正中切口，以暴露颅骨。用棉签擦去血液。</li>
	<li>将皮肤向侧方牵开，暴露注射部位：以颅骨前囟为参考点，向右2 mm，向前1 mm（+2 内外侧方向 (+2ML)，+1 前后方向 (+1RC)）。</li>
	<li>使用直径0.73 mm的磨钻钻头，在前囟点+2ML、+1RC处施加轻微压力并旋转钻孔，穿透颅骨。</li>
	<li>使用脑部注射器，将5 µL含100,000个MDA-MB-231BR细胞（稳定表达GFP-荧光素酶）/µL的无菌1×PBS溶液注入脑内，初始进针深度为3.5 mm。</li>
	<li>让注射器静置2分钟，然后缓慢上提约1 mm，再静置2分钟后，缓慢注入第一半体积的细胞悬液。</li>
	<li>在注入剩余液体前再等待2分钟，最终注射完成后3分钟再缓慢拔出注射器。 
	注意：缓慢注射是经验性操作，有助于液体被脑组织充分吸收，避免拔针后发生渗漏，从而防止癌细胞在目标区域外生长。</li>
	<li>在颅骨注射部位涂抹骨蜡，随后使用聚丙烯缝线缝合组织。麻醉停止后，小鼠通常在5分钟内恢复意识。</li>
	<li>术后立即观察其行为约10分钟，3小时后及次日再次观察，判断是否需要特殊护理措施（如生理盐水注射、软质食物等）以促进快速恢复。</li>
	<li>通过成像系统进行生物发光成像以监测肿瘤生长情况。
	<ol>
		<li>首先，打开成像系统的氧气和异氟烷气源，使气体输送至成像箱外的独立麻醉室。</li>
		<li>然后启动软件，初始化仪器，并选择适合整体小鼠成像的选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠放入含有异氟烷的独立麻醉室中，通过脚趾夹捏测试确保麻醉深度适宜，随后经腹腔注射200 µL浓度为30 mg/mL的荧光素溶液。</li>
	<li>将小鼠腹部朝下转移至成像室的鼻罩接口处，该接口持续供应氧气和异氟烷。关闭成像室，设置曝光时间为2分钟，开始成像。</li>
	<li>使用软件中的ROI（感兴趣区域）工具定量分析肿瘤的生物发光信号。</li>
	<li>为分析肿瘤大小，选择圆形工具，将其调整至覆盖肿瘤的形状与范围，测量ROI并记录总信号值。</li>
	<li>允许实体瘤生长12–14天（或直至荧光素酶信号达到约7.0 × 106 单位）（图1B），然后制备脑切片。 
	注意：增加注射细胞数量将加快肿瘤生长速度，因此脑切片制备可早于12天进行；相反，若允许肿瘤生长至14天，则可获得更多的GFP阳性切片。超过14天后，小鼠健康状况会迅速恶化，因此自第10天起应将健康监测频率提高至每日一次，任何出现疼痛和/或不适症状的小鼠应及时用于脑切片制备。</li>
</ol>
2. 制备脑切片
注意：脑组织分离后的所有操作步骤均须在无菌超净工作台中进行。通常情况下，一只注射了MDA-MB-231BR细胞的小鼠可获得35–40个含有肿瘤细胞（荧光素酶信号）的独立脑片（图1C）。
<ol>
	<li>在高压灭菌器中对所有手术器械进行灭菌。将组织切片器置于无菌超净工作台内，并使用70%乙醇清洁所有器械和仪器。</li>
	<li>颅内注射 MDA-MB-231BR 细胞后 12–14 天，根据用户单位的动物护理方案（如 1.2 节所述）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否适宜。</li>
	<li>迅速取出大脑（在45秒内）并立即放入冰冻（4 °C）的蔗糖-ACSF溶液中，其成分为：280 mM 蔗糖，5 mM KCl，2 mM MgCl₂2，1 mM CaCl2，20 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，5 mM Na+-抗坏血酸，3 mM 硫脲，2 mM Na+，29 mM 丙酮酸盐；pH = 7.3。</li>
	<li>使用锋利且无菌的手术刀或剃须刀片，从各个方向（包括脑组织底部）切除不含肿瘤的多余脑组织部分。</li>
	<li>将脑组织修整为接近立方体的形状，置于60 mm培养皿盖内浸有ACSF的滤纸上，使其平稳放置，便于切片。 
	注意：在切片前需切除肿瘤不易生长的脑部多余组织，以获得 predominantly GFP+ 的切片，并使脑组织形成稳定的形状，能够稳固地放置于仪器表面，避免切片过程中因振动而发生移位。</li>
	<li>将数张用ACSF预湿的滤纸片放置在切片平台上，然后将组织块置于其上。</li>
	<li>将仪器上的切割尺寸设置为所提供标尺上的2或2.5单位，以将组织切成200–250 µm的切片。 
	注意：厚度在100 µm至350 µm范围内的切片均具有活性。对于切片 &#60;200 µm，使用振动切片机或压缩切片机。</li>
	<li>使用貂毛画笔将脑切片转移至含有蔗糖人工脑脊液（sucrose ACSF）的培养皿中，并在体视显微镜下用27 G针头分离切片。</li>
	<li>在荧光显微镜下鉴定GFP阳性脑片，使用无菌的1 mL断口移液管（宽口）将其转移至新的60 mm培养皿中，培养皿内含2–3 mL成年脑片培养基（Neurobasal medium A、2% B12补充剂、1% N2补充剂、1%谷氨酰胺、0.5%葡萄糖、10 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。 
	注意：包含肿瘤细胞在脑表面生长的脑切片（可能由于细胞注射泄漏等原因造成）将被排除。</li>
	<li>将3-5个切片转移至每个6孔板中直径为30 mm、孔径为0.4 µm的组织培养插入式培养皿上，切片之间保持一定距离，避免相互接触生长。</li>
	<li>使用 P1000 移液器移除插入物表面多余的培养基，于每个插入物下方加入 1 mL 成年小鼠脑片培养基，并在切片前将培养基于培养箱中平衡。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育组织2, 并在成像前于95%湿度下培养24小时。</li>
