Name: 来自分离人产品的γ-Delta（γδ）T细胞的扩增和富集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学习从分离人产品中扩增和富集γδ T细胞的方法，用于癌症免疫治疗。该方案通过唑来膦酸和白细胞介素-2刺激，结合磁珠分选去除αβ T细胞，可实现超过20万倍的细胞扩增，获得高纯度治疗级细胞产品。

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我们感谢莫菲特癌症中心（Moffitt Cancer Center）的细胞免疫治疗-研究者发起的试验奖内部资助机会为本方案的开发提供了资金支持。我们还要感谢 Claudio Anasetti 博士在本项目中给予的宝贵帮助和指导。最后，我们感谢 Justin Boucher 博士对稿件提出的见解和审阅意见。

注意：已获得机构审查委员会（IRB）批准，并已从供者处获得知情同意。
1. 淋巴细胞分离
<ol>
	<li>将单采产品转移至洁净室。 
	注意：工艺验证使用了符合原始细胞材料采集法规的外部商业供应商提供的正常供体单采产品。</li>
	<li>采集样本用于无菌检测、细胞计数和细胞表型分析。</li>
	<li>使用逆流离心装置进行洗脱，初级介质为含1%人血清白蛋白（HSA）的Hanks平衡盐溶液，次级介质为生理盐水溶液（0.9%氯化钠注射液USP）或Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）。将离心洗脱速度设置为900 × g，并根据流速和时间收集不同组分。</li>
	<li>从第2组分中采集样本，并进行以下检测：2 mL用于无菌检测；0.5 mL用于通过吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）进行细胞计数和活力检测；5 × 106个细胞用于流式细胞术进行细胞表型分析。</li>
	<li>将纯化的淋巴细胞组分（第2组分）以10 × 106个细胞/cm2的密度，在1 L封闭式生物反应器中培养扩增，加入5 µmol/L唑来膦酸和300 IU/mL IL-2。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育七天。</li>
</ol>
2. αβ T 细胞去除
<ol>
	<li>从1 L封闭式生物反应器瓶中收获细胞。将1 L转移袋无菌焊接至封闭式生物反应器的红线处，并使用适当的药用泵将细胞转移至转移袋中。</li>
	<li>采集以下样品：10 mL用于培养基无菌检测；0.5 mL细胞用于AO/PI染色法进行细胞计数和活力检测；5 × 106 个细胞用于流式细胞术分析。</li>
	<li>将细胞以约5 × 108 个细胞/mL的浓度重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）或PBS/乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液 + 0.5% HSA中，并加入生物素标记的TCR αβ特异性抗体。</li>
	<li>将摇床置于冰箱中，在2–8 °C条件下振荡孵育细胞约15分钟。</li>
	<li>用总共600 mL的PBS/EDTA缓冲液 + 0.5% HSA洗涤细胞。在2–8 °C条件下，以200–500 × g 离心15分钟，去除未结合的抗体。将约5 × 108 个细胞/mL重悬于PBS/EDTA缓冲液 + 0.5% HSA中，并加入抗生物素特异性磁珠（7.5 mL/1小瓶）。</li>
	<li>将摇床置于冰箱中，在2–8 °C条件下振荡孵育细胞约15分钟。孵育后，在2–8 °C条件下以200–500 × g 离心15分钟，去除未结合的磁珠。将细胞以约6 × 107 个细胞/mL的浓度重悬于PBS/EDTA缓冲液 + 0.5% HSA中，并转移至转移袋中。</li>
