利用培养废液对人类植入前胚胎进行染色体筛查：样本采集与染色体倍性分析

本方案旨在对培养基收集和基于非侵入性染色体筛查（NICS）的人类胚胎植入前染色体倍性分析进行标准化。NICS 的主要优势在于操作简便，相较于 TiDieR 显微操作更为省时，且能有效减少侵入性活检样本的丢失。取样方法具有很高的灵活性。

我们为您提供两种不同的选择，一种用于常规的序贯胚胎培养，另一种用于一步法。这些是我们团队的主要成员，姚亚新博士和朱晓慧博士主要负责文库构建和NICS再生测序工作。贾佳琳博士和我共同完成胚胎学实验及样本采集。

刘教授是我们的课题组负责人，也是本文的通讯作者。首先，准备好试剂和工具。

使用前将20至30微升培养基和透明质酸酶预热并平衡。然后将培养基和透明质酸酶置于生物安全柜内的工作台面上。迅速将消化后的OCCC转移至用于卵母细胞操作的培养皿中，并在每孔中覆盖矿物油。

轻轻吹打卵母细胞5到10次，以去除卵母细胞周围的残留颗粒细胞。在其余三个孔中重复此步骤，彻底清除颗粒细胞。使用显微镜评估颗粒细胞去除的完整性。

然后进行胞质内单精子注射（也称为ICSI），并将胚胎转移至培养基中。为每个胚胎准备20至30微升囊胚培养基微滴。在第2天将胚胎置于组织培养皿中，用矿物油覆盖，并在37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下培养。

将第三天的胚胎转入洗涤微滴后，使用移液管依次在三个微滴中轻轻吸出并释放胚胎。然后将胚胎转移至囊胚培养液中。准备好洗涤微滴和培养微滴。

在第4天下午，将胚胎转移至预热的培养液微滴中，用移液管在三个微滴中依次轻轻洗涤每个胚胎。将每个胚胎转移至单独的预热培养液微滴中，用于样品采集。在冷冻保存前继续培养囊胚胚胎。

在进行胚胎冷冻保存前的玻璃化冷冻时，准备培养微滴，并将胚胎转移至预热的、体积为10至15微升的培养液微滴中。在第五天早晨，通过移液操作，依次将每个胚胎在三个微滴中轻柔洗涤。如先前所述，将每个胚胎转移至一个独立的、预热的单个培养液微滴中，用于样本采集。

将囊胚胚胎在37摄氏度和5%二氧化碳条件下进行培养，之后再进行冷冻保存。接下来，轻柔地调整内细胞团的位置，使其与激光束的目标点保持一定距离，激光束聚焦于滋养外胚层的细胞连接处，以在滋养外胚层上产生一个小孔，从而释放囊胚腔内的液体。为收集样本，将试剂盒中的缓冲液在室温下解冻，并短暂离心。

然后将每个培养胚胎的培养基转移至含有5 µL细胞裂解缓冲液的无RNase和DNase的PCR管中。准备试剂和工具。在用培养基将基因组DNA稀释至浓度为50 pg/µL后进行定量。

充分混匀后，在200 ×g条件下短暂离心5秒。将培养基在微型离心机中离心30至60秒后，用移液器从稀释的阳性对照和新鲜培养基试管底部各吸取10 µL，加入新的0.2 mL PCR管中。加入1 µL MT酶混合液，并通过移液充分混匀。

然后立即离心两到三秒。将PCR管放入预热的混合样本制备仪中，运行裂解程序。当预文库缓冲液完全解冻并混匀后，立即以200 G离心两到三秒。通过将2微升预文库酶混合液加入60微升预文库缓冲液中，配制预文库反应的主混合液。

充分混匀反应液，短暂离心。将60 µL预文库反应混合液加入预处理的培养基样品中。用移液器充分混匀后，立即在200 ×g条件下离心2至3秒。将PCR管放入预热的样本制备工作站中。

运行文库前程序，并在4°C下保持。通过将1.6 µL文库酶混合液加入60 µL文库缓冲液中，制备文库反应的主混合液。充分混匀反应体系，并按此前所示方法进行离心。

向每个预文库产物中加入60微升文库反应混合液和2微升条形码引物。然后充分混匀反应体系，并按演示进行离心。离心后，将PCR管放入热循环仪中。

运行文库制备程序，然后在4°C下保存。准备试剂和工具。将制备好的1X mega beads加入文库样品中。

按照文稿中所述方法对纯化后的文库进行定量，并使用每个文库样品的10纳克进行文库混合。请参考测序用户指南，在测序完成后进行数据分析。在ChromGo的数据分析登录页面输入用户的姓名和密码。

登录后，点击 NICS 选项卡下的“创建提交”。然后为平台选择 NGS，为公司选择 Illumina，为试剂选择 NICSInst。在“项目 ID”下方的框中输入项目信息。设置分析偏好并上传文件。

所有测序文件成功上传后，点击“提交”以开始分析。已提交的项目将列在“查看提交”标签页下。点击报告字段中的“显示”按钮，以查看NICS分析的汇总表格。

点击“导出报告”按钮以保存报告。从患者体内共获得六个囊胚，并对这六个胚胎在第四天至第五天的培养基中进行了无创性染色体筛查（NICS）。通过NICS检测，在五个胚胎中发现了由父母平衡易位引起的染色体异常，因此这些胚胎未用于移植。

两个胚胎的NICS结果显示相同的核型45 XN，且均为18号染色体缺失。核型46 XN中1号染色体短臂区域缺失仅涉及该染色体短臂区域的缺失。NICS结果显示核型为46 XN，伴有18号染色体长臂区域缺失及1号染色体短臂区域重复。

尽管这些核型存在五号染色体重复，并显示出八种嵌合差异，但NICS检测能够对全部24条染色体进行非整倍性筛查。该过程为单个正常核型囊胚的移植提供了一种新方法。在实施该操作时，必须注意彻底去除颗粒细胞，以避免母源性污染，并在DNA含量足以进行扩增时，收集培养液和扩张的囊胚阶段样本。

通过使用NICS技术，本研究将全基因组扩增（WGA）和全基因组测序（WGS）文库制备步骤缩短至约三小时，并可在约九小时内无创地获得连续循环测序（CCS）结果。该技术开发后，为辅助生殖技术（ART）领域的临床医生提供了一种新方法，即将形态学评估与NICS相结合，选择形态良好且为单倍体的胚胎进行子宫移植，可能提高持续妊娠率和活产率。