</ol>
3. 切片的IVIS成像
注意：荧光素酶和抑制剂的添加步骤需在无菌的层流罩中进行。
<ol>
	<li>用镊子轻轻提起小室，将5 µL浓度为30 mg/mL的荧光素溶液加入小室下方的培养基中，加样完毕后将小室放回孔中。</li>
	<li>将6孔板连同盖子一起放入成像仪的成像室内，置于固定相机下方，并锁紧室门。</li>
	<li>打开软件并初始化仪器。</li>
	<li>选择合适的相机设置，使每次成像仅显示一个孔的视野。将载物台上升（视野范围5 cm），并将需要成像的孔准确置于相机正下方。</li>
	<li>根据肿瘤表达的荧光素酶信号强度设置合适的成像时间，通常在10秒至5分钟之间。建议初始设置为10秒，若信号较弱可逐步延长，但在整个实验过程中对所有时间点和实验条件应保持成像时间一致（图1D）。</li>
	<li>使用ROI工具（圆形工具），将其调整至与肿瘤的形状和大小相匹配，测量该区域，并记录总信号值，以定量分析每块组织切片上肿瘤的生物发光信号。</li>
	<li>将6孔板移回无菌超净工作台，用镊子轻轻将小室从孔中提起。</li>
	<li>吸除旧培养基，加入1 mL新鲜培养基，并将小室重新放回孔中。</li>
	<li>对于需要给予不同化合物（如抑制剂、代谢物等）处理的实验，先在1.5 mL离心管中用1.2 mL脑片培养基配制适当浓度的试剂，然后将1 mL该溶液转移至含有组织切片的孔中。</li>
	<li>在研究期间，每隔48小时重复一次上述操作。</li>
</ol>
4. 肿瘤生长的活体成像 离体 脑切片
注意：插入物需加入足量培养基（1.5 mL），以维持整个实验期间的需求，因为在活细胞成像过程中无法补充额外培养基。
<ol>
	<li>将6孔板放置于培养箱内的自动显微镜载板架上（37 °C，5% CO2, 和95%湿度）。</li>
	<li>打开软件，在第一象限开启明场，调整观察切片所需的曝光度。为确定切片的位置（坐标&#34;xy&#34;），在第二象限使用&#34;xy&#34;来控制显微镜的&#34;xyz&#34;坐标。</li>
	<li>选择6孔板作为本实验所用耗材。选择ROI地图编辑器，并通过添加新的ROI来注册该位置，然后保存该ROI。</li>
	<li>对其他孔中的所有其他感兴趣区域重复上述步骤。在添加完所有ROI后，保存全部ROI。</li>
	<li>在“协议”（Protocol）中选择清除现有，在采集下选择延时成像，然后选择感兴趣的通道（本例中为GFP）。</li>
	<li>在聚焦设置中关闭自动对焦，并手动为所有切片调整至合适的焦距。最后，将明场强度、荧光通道激发和曝光时间调节至适当水平。</li>
	<li>设置协议以每15分钟采集一次图像，持续48小时。</li>
	<li>保存并运行该协议。实验结束后，保存的文件将包含为每个ROI采集的明场和GFP图像。</li>
	<li>为将图像合成为视频，将所有感兴趣图像重命名为相同的名称，后接二进制编号，以便按采集顺序排列（例如：ROI1 (1)，ROI1 (2) ...）。</li>
	<li>打开ImageJ，点击文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列来导入图像。在出现的文件列表中选择相应文件，并将文件名内容填写至弹出的文件名包含框中，以识别选定用于视频的文件。</li>
	<li>在文件 &#62; 另存为 &#62; AVI下保存合并后的图像。</li>
</ol>
5. MTS 检测与免疫组织化学分析 离体 脑组织
<ol>
	<li>MTS 检测
	<ol>
		<li>通过沿组织边缘切割组织培养膜下方的方式取出切片，并将仍附着于膜上的组织转移至96孔板中。</li>
		<li>加入按1:5比例与培养基混合并含有0.01%吐温（Triton）（1×）的MTS试剂，以促进溶液渗透入组织，每孔总体积为120 µL。</li>
		<li>使用4%多聚甲醛（PFA）作为使脑切片失活的试剂，作为本实验的阳性对照。在进行MTS检测前，将目标脑切片在4% PFA中室温孵育1小时，或4 °C过夜。</li>
		<li>使MTS试剂与切片反应4小时，随后将切片从孔中取出，测量所有条件下的吸光度（490 nm），包括无切片的空孔作为参考。</li>
		<li>将读数表示为组织切片面积的函数，面积使用数显卡尺测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学制备
	<ol>
		<li>将附着于膜插件表面的脑切片在4 °C条件下浸入10%福尔马林中过夜。</li>
		<li>进行包埋、处理、封闭，并制备未染色的组织切片。采用标准免疫组织化学染色方案对H&amp;#38;E、Ki-67、γ-H2AX、CC3、GFAP、GFP、DAPI进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 肿瘤照射 离体 脑切片
<ol>
	<li>用6 Gy（310 kVp X射线）照射肿瘤。 
	注意：在考虑R单位（使用Victoreen静电计测量）以及对指形电离室、空气密度和cGy/R的校正后，获得6 Gy总剂量所需的单位为3522单位18。照射时间为130.9秒。</li>
	<li>使用0.25 mm铜 + 1 mm铝附加滤过，源-皮肤距离（SSD）为50 cm，剂量率为125 cGy/分钟。</li>
	<li>通过已与一级标准校准的束内电离室进行剂量测定。</li>
	<li>每日对湿度、温度和大气压进行校正。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无经济利益冲突。