	<li>按照制造商说明，将管路组件安装至临床级磁性细胞分选装置中，将含有PBS/EDTA缓冲液的袋子和含有细胞产物的转移袋放入仪器中，并在仪器提示时进行穿刺操作。</li>
	<li>选择Depletion 1.2程序以去除标记的αβ T细胞。</li>
	<li>离心目标组分（富集的γδ T细胞），并将细胞重悬于添加了10%人AB血清的培养基中。</li>
	<li>取0.5 mL样品，使用AO/PI染色法进行细胞计数和活力检测。将细胞调整至终浓度约为1 × 106 个细胞/mL。取5 × 106 个细胞的产品样品，用于去除αβ T细胞后的流式细胞术表型分析。</li>
</ol>
3. 与aAPCs的共培养
<ol>
	<li>在X射线发生仪器上以100 Gy剂量照射5 × 107个aAPC/烧瓶。</li>
	<li>将aAPC与γδ T细胞以10:1的比例共培养。将经照射的aAPC（5 × 107个细胞/烧瓶）和γδ T细胞（5 × 106个细胞/烧瓶）置于含1 L培养基的封闭式生物反应器烧瓶中，培养基中添加10%人AB型血清。最多接种10个烧瓶。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中培养扩增10天。</li>
	<li>使用试纸条、葡萄糖和乳酸检测仪，每3至4天监测一次葡萄糖和乳酸水平。</li>
	<li>若葡萄糖浓度降至250 mg/dL，使用药用泵通过无菌焊接方式将1 L转接袋连接至封闭式生物反应器的红色标记线，将烧瓶内液体体积减少至200 mL。</li>
	<li>混匀剩余200 mL中的细胞，取0.5 mL样本，通过AO-PI染色进行细胞计数和活力检测。若细胞数量≥109，将一个烧瓶中的细胞分至两个烧瓶，并用添加10%人AB型血清的AIM-V培养基补至每瓶1 L；若细胞数量&#60;109，则向原烧瓶中加入1 L新鲜培养基（含10%人AB型血清）进行换液。</li>
	<li>对所有烧瓶重复步骤3.6，并放回37 °C、5% CO2培养箱中。每3至4天重复一次步骤3.4–3.7。</li>
</ol>
4. 细胞收获
<ol>
	<li>共培养10天结束时，收获所有生物反应器烧瓶。每次收获一个生物反应器烧瓶，并将所有细胞汇集至适当大小的转移袋中。将转移袋无菌焊接至封闭式生物反应器的红线处，使用药用泵将细胞转移至转移袋中。</li>
	<li>留取以下质量控制样品：取药品终产物（DP）的1%用于血培养和革兰染色以检测无菌性；取0.5 mL用于AO/PI染色法进行细胞计数和活率检测；取5-10 × 106个细胞用于流式细胞术分析（参见图1中的设门策略）；取0.5 mL用于内毒素检测；取0.5 mL用于革兰染色；取106个细胞加入10 mL使用过的培养基中用于支原体检测。</li>
	<li>在室温下以200-500 × g离心15分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用平衡晶体溶液加0.5%人血清白蛋白（HSA）的溶液在室温下以200-500 × g洗涤细胞15分钟。然后将细胞重悬于100-300 mL的平衡晶体溶液加0.5% HSA的目标体积中。</li>
</ol>
5. 放行检测
<ol>
	<li>对γδ T细胞DP进行以下质量控制检测：通过流式细胞术检测纯度和鉴定（活/死细胞、CD45、CD3、TCR αβ、TCR γδ、CD20、CD56、CD16）；通过AO/PI染色检测活力；内毒素检测；通过聚合酶链式反应（PCR）检测支原体；通过革兰染色及需氧和厌氧血培养检测无菌性；通过流式细胞术检测残留K562细胞（CD3-CD16-CD56-CD71+）。</li>
</ol>

