使用膜片钳技术研究线粒体的产热能力

该协议描述了如何通过直接测量线粒体内膜上的线粒体质子泄漏来使用膜膜膜的膜闭来研究线粒体的产热能力。直接测量通过线粒体内膜的质子电流有助于识别和精确表征负责线粒体产热的分子机制。该技术不仅可以测量穿过线粒体内膜的质子电流，还可以研究对线粒体功能很重要的其他电导，例如钙或腺嘌呤核苷酸等代谢物。

将安乐死的鼠标放在背部并喷洒酒精以清洁和弄湿头发。然后，在胸部做一个两厘米的切口。用镊子抓住皮肤后，从动物胸部切开心脏并冲洗干净，将所有血液除去，放入装有5毫升冷隔离溶液的10毫升烧杯中。

一旦心脏清除了血液的痕迹，将其转移到另一个含有五毫升冷隔离缓冲液的10毫升烧杯中，并将其切成薄片。然后，将其转移到冰冷的10毫升玻璃均质机中。使用顶置搅拌器以每分钟275转的受控速度在冰上以六次轻柔的行程将预切组织均质化。

将匀浆转移到15毫升冰冷的锥形管中，并在4摄氏度下以700倍G离心10分钟，以沉淀细胞核和未破碎的细胞。将上清液收集在新鲜的15毫升管中，并将其放在冰上。将上清液以8， 500倍G在4摄氏度下离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。

将线粒体沉淀重悬于3.8毫升冰冷的高渗甘露醇缓冲液中，并将线粒体悬浮液在冰上孵育10至15分钟。将线粒体高渗甘露醇悬浮液填充到法国压榨机的冷藏迷你压力池中。然后，将单元格放在法式印刷机上。

然后，选择法国压榨机的低模式，并通过微型压力池将悬浮液压缩在棕色脂肪线粒体的刻度盘上110，对于心脏线粒体，在140处压缩悬浮液，确保悬浮液以每秒约一滴的速度从迷你压力池中出来。将滴剂收集在15毫升冰冷的锥形管中。将悬浮液以10， 500倍G在4摄氏度下离心10分钟。

将mitoplasts沉淀重悬于0.5至2毫升冰冷的高渗氯化钾缓冲液中，并将悬浮液储存在冰上。在记录当天使用微量移液器拉动硼硅酸盐玻璃丝，在用于生成具有高度再现性的移液器的拉拔器上设置程序。在拉拔器内插入一根玻璃丝并拉动，从一根硼硅酸盐丝中获得几乎两个相同的贴片移液器。

当移液器在拉动周期之间由于拉拔器的加热盒灯丝老化而变得不一致时，调整程序。将移液器放在移液器抛光机内，并将吸头放在100X放大倍率下靠近灯丝附近以进行火抛光。按压脚踏板几次以加热灯丝，而不会堵塞或损坏尖端曲线。

抛光直到移液器在填充基于TMA的移液器溶液时具有25至35兆欧姆的阻力。用0.1%明胶预孵育覆盖物滑动以减少丝粒体粘附，并在沉积丝胶悬浮液之前用氯化钾浴溶液冲洗它们。通过将约35微升浓缩的mitoplast悬浮液与500微升的氯化钾浴溶液混合来制备原始稀释液，并将其放在先前放置在四孔板孔中的盖玻片上。

在冰上孵育15至20分钟，让斜面体沉淀到盖玻片上。用大约50微升的氯化钾浴溶液完全填充浴腔，并使用带有弯曲尖端的薄微解剖镊子在腔内转移带有斜面体的盖玻片。将盖玻片排列在腔室底部而不灌注腔室，以保持膜塑性塑料在盖玻片上的稳定。

通过在显微镜下用60X物镜扫描盖玻片来选择单个非粘性丝状体。将移液器溶液装入移液器，并将其放入移液器支架中。使用显微操作器将移液器带入浴槽溶液中，并将其移动到所选的mitoplast的正上方以接近IMM。

将膜电位保持在零毫伏，并使用放大器程序中的膜测试命令施加10毫伏脉冲。施加轻微的负压，以使用IMM快速产生千兆级。在连接有丝状塑料的情况下提起移液器，使其远离盖玻片，以避免在实验过程中由于移液器漂移而导致的密封破损。

在测试全斜方体配置之前，使用放大器程序中的膜测试命令补偿杂散电容瞬变，以便在磨合后获得正确的电容测量值。使用放大器程序施加短时间电压脉冲，使玻璃移液器下的膜贴片破裂，实现全膜塑料配置。磨合后，将电容瞬变与放大器程序的膜测试选项相匹配，以评估膜电容及其接入电阻。

闯入后，立即通过灌注将氯化钾浴溶液替换为HEPES浴溶液。将 850 毫秒斜坡协议应用于放大器程序。电压斜坡协议的应用在棕色脂肪的IMM上诱导大振幅质子电流，而无需添加外源性脂肪酸，这是UCP所需的激活剂。

通过UCP1抑制剂鸟苷二磷酸或10毫摩尔甲基β环糊精灌注用于内源性膜脂肪酸提取后，残余电流用于确定UCP1电流的振幅，该电流在UCP1缺陷小鼠的IMM中完全消失。与棕色脂肪不同，非脂肪组织的IMM（如骨骼肌和心脏）在磨合后不会立即产生可测量的质子电流。为了通过AAC诱导可测量的质子电流，必须应用含有一至两微摩尔外源性脂肪酸的HEPES浴溶液。

为了确认测得的质子电流由AAC携带，重要的是应用特异性抑制剂羧基亚曲霉苷，其几乎完全抑制AAC1缺陷小鼠的IMM中显示的质子电流。只有当ADP存在于膜的两侧以通过AAC产生活性核苷酸交换时，才能实现对质子泄漏的持续但从未完全的抑制。mitoplast制剂的质量将影响实现全mitlast配置的成功率。

优化它至关重要。一旦用膜片钳技术解剖线粒体产热的分子机制，线粒体耗氧量的测量将证明质子电流和产热在完整线粒体中的重要性。这项技术为研究人员探索对线粒体功能重要的各种电导，离子和代谢物开辟了道路。