本研究建立了一种新的ex vivo脑组织培养方法，用于移植性异种脑肿瘤的体外培养。我们证明，将MDA-MB-231BR乳腺癌脑转移（BCBM）细胞经颅内注射至小鼠脑内后，这些细胞可在ex vivo脑切片中存活并生长。本研究还测试了经颅内注射的U87MG胶质母细胞瘤（GBM）细胞，同样发现这些癌细胞可在脑切片中存活并增殖（数据未显示）。我们认为，该模型不仅可用于BCBM和GBM，还可拓展至其他易发生脑转移的癌症类型，包括肺癌和黑色素瘤。选择乳腺癌嗜脑细胞进行颅内注射，是因为该方法操作简便、成瘤快速，且被公认为适用于脑大转移灶研究的合适模型25。然而，类似的肿瘤切片模型也可通过心内接种或原位注射至乳腺脂肪垫的方式建立。通过在无血清培养基中培养成年脑切片，并每48小时更换新鲜培养基，优化了培养条件，从而更好地维持了组织活性以及肿瘤的存活与生长。在培养箱高氧条件下使用的0.4 µm插入式培养插件，既为ex vivo脑切片提供了结构支撑，也实现了营养物质和氧气的人工供给，弥补了缺乏血液供应的不足，该系统似乎足以维持组织活性至少十天。活体成像通过G...