<ol><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%3A+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li>
<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li>
<li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment%2C+risk+factors%2C+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li>
<li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph%2B+leukemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700(2011).</li>
<li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3%CE%B4+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-%CE%B1%CE%B2%2B%2FCD19%2B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li>
<li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+T+cell+receptor%3A+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li>
<li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+V%CE%B39V%CE%B42+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

莫菲特细胞治疗实验室开发了一种双相扩增高纯度γδ T细胞的方案，用于临床试验中的供者产品（DP）。该方案在封闭系统中依据cGMP规范提供了一种生产方法，所获得的供者产品为高纯度的γδ T细胞，可通过唑来膦酸和WCB aAPCs有效激活并扩增。该方案已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于制造针对急性髓系白血病（AML）患者的同种异体γδ T细胞供者产品。利用健康供者样本，我们在仅7天内成功将供者γδ T细胞的小群体从初始的2.06 ± 0.45%扩增至54.45 ± 28.34%。在使用唑来膦酸扩增7天后，观察到2号供者的自然杀伤（NK）细胞群体有所增加。
唑来膦酸可抑制单核细胞中的法尼基二磷酸合酶（FDPS），从而导致异戊烯基焦磷酸（IPP）的积累，而IPP的积累与T细胞和自然杀伤（NK）细胞的显著增殖增加相关7,8,9。这种增加的NK细胞群体阻碍了2nd 扩增阶段使用aAPCs，因为aAPCs仅促进NK细胞的进一步扩增。因此，供者筛选标准进行了调整，排除NK细胞比例较高的供者。在去除αβ T细胞后，γδ T细胞的富集度达到76.61 ± 27.51%。该独特方案包括第二轮扩增，使用莫菲特（Moffit）制备的aAPCs，靶向γδ T细胞上的CD8、CD28和CD127L受体。通过aAPCs进行的第二轮扩增阶段，最终产物中CD3双阳性（DP）比例达到≥65%+TCR γδ+ T细胞，≤1% TCRαβ T细胞，和 &#60;35% CD3-CD16+CD56+ NK细胞。由于使用了源自K562的aAPCs，有必要证明这些aAPCs包含 &#60;最终产物的1%。
Moffit CTF 开发了一种流式细胞术检测方法，用于放行标准，以测定最终产品中残留 K562 细胞的百分比。该流式细胞术检测方法克服了利用细胞表面抗原来鉴定 K562 细胞时存在的所有问题。由于活化的 T 细胞可表达 CD71，我们设计了一种策略，通过设门排除所有 T 细胞和 NK 细胞，即选择 CD3- CD56- 和 CD16- 的细胞群体，然后分析 CD71+ 细胞，这些细胞即为唯一的 K562 细胞。本方案表明，γδ T 细胞终产品中残留 K562 细胞比例为 0.48 ± 0.42%，且符合所有放行标准：细胞活力 ≥70%、PCR 检测支原体阴性、革兰染色未见微生物、内毒素含量 ≤2 EU/mL，以及最终（14 天）血培养无菌生长。

白血病复发是急性髓系白血病（AML）患者在接受造血细胞移植（HCT）后死亡的首要原因1,2,3。研究表明，HCT后外周血γδ T细胞恢复程度较高，可显著改善无白血病生存率，且不增加移植物抗宿主病（GVHD）的风险4。γδ T细胞能够以MHC非依赖的方式识别抗原，并产生强烈的细胞溶解作用和Th1样效应功能，这使得这一T细胞中的少数亚群成为治疗接受异基因移植且具有复发风险的AML患者的理想选择5。由于Vγ9Vδ2 T细胞在外周T细胞中仅占0.5%至5%，属于稀有亚群6，因此我们致力于建立一个稳定可靠的扩增体系，以大量扩增这种稀有血细胞，达到可用于临床试验的潜在治疗剂量。
尽管已有研究者成功利用唑来膦酸甚至人工抗原呈递细胞（aAPCs）扩增γδ T细胞，但我们开发了一种可将γδ T细胞扩增229,749倍的方法。该扩增过程分为两个阶段：首先，通过分离仪器采用离心淘洗法获取淋巴细胞。该设备提供一个封闭系统，可通过逆流离心法根据细胞的大小、形状和密度实现细胞分离。在富集淋巴细胞后，使用唑来膦酸和IL-2处理7天，实现Vγ9Vδ2 T细胞的选择性扩增。在此处理结束后，立即利用微珠技术去除TCR-αβ T细胞，从而为后续使用K562来源的aAPCs扩增γδ T细胞创造条件。
在工艺验证中，仅使用5 × 106个经唑来膦酸扩增的γδ T细胞与人工抗原呈递细胞（aAPCs）进行第二阶段共培养扩增。在该第二阶段扩增过程中，采用莫菲特癌症中心（Moffitt）生产的符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的工作细胞库（WCB）的基因工程改造K562来源aAPCs（K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)）来激活γδ T细胞。该两阶段扩增策略的原理基于唑来膦酸可抑制单核细胞中的法尼基二磷酸合酶（FDPS），从而导致异戊烯基焦磷酸积累，后者可直接刺激Vγ2Vδ2细胞。在第二阶段扩增中，K562来源的aAPCs（K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)）为所有T细胞提供强效刺激。然而，此时细胞产物中γδ T细胞已得到富集，因而可实现γδ T细胞的高效扩增。
通过使用特定设备和烧瓶，该过程构成一个功能性的封闭系统，从而降低了污染风险。此外，1 L封闭式生物反应器可在1 L培养基总体积中实现细胞的最大生长与扩增，且几乎无需补液。Moffitt方法的优势在于，它提供了一种快速、可重复且高度可行的GMP系统，用于生产高纯度、供体来源的γδ T细胞产品，适用于同种异体给药。该方法可应用于任何旨在利用表达Vγ2Vδ2 T细胞受体的人源γδ T细胞作为过继性免疫治疗手段的临床试验，以介导针对癌症患者体内微生物和肿瘤的免疫反应，实现部分或完全缓解。此外，该方法还为γδ嵌合抗原受体阳性（CAR+）T细胞的开发与生产提供了可靠的平台。

