来自分离人产品的γ-Delta（γδ）T细胞的扩增和富集

γ-Delta T细胞对许多癌症类型（包括急性髓系白血病）具有强大的细胞毒性活性。然而，血液中循环的γ-Δ T细胞相对罕见，特别是在恶性肿瘤患者中。输注供体来源的X-vivo扩增的γ-δ T细胞，有望减少白血病的复发，并提高急性髓系白血病患者的生存率。

所提出的方法在三个简单的步骤中实现了大于200， 000倍的γ-Δ细胞扩增，达到治疗相关剂量的高纯度γ-δ细胞产物。因此，连接IEL以扩增，通过磁选和AAPCs的赏金二次扩增来消耗αβ-T细胞。所提出的方法通过快速创建大量可以现成使用的细胞，扩展了γ-Delta T细胞对癌症和自身免疫性疾病等疾病的效用。

该过程可以适应使用不同的富集方法扩增γ-Delta细胞，并添加其他操作，如转导。演示该程序将在洛杉矶进行，他是一位细胞治疗技术专家，来自我的实验室的三位。首先在逆流离心装置上使用Hanks平衡盐溶液的主要培养基，将泡腾产物样品洗脱，其中含有1%的人血清白蛋白和盐水溶液或DPBS的二级培养基。

洗脱离心速度为900倍G，根据流速和时间收集馏分。从馏分二中收集样品，通过流式细胞术进行无菌测试，细胞计数和细胞表型分析。从第二部分开始，以10倍10的比例扩增培养物中细胞的纯淋巴细胞部分至每平方的第六个细胞，每升唑来膦酸5微摩尔，在一升封闭系统生物反应器中每毫升白细胞介素-2300单位。

将系统在37摄氏度下孵育七天，其中二氧化碳含量为5%。孵育后，从一升封闭系统生物反应器烧瓶中收获细胞。为此，将一升转印包无菌焊接到生物反应器的红线上，并使用适当的药物泵将细胞转移到转印包中。

取样通过流式细胞术测试用过的培养基无菌性，细胞计数和细胞表型。从剩余的样品中，将细胞以每毫升10至8个细胞的五倍重新悬浮在含有0.5%HSA和生物素化T细胞受体，αβ特异性抗体的PBS-EDTA缓冲液中。并在2至8摄氏度下振荡孵育细胞。

15分钟后，用含有0.5 HSA的600毫升PBS-EDTA缓冲液洗涤细胞，并以200至500倍G离心15分钟，在2至8摄氏度下，以除去未结合的抗体。然后，将细胞以每毫升约5倍10至8个细胞重新悬浮在含有0.5%HSA和每瓶抗生物素特异性微珠7.5毫升的PBS-EDTA缓冲液中。如前所述，在离心细胞悬浮液以除去未结合的微珠之前，用振荡孵育细胞。

在PBS-EDTA缓冲液中以0.5%HSA重新悬浮每毫升10至7个细胞六次。将它们收集到转运包袋中。在仪器的指示下将其刺入。

接下来，在临床级磁细胞分离装置中安装导管组。将装有PBS-EDTA缓冲液的包以及带有细胞产物的转印包放入仪器中。对于标记的αβ-T细胞的耗尽，请在软件中选择耗尽1.2方案。

然后，离心细胞产物以收集富含γ-Δ T细胞的目标级分。将收集的细胞重新悬浮在培养基中，补充10%人AB血清。在耗竭后进行细胞计数活力和流式细胞术表型分析。

使细胞达到每毫升约10至第六个细胞的终浓度。在X射线生成仪器上，将每个烧瓶10至第七个人工抗原呈递细胞或AAPC照射5次，以100灰色照射。制备共培养物，通过将辐照的AAPC和γ-Δ T细胞以10比1的比例置于一升封闭系统生物反应器烧瓶中。

用一升培养基，补充10%人AB血清，播种至10个烧瓶。将培养物在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育10天，每3至4天使用条带，葡萄糖和乳酸仪筛选葡萄糖和乳酸水平。如果葡萄糖水平降至每分升215毫克，则将烧瓶中的体积减少到200毫升。

将细胞混合在剩余的200毫升培养基中，并取出0.5毫升样品，通过吖啶橙或碘化丙啶染色进行细胞计数和活力测量。如果细胞计数等于或超过10到第九个，则将一个烧瓶的内容物分成两个，并用AIM-V培养基填充每个烧瓶，最多一升，并补充10%人AB血清。如果细胞计数小于10至第九个，则用新鲜的1升培养基喂养细胞，补充10%人AB血清，并将烧瓶返回培养箱。

在共培养10天结束时，一次收获一个生物反应器烧瓶，并将所有细胞拉入适当大小的转移包中。除去质控样品后，在室温下以200至500倍G离心细胞15分钟，并弃去上清液。在平衡晶体溶液中洗涤细胞，在室温下以200至500倍G补充0.5%HSA15分钟。

将它们重新悬浮在目标体积为100至300毫升的平衡晶体溶液中，HSA为0.5%。将细胞从逆流后离心馏分中分离出来。两个产生了纯淋巴细胞群，具有95.80%的出色平均活力，γ-Delta T细胞特异性扩增，唑来膦酸取决于洗脱后淋巴细胞部分中存在的自然杀伤细胞的初始百分比。

γ-δ T细胞药物物质的富集与T细胞受体α-β消耗是一致的。由三个健康供体生产的γ-Delta T细胞药物产品符合释放标准，即少于1%的T细胞受体αβ阳性T细胞，平均0.11%CD20阳性B细胞和0.00%T细胞受体αβ阳性T细胞。最终产品中自然杀伤细胞的平均百分比约为17.06%，符合小于35%的释放标准 细胞表面染色和流式细胞术分析，用于表征原料药和药物产品的身份，纯度和工艺杂质。

通过AAPC和γ-Δ T细胞药物物质的共培养实现的第二次再扩增，产生了符合所有释放标准的γ-Δ-T细胞药物产物。富集T细胞群的病理会影响产物的扩增和特性。在开始浓缩方法之前，需要对浓缩方法进行充分的考虑和调查。