乳腺癌脑转移（BCBM）是指细胞从原发性乳腺肿瘤扩散至大脑而形成的继发性病灶。乳腺癌是继肺癌之后导致脑转移的第二大常见原因，约有10-16%的患者会出现脑转移1不幸的是，脑转移仍然无法治愈，因为 &#62;80%的脑转移患者在确诊后一年内死亡，且由于神经功能障碍导致其生活质量下降2迫切需要找到更有效的治疗方案。单层二维或三维培养模型是实验室中测试治疗药物最常用的方法。然而，这些模型无法模拟复杂的脑转移性肿瘤微环境，而该微环境是肿瘤表型和生长的主要驱动因素。尽管这些模型具有一定价值，但它们未能再现复杂的肿瘤-基质相互作用、独特的代谢需求以及肿瘤的异质性3为了更真实地模拟肿瘤-间质相互作用及微环境异质性，本课题组及其他研究团队已开始构建类器官脑转移模型 &#34;切片&#34; 使用患者来源的肿瘤细胞（原发性或转移性）或癌细胞系进行培养4,5,6与经典方法相比 体外 系统，这种短期 离体 该模型可能在大动物群进行临床前评估之前，为筛选新的治疗方法提供更相关的条件。
离体（ex vivo）模型已被构建并成功应用于多种癌症治疗方案的筛选。该模型仅需数天即可完成评估，还可针对患者个体化药物筛选进行定制。例如，人膀胱癌和前列腺癌的离体（ex vivo）组织已显示出对多西他赛和吉西他滨呈剂量依赖性的抗肿瘤反应7。类似地，结直肠癌离体（ex vivo）组织模型已被用于奥沙利铂、西妥昔单抗和帕博利珠单抗等化疗药物的筛选8。鉴于胰腺导管腺癌的基因型和表型特征与其间质微环境之间存在重要相互作用，该技术已在胰腺癌研究中得到广泛应用9,10。此外，类似的器官型模型也已用于头颈部肿瘤、胃癌及乳腺癌等肿瘤的药物筛选研究11,12。
此处，一种 离体 在微环境中外植乳腺癌脑转移瘤细胞的脑切片模型正在构建中。小鼠经颅内注射乳腺癌脑转移嗜脑性 MDA-MB-231BR 细胞13 大脑皮层顶叶——三阴性乳腺癌转移的常见部位14,15 并允许其形成肿瘤。从这些异种移植动物中制备脑切片并进行培养 离体 如所述的类器官培养16,17. 这一新型 离体 该模型可用于分析脑实质内BCBM细胞的生长情况，并可用于测试治疗药物及辐射对脑微环境中肿瘤细胞的作用效果。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器，滑动接头</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>杰内西</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>自动化显微镜和LUMAVIEW软件</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27（GEM21）</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 烧杯</td><td>Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>细尖貂毛画笔，5/0号</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>脑内注射注射器</td><td>Hamilton Company</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>裂解型caspase 3抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>滤纸（#1），定量圆片，4.25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>细毛獾毛画笔 #2/0</td><td>电子显微镜科学</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>γ-H2AX 抗体</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺（200 mM）</td><td>康宁 CellGrow</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;amp;E 和 KI-67</td><td>杰斐逊核心设施病理染色</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型手持电钻套装及微小麻花钻头</td><td>Amazon</td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>仅用于小鼠的立体定位仪框架</td><td>Harvard Apparatus（美国马萨诸塞州霍利斯顿）</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>大型手术剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231BR 细胞</td><td>由 Patricia Steeg 博士惠赠</td><td>参考文献 &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;&amp;middot;&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>小鼠成像设备</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS 200 系统</td><td></td></tr><tr><td>小鼠成像软件</td><td>Caliper Life Sciences（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>Living Image 软件</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Tecan Spark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封片液</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS试剂</td><td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td><td>（货号：G3582）</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nu/Nu 裸鼠</td><td>查尔斯河实验室（美国马萨诸塞州威尔明顿）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯缝合线</td><td>Medex 供应</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签</td><td>DME Supply USA</td><td>产品编号：689286X</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #11（每包 100 片）</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>刮勺/探针</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS 双面未涂层剃须刀片（American Safety Razor Co (95-0043)）</td><td>VWR</td><td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>组织切片刀</td><td>Brinkman</td><td>（McIlwain型）</td><td></td></tr><tr><td>组织培养小室</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50 或 PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>X射线机</td><td>精确 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一个 离体 脑切片模型用于研究和靶向乳腺癌脑转移肿瘤生长