<table><tbody><tr><td>汉克斯平衡盐溶液</td><td>R&amp;D</td><td>285-GMP</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白 25%</td><td>Grifolis</td><td>65483-16-071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte A</td><td>Fisher</td><td>2B2543Q</td><td></td></tr><tr><td>唑来膦酸（Zometa）</td><td>Hos pira</td><td>4215-04--8</td><td>FDA 批准药物</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>CS10</td><td>BIOLIFE SOLUTIONS</td><td>210374</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 注射器</td><td>JMS</td><td>992861</td><td></td></tr><tr><td>18g 针头</td><td>Fisher</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>1.8 mL 冻存管</td><td>Fisher</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Fisher</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 移液管</td><td>Fisher</td><td>1367610Q</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Fisher</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 移液管</td><td>Fisher</td><td>07-200-620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>600 mL 转移袋</td><td>TERUMO BCT INC</td><td>1BBT060CB71</td><td></td></tr><tr><td>4&quot; 血浆转移装置</td><td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td><td>03-220-90</td><td></td></tr><tr><td>Elutra 管路套装</td><td>TerumoBCT</td><td>70800</td><td></td></tr><tr><td>100 MCS GREX</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td>81100-CS</td><td></td></tr><tr><td>Ashton 无菌泵动式液体分配系统</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246660</td><td></td></tr><tr><td>Acacia 泵靴</td><td>MPS Medical In</td><td>17789HP3MLL</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA 缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-070-525</td><td></td></tr><tr><td>重组人脱氧核糖核酸酶 α（Dornase Alpha）</td><td>Genentech, Inc</td><td>50242-100-40/186-0055</td><td>FDA 批准药物</td></tr><tr><td>1000 mL 0.22 µm 滤器</td><td>Fisher</td><td>157-0020</td><td></td></tr><tr><td>170 µm 血液滤器</td><td>B.Braun</td><td>V2500</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACs 管路套装</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-090-719</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS TCR&amp;alpha;/&amp;beta; 试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-021-301</td><td></td></tr><tr><td>Y型输血装置</td><td>Fenwal</td><td>FWL4C2498H</td><td></td></tr><tr><td>75 mL 培养瓶</td><td>Fisher</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Prometheus</td><td>65483-116-071</td><td>FDA 批准药物</td></tr><tr><td>AIM-V 培养基</td><td>Fisher</td><td>0870112BK</td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清</td><td>Gemini Bio-Product</td><td>100H41T</td><td></td></tr><tr><td>3 升转移袋</td><td>Independent Medical Associates</td><td>T3109</td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;nbsp; 微升移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>5991040</td><td></td></tr><tr><td>CF-250</td><td>KOLBio</td><td>CF-250</td><td></td></tr><tr><td>Elutra</td><td>TERUMOBCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GatheRex 液体处理与细胞收获泵</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell Vios CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从单采人类产品中扩增与富集γδ（gamma-delta）t细胞

