使用胶原基支架的神经母细胞瘤三维 体外 仿生模型

本文列出了在先前描述的三维胶原基支架上接种神经母细胞瘤细胞系所需的步骤，在预定的时间范围内维持细胞生长，以及检索支架以进行多种细胞生长和细胞行为分析以及下游应用，可适应满足一系列实验目标。

我们的方案提供了一个3D生物工程模型，该模型密切影响天然组织。这可用于发现神经母细胞瘤治疗和诊断的新疗法和生物标志物。主要优点是它创造了更多生理相关的实验条件，以使用可实现批次间一致性的可重复技术来研究肿瘤微环境。

我们的支架方法首先可用于确定神经母细胞瘤的新疗法，其次，结合患者来源的细胞以更好地预测个体患者的反应。首先，将储存在PBS中的支架放入层流罩中。使用无菌镊子轻轻地将支架从角落提起，然后压在侧壁上以去除多余的 PBS。

然后将有光泽层朝下的支架放在非粘附 24 孔板的孔的中心。用细胞系、接种密度和时间点的详细信息标记板。一次处理一种接种密度的细胞，并将剩余的细胞保持在培养箱中 37 摄氏度，直到准备好使用。

对于支架中的细胞附着，使用带有无菌吸头的P20移液器彻底混合细胞悬液，并在每个支架的中心加入20微升相关细胞悬液，确保细胞悬浮液保持在支架顶部，而不是在孔的侧壁或底部。让细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳和 95% 湿度下附着三到五个小时。在孵育结束时，使用P1000移液器缓慢向每个孔中加入一毫升预热的生长培养基，防止支架移位，并将板孵育过夜。

最初，每两到三天观察一次支架，以了解细胞在支架内增殖时生长培养基的颜色变化。使用慢速模式的 10 毫升移液枪从孔中取出并丢弃 1 毫升用过的培养基。当条件培养基用于实验时，将生物重复的用过的培养基收集在15毫升离心管中，并通过离心沉淀细胞碎片。

将上清液转移到新管中，并将管储存在零下 80 摄氏度。将移液器枪设置为滴注模式后，轻轻地向支架中加入两毫升预热的生长培养基。如上所述，孵育含有支架的板并在所需生长期内补充新鲜培养基。

在层流罩中，通过0.2微米无菌过滤器过滤到离心管中，对适当的细胞活力测定试剂进行灭菌。在37摄氏度的水浴中预热无菌溶液，完全生长培养基和无菌PBS。使用无菌镊子，将要分析的支架转移到新鲜的 24 孔板中，并用所有相关细节标记板。

向每个孔中加入900微升预热的生长培养基。然后向每个孔中加入 100 微升无菌细胞活力试剂。对于阴性对照，在没有支架的孔中加入 900 微升培养基和 100 微升无菌细胞活力试剂。

盖上板上的盖子，轻轻摇晃板约三分钟，将稀释的细胞活力试剂分布在整个孔中。将板在 37 摄氏度与 5% 二氧化碳和 95% 湿度一起孵育。从培养箱中取出培养板后，轻轻摇晃培养板几秒钟并生成一式三份，如文本手稿所示。

通过将 100 微升孵育培养基和试剂从 24 孔板的一个孔转移到半透明 96 孔板的一个孔中来生成技术一式三份，并为一个孔执行此步骤总共 3 次。用铝箔覆盖 96 孔板，以保护细胞活力试剂免受光线照射。从24孔板的支架中取出并丢弃剩余的700微升培养基和试剂。

用一毫升无菌PBS清洗每个支架两次。使用酶标仪测量 570 和 600 纳米处的吸光度，并根据制造商的建议计算细胞活力试剂的减少百分比。使用适当的软件对细胞活力结果进行统计分析。

输入生物一式三份值以产生误差线并指示测定变异性。使用适当的生物统计学软件进行单因素方差分析测试，以检查实验时间范围内细胞活力的变化。指出图表上时间点之间的显着差异，如文本手稿中所述。

评估了在支架上生长的两种神经母细胞瘤细胞系 KellyLuc 和 IMR32 的活力。随着时间的推移，细胞密度的增加导致细胞活力试剂的进一步降低。通过量化从支架中提取的DNA间接测量支架上的细胞生长，并计算每个样品的细胞。

随着时间的流逝，IMR32细胞的生长增加，然后是KellyLuc细胞。通过苏木精、伊红和免疫组化染色目视评估支架上细胞的生长形态和分布。与侵入性较小的Kelly细胞系相比，KellyCis83细胞生长得更快，并且更深入地浸润到两种支架组合物中。

在纳米羟基磷灰石上生长的 IMR32 在 14 天内表现出与大而密集的簇形成对比的生长模式。免疫组化染色、鬼笔环肽和DAPI染色监测细胞特异性状，在胶原-糖胺聚糖支架上Kelly和KellyCis83细胞中观察到肌动蛋白丰度。对于体外细胞活性评估，测量了嗜铬粒蛋白A的分泌水平，与常规2D培养的生长相比，在胶原-糖胺聚糖和胶原纳米羟基磷灰石支架上生长的细胞产生了更多的嗜铬粒蛋白A。

化疗耐药的 KellyCis83 细胞系比 Kelly 细胞系分泌更多的嗜铬粒蛋白 A。细胞附着后，细胞可以用各种疗法处理。与传统的2D培养相比，这将为细胞对药物的反应提供更具生理相关性的结果。

这种技术使研究人员能够更好地探索癌细胞在肿瘤微环境中的行为和对刺激的反应，从反应到治疗或与其他细胞类型的相互作用。