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

脑转移是女性乳腺癌的严重后果，因为此类肿瘤难以治疗，且与不良的临床预后相关。乳腺癌脑转移（BCBM）生长的临床前小鼠模型虽具研究价值，但成本较高，且难以实时追踪脑实质内的活细胞及肿瘤细胞侵袭过程。本文介绍了一种方案 离体 来自颅内注射乳腺癌嗜脑克隆亚系的异种移植小鼠的脑切片培养物 MDA-MB-231BR 将表达荧光素酶标记的细胞颅内注射至 Nu/Nu 雌性小鼠脑内，待肿瘤形成后，分离脑组织并进行切片和培养 离体对肿瘤切片进行成像，以鉴定表达荧光素酶的肿瘤细胞，并监测其在脑实质中长达10天的增殖与侵袭情况。此外，本方案描述了利用延时显微成像技术，观察肿瘤细胞在接受电离辐射或化疗处理后的生长及侵袭行为。通过活体成像显微技术、生物发光强度测定以及含BCBM细胞的脑切片组织学分析，可直观评估肿瘤细胞对治疗的反应。因此，该 离体 脑切片模型可能是一种有效的平台，可用于快速单独测试新型治疗药物，或将其与放疗联合使用，以筛选出针对个体患者乳腺癌脑转移在脑微环境中的个性化靶向药物。

如上所述（图1A），将MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase细胞颅内注射至4-6周龄Nu/Nu小鼠的右侧大脑半球，并让其生长12-14天，在此期间通过生物发光成像监测肿瘤生长情况（图1B）。我们按照其他研究团队报道的方法颅内注射100,000个癌细胞19，但也可低至注射20,000个细胞20。在生成脑切片后（图1C），如上所述，将切片置于IVIS系统中成像，通过24小时孵育后的生物发光成像确认肿瘤的存在，此时间点记为第0天。每48小时定量检测一次生物发光信号以监测肿瘤生长，结果显示在6天内呈进行性生长（图1D）。H&amp;E染色与GFP阳性荧光证实脑切片中存在肿瘤（图1D）。我们还检测到反应性星形胶质细胞的染色增强，通过胶质纤维酸...

我们介绍了一种在器官型脑切片模型中实时测量乳腺癌脑转移细胞对药物和辐射反应的实验方案。该方法提供了一种定量分析手段，可在脑微环境界面中以离体（ex vivo）方式研究不同治疗手段对乳腺癌脑转移灶的治疗效果。