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

尽管Vγ9Vδ2 T细胞是T淋巴细胞中的一个次要亚群，但由于其能够以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖的方式识别抗原，并发展出强大的细胞溶解效应功能，因而成为癌症免疫治疗的理想候选者。由于Gamma-Delta（γδ）T细胞在外周血中的频率较低，我们开发了一种高效方案，可大规模扩增出高纯度的γδ T细胞药物产品，用于异体γδ T细胞在急性髓系白血病（AML）患者中的首次人体应用。以健康供体的单采血液作为异体细胞来源，采用经验证的仪器，通过逆流离心法根据细胞大小和密度分离淋巴细胞。
采用富含淋巴细胞的组分，并使用唑来膦酸（FDA 批准）和白细胞介素（IL）-2 优先激活 γδ T 细胞，持续 7 天。在 γδ T 细胞优先扩增后，使用符合临床级标准的磁性细胞分离装置及 TCRαβ 磁珠，去除污染的 T 细胞受体（TCR）αβ T 细胞。高度富集的 γδ T 细胞随后进入第二阶段扩增，使用来源于 K562 细胞的基因工程人工抗原呈递细胞（aAPCs）进行培养；该 aAPCs 经基因改造，可表达针对 CD3 和 CD28 的单链可变区片段（scFv）、41BBL（CD137L）以及 IL15-RA，并联合使用唑来膦酸和 IL-2。将第 7 天富集的所有 γδ T 细胞与 aAPCs 共同培养，可实现从健康供体血液中制备出高纯度的 γδ T 细胞，平均扩增倍数达 &gt;229,000 倍。

本文介绍了一种用于扩增伽马-德尔塔（γδ）T细胞药物产品的实验方案。通过离心淘析法分离淋巴细胞，并使用唑来膦酸和白细胞介素-2富集γδ T细胞。采用临床级磁性分离装置去除αβ T细胞。将富集的γδ T细胞与K562细胞系衍生的人工抗原呈递细胞共培养并进行扩增。