脑转移是女性乳腺癌的严重后果，因为这些肿瘤难以治疗，且与不良的临床预后相关……

该方案可用于形成脑转移性肿瘤细胞，并制备脑组织离体切片，从而实现对已形成肿瘤的药物疗效和放射治疗的快速检测。该技术的主要优势在于能够在维持脑-肿瘤-宿主相互作用的生理相关环境中，快速测试多种药物或治疗方法。该方法有助于理解脑转移性细胞如何生长、存活并侵入脑实质，并有助于阐明脑肿瘤微环境在癌症生长与扩散中的作用。演示该操作的将是来自我实验室的博士研究生 Lorela Ciraku 和 Emily Esquea。首先，将麻醉后的小鼠放入立体定位仪中，并使用标准耳杆固定头部。在切口前，通过交替重复使用碘棉签和 70% 乙醇对头部表面进行三次消毒。使用手术刀，沿假想的中轴线以对角方向在小鼠颅骨上做一厘米长的正中切口，该中轴线将小鼠大脑分为两个对称的半球，以暴露颅骨。用棉签擦去血液后，将皮肤向侧方牵开，暴露注射部位。使用0.73毫米钻头，施加轻微压力并配合旋转动作，穿透颅骨钻孔。为了注射5 µL稳定表达GFP荧光素酶的细胞，将高精度注射器插入脑内深度达3.5毫米处。静置2分钟，然后将注射器上提约1毫米。再等待2分钟后，缓慢注入前半部分体积的细胞悬液，之后继续等待2分钟，再注入剩余的体积。三分钟后，缓慢抽出注射器。在颅骨注射部位涂抹骨蜡，并使用聚丙烯缝线缝合组织。术后定期观察小鼠行为，以确定是否需要特殊处理措施，包括注射生理盐水和提供软质食物，以促进其快速恢复。为了通过生物发光成像监测肿瘤生长，首先打开成像系统的氧气和异氟烷，并使两者输送至成像箱外的独立腔室。然后，启动软件并初始化仪器后，选择合适的选项以可视化和捕获整只小鼠身体的图像。接下来，将小鼠转移至提供氧气和异氟烷的成像箱外腔室中。 当小鼠进入麻醉状态后，通过腹腔注射给予每只小鼠 200 微升浓度为 30 毫克/毫升的荧光素酶底物（luciferin）。将小鼠放入成像室，腹部朝下紧贴成像室的鼻部凸缘。锁定成像室，选择两分钟曝光时间开始成像，随后完成成像过程。将组织切片机放入无菌超净工作台后，用70%乙醇清洁所有工具和仪器。处死小鼠后，迅速取出脑组织并置于冰冻的蔗糖-人工脑脊液（ACSF）溶液中。使用刮铲将脑组织转移至60毫米培养皿盖内经ACSF润湿的滤纸上。使用锋利且无菌的剃须刀片切除脑组织中不含肿瘤的多余部分，包括脑底部，使脑组织外形接近一个不规则的立方体。将数张经人工脑脊液（ACSF）浸湿的滤纸放置在切片平台上，然后将修整好的组织块置于滤纸上。为将组织切成 200 至 250 微米厚的切片，将切割厚度在设备标尺上设置为 2 或 2.5 单位，然后开始切片。使用画笔将脑切片转移至含有蔗糖-ACSF的培养皿中，并在体视显微镜下用27号针头分离切片。在荧光显微镜下鉴定GFP阳性切片。然后，使用一支无菌的、尖端折断且开口较宽的1毫升移液器，将鉴定出的切片转移至一个新的60毫米培养皿中，该培养皿内含有2至3毫升成年切片培养基。然后，将三到五片组织切片转移至六孔板中每个孔的组织培养插件上，注意保持安全距离。去除插件表面多余的培养基后，于每个插件下方加入一毫升已预平衡的成年小鼠脑片培养基。将组织在37°C、5% CO₂和95%湿度条件下孵育24小时，随后进行成像。在无菌操作台内，用移液器将5微升浓度为30毫克/毫升的荧光素溶液加入插入式培养小室下方的培养基中。将带盖的六孔板放入仪器成像室中，置于固定相机下方，并锁紧舱门。打开软件并初始化仪器。选择相机设置，使每次成像仅显示并捕获一个孔，然后将待成像的孔置于相机正下方。使用感兴趣区域（ROI）工具，将其调整至与肿瘤的形状和大小相匹配，测量该区域，并记录总读数，以定量分析切片上每个肿瘤的生物发光信号。将培养板重新放回无菌超净工作台后，使用镊子轻轻提起插入物。 吸出培养基后，加入一毫升新鲜培养基，并将插入物放回孔中。对于需要对脑片施加不同化合物（如抑制剂和代谢物）的实验，先在1.5毫升离心管中用1.2毫升脑片培养基配制适当浓度的试剂，然后将一毫升试剂转移至含有脑片的孔中。将MDA-MB-231 BR-GFP荧光素酶标记的细胞注射到裸鼠体内，待肿瘤生长后，取出带肿瘤的脑组织，进行解剖、切片、体外培养，并通过生物发光成像监测肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色和GFP阳性荧光证实了脑切片中存在肿瘤。Ki-67染色增强证实了存在高度增殖的癌细胞。未接受照射的脑切片中的肿瘤在体外继续生长，而接受照射的肿瘤则表现出生长停滞。含有肿瘤的脑切片也通过活体成像进行监测，以观察放疗后肿瘤的生长情况。与生物发光成像结果一致，对照组癌细胞迅速增殖，GFP荧光强度增加，并开始侵袭脑实质。相比之下，经放疗处理的脑切片中的癌细胞处于细胞静止状态，GFP荧光强度保持稳定。在经电离辐射（IR）处理的癌细胞中，检测到大型多核癌细胞以及DNA损伤标志物染色增强。同时检测到反应性星形胶质细胞增加。在无肿瘤的小鼠脑切片中，未检测到IR处理诱导的细胞凋亡。含有肿瘤的脑切片用不同浓度的紫杉醇（一种化疗药物）进行处理。治疗开始后第10天，肿瘤体积显著减小。在经紫杉醇处理的肿瘤细胞中检测到凋亡增加。抑制剂处理未改变脑组织的活性。通过切割的caspase-3染色检测，在经紫杉醇处理的无肿瘤小鼠脑切片中未测得凋亡增加。当感兴趣的药物处理结束后，可对脑切片进行免疫细胞化学分析蛋白表达、组学研究，或制备适用于流式细胞术的单细胞悬液。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

一 种研究 并靶向乳腺癌脑转移性肿瘤生长的离体脑切片模型

来源：Ciraku, L., et. al．一种用于研究和靶向乳腺癌脑转移肿瘤生长的离体脑切片模型．J. Vis.

利用生物发光成像评估类器官小鼠脑切片中的肿瘤生长

采用超声成像引导下将MDA-MB231/Br-GFP细胞经心内注射，建立乳腺癌脑转移小鼠模型。通过高分辨率9.4...

超声成像引导下心内注射建立小鼠乳腺癌脑转移模型及后续纵向磁共振成像

多种人类脑肿瘤局限于脑内的特定区域，且难以在培养条件下生长。本方案旨在研究肿瘤微环境的作用，并通过分析在小鼠脑组织切片中生长的荧光标记原代脑肿瘤细胞，探索新的药物治疗方法。...

一种用于研究肿瘤微环境及靶向药物治疗的脑肿瘤/器官型脑片共培养体系

脑转移已成为一个迫切且尚未满足的医疗需求，其发病率不断上升，而治疗选择仍局限于姑息治疗。建立脑转移的实验动物模型 通过...

颈内动脉癌细胞注射构建小鼠脑转移模型

颅内脑转移瘤建模因缺乏精确且及时监测肿瘤大小及治疗反应的方法而变得复杂。本研究所展示的方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，从而实现精确且一致的注射操作、增强的动物监测以及准确的肿瘤体积测量。...

通过颅内注射与磁共振成像建立脑转移模型

本文介绍了一种制备和培养血脑屏障转移性肿瘤微环境的实验方案，并利用共聚焦成像和人工智能（机器学习）对其状态进行定量分析。...

利用器官芯片三维模型、机器学习与共聚焦层析技术定量分析脑转移肿瘤微环境

我们描述了一种通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系建立的乳腺癌脑转移异种移植小鼠模型。...

通过尾静脉注射炎症性乳腺癌细胞建立脑转移模型

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。目前大多数脑转移小鼠模型因伴随全身性转移，干扰了对死亡率和治疗干预效果的分析。本文介绍了一种颈内动脉注射癌细胞的方案，可稳定产生颅内肿瘤，同时全身性肿瘤极少。...

通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型

鸡胚被用于研究人类胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤 在卵内 以及在 离体 脑片共培养。通过延时显微成像可记录胶质母细胞瘤细胞的行为， 离体 共培养，且两种制备物均可在实验终点通过详细的三维共聚焦分析进行检测。...

利用鸡胚脑作为模型 在体 内 和 离体 人类胶质母细胞瘤细胞行为分析

立体定向颅内注射技术可实现将肿瘤细胞精确且局部地植入小鼠大脑皮层，是研究脑转移定植的有力模型。...

建立脑转移模型：通过立体定向皮层内注射对转移性定植及组织学生长模式进行标准化分析

学习利用离体脑切片模型研究乳腺癌脑转移性肿瘤生长并靶向治疗的方法。该技术可在维持脑肿瘤微环境生理相关性的条件下快速检测多种药物和放疗效果。

一个离体脑切片模型用于研究和靶向乳腺癌脑转移肿瘤生长

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