从单采人类产品中扩增与富集γδ（gamma-delta）T细胞

尽管Vγ9Vδ2 T细胞是T淋巴细胞中的一个次要亚群，但该细胞群体因其能够以主要...方式识别抗原而备受关注

γδ T细胞对多种癌症具有强大的细胞毒活性，包括急性髓系白血病。然而，外周血中的γδ T细胞相对稀少，尤其是在恶性肿瘤患者中更为罕见。输注供者来源的、体外扩增的γδ T细胞，在降低白血病复发风险和改善急性髓系白血病患者生存率方面具有良好的应用前景。该方法通过三个简单步骤，实现了超过 200,000 倍的 γδ T 细胞扩增，获得具有治疗意义剂量的高纯度 γδ T 细胞产品。这三个步骤分别是：将肠上皮内淋巴细胞（IEL）进行扩增，通过磁性分选去除 αβ T 细胞，以及利用人工抗原呈递细胞（AAPC）进行二次扩增。该方法通过快速生成大量可即用型细胞，拓展了 γδ T 细胞在癌症和自身免疫性疾病等疾病中的应用前景。该流程可进行调整，以利用不同的富集方法扩增γδ T细胞，并可增加其他操作步骤，例如转导。本实验操作将由来自我实验室的细胞治疗技术员Lithed在洛杉矶进行演示。首先，在逆流离心装置上使用初级培养基（含1%人血清白蛋白的Hanks平衡盐溶液）和次级培养基（生理盐水或DPBS）对气泡产物样本进行洗脱分离。在差速离心转速为900 × g的条件下，根据流速和时间收集组分。从第二组分中取样，进行无菌检测、细胞计数以及通过流式细胞术进行细胞表型分析。从第二组分中分离出的淋巴细胞纯化组分，在1 L封闭式生物反应器中进行体外扩增，培养密度为10 × 10⁶ 个细胞/厘米²，添加5 µmol/L的唑来膦酸和300 单位/毫升的白细胞介素-2。将系统在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育七天。孵育结束后，从一升封闭式生物反应器烧瓶中收获细胞。操作时，将一升转移袋无菌焊接至生物反应器的红线处，并使用合适的药用泵将细胞转移至转移袋中。取样进行用过的培养基无菌检测、细胞计数以及通过流式细胞术进行的细胞表型分析。从剩余样品中，用含有0.5%人血清白蛋白（HSA）和生物素标记的T细胞受体αβ特异性抗体的PBS-EDTA缓冲液重悬细胞，使细胞浓度为每毫升5 × 10⁸个细胞，并在2至8°C条件下振荡孵育细胞。孵育15分钟后，用600毫升含0.5% HSA的PBS-EDTA缓冲液洗涤细胞，并在2至8摄氏度下以200至500 × g离心15分钟，以去除未结合的抗体。随后，在含0.5% HSA的PBS-EDTA缓冲液中重悬细胞，细胞浓度约为5 × 10⁸个细胞/毫升，并每管加入7.5毫升抗生物素特异性磁珠。如前所述，将细胞在振荡条件下孵育，然后离心细胞悬液以去除未结合的磁珠。用含0.5% HSA的PBS-EDTA缓冲液重悬细胞，浓度为每毫升10的7次方个细胞，共重复6次。将细胞收集至转移袋中。根据仪器提示进行加样。接下来，在临床级磁性细胞分离装置中安装管路套装。将含有 PBS-EDTA 缓冲液的袋装溶液以及含有细胞产物的转移袋放入仪器中。为去除标记的 αβ T 细胞，在软件中选择去除程序 1.2。然后，离心细胞产物以收集富含γδ T细胞的目标组分。将收集的细胞重悬于添加了10%人AB血清的培养基中。在去除非目标细胞后，进行细胞计数、活力检测以及流式细胞术表型分析。将细胞调整至终浓度约为每毫升10的6次方个细胞。在X射线发生装置上，以100戈瑞剂量对每瓶5×10⁷个人工抗原呈递细胞（AAPC）进行照射。将照射后的AAPC与γδ T细胞按10:1的比例共同培养，置于1升封闭式生物反应器瓶中。使用一升培养基，添加10%人AB血清，可接种最多10个培养瓶。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养10天，每三至四天使用葡萄糖和乳酸试纸条及乳酸检测仪检测一次葡萄糖和乳酸水平。若葡萄糖浓度降至每分升215毫克，则将培养瓶中的体积减少至200毫升。将细胞混匀于剩余的200毫升培养基中，并取0.5毫升样品，通过吖啶橙或碘化丙啶染色进行细胞计数和活力检测。若细胞数量等于或大于10的9次方，则将一个培养瓶中的内容物分装至两个培养瓶中，每个培养瓶用添加了10%人AB血清的AIM-V培养基补至1升。若细胞数量少于10的9次方，则向细胞中加入1升新鲜培养基（添加10%人AB血清），并将培养瓶放回培养箱中继续培养。共培养10天后，依次收获生物反应器瓶，并将所有细胞转移至适当大小的转接袋中。去除质量控制样品后，在室温下以200至500 × g离心15分钟，弃去上清液。用添加了0.5%人血清白蛋白（HSA）的平衡晶体溶液在室温下以200至500 × g离心15分钟，洗涤细胞。用含有0.5%人血清白蛋白（HSA）的100至300毫升平衡晶体溶液重悬细胞。这些细胞来自逆流离心后的分离组分。其中两个样本获得了纯度较高的淋巴细胞群体，平均活力优异，达95.80%。γδ T细胞的特异性扩增依赖于洗脱后淋巴细胞组分中自然杀伤细胞的初始百分比，且该扩增过程需要唑来膦酸参与。通过去除T细胞受体αβ阳性的细胞，γδ T细胞药物原液的富集效果稳定一致。由三位健康供体制造的γδ T细胞药物成品中，T细胞受体αβ阳性T细胞比例均低于1%，达到放行标准，其中CD20阳性B细胞平均比例为0.11%，T细胞受体αβ阳性T细胞平均比例为0.00%。终产品中自然杀伤细胞的平均比例约为17.06%，符合低于35%的放行标准。采用细胞表面染色结合流式细胞术分析，对药物原液及药物成品的鉴别、纯度和工艺相关杂质进行了表征。通过AAPC与γδ T细胞药物原液的共培养进行第二次再扩增，所获得的γδ T细胞药物成品符合所有放行标准。影响产品扩增效果和特性的T细胞富集方法需予以充分考量和研究，在启动其富集工艺之前必须完成相关评估。

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