三维 体外 基于胶原支架的神经母细胞瘤仿生模型

本方案提供了一种三维生物工程模型，可高度模拟天然组织。该模型有望用于发现神经母细胞瘤治疗与诊断中的新型治疗靶点和生物标志物。其主要优势在于采用可重复的技术实现了批次间的一致性，从而创建出更接近生理状态的实验条件，以研究肿瘤微环境。

我们的支架方法首先可用于鉴定神经母细胞瘤的新型治疗药物，其次可整合患者来源的细胞，以更准确地预测个体患者的治疗反应。开始时，将保存在PBS中的支架放入超净工作台中。使用无菌镊子轻轻从支架的角落夹起，并将其紧贴容器侧壁，以去除多余的PBS。

然后将支架的光面朝下，置于非黏附性24孔板孔的中央。在孔板上标记细胞系、接种密度和时间点等信息。每次操作一种接种密度的细胞，并将剩余细胞在使用前置于37摄氏度培养箱中保存。

进行支架上的细胞接种时，使用带无菌吸头的P20移液器充分混匀细胞悬液，并在每块支架的中心加入20微升相应的细胞悬液，确保细胞悬液停留在支架表面，而非孔的侧壁或底部。将细胞在37°C、5%二氧化碳及95%湿度条件下孵育3至5小时，使其贴壁。孵育结束后，使用P1000移液器缓慢向每个孔中加入1毫升预热的生长培养基，注意避免支架移位，并将培养板置于培养箱中过夜孵育。

最初每隔两到三天观察支架内细胞增殖过程中培养基的颜色变化。使用10毫升移液枪的慢速模式，从孔中移除并弃去1毫升废液培养基。当实验需要使用条件培养基时，将生物学重复样本的废液培养基收集至15毫升离心管中，通过离心沉淀去除细胞碎片。

将上清液转移至新的离心管中，并将离心管置于-80°C保存。将移液枪调至滴加模式后，轻轻向支架中加入2 mL预热的生长培养基。将含有支架的培养板进行孵育，并在所需培养期间定期更换新鲜培养基，操作如所示。

在超净工作台中，使用0.2微米无菌滤器将适当的细胞活力检测试剂过滤至离心管中以进行灭菌。将无菌溶液、完全培养基和无菌PBS置于37摄氏度水浴中预热。使用无菌镊子将待分析的支架转移至新的24孔板中，并在板上标注所有相关信息。

向每个孔中加入 900 微升预热的培养基。然后向每个孔中加入 100 微升无菌细胞活力试剂。作为阴性对照，在不含支架的孔中加入 900 微升培养基和 100 微升无菌细胞活力试剂。

将板盖重新盖上，轻轻摇动板约三分钟，使稀释后的细胞活力检测试剂均匀分布于孔中。将板置于37°C、5%二氧化碳和95%湿度条件下孵育。从孵育箱中取出板后，轻轻摇动数秒，并按照文本稿件中的示范生成三复孔。

将24孔板中一个孔内的孵育后培养基和试剂各100微升转移至透明96孔板的一个孔中，以此方式对同一个孔重复操作共三次，制备技术三复孔。用铝箔包裹96孔板，避免细胞活力检测试剂暴露于光照。从24孔板的支架中移除并弃去剩余的700微升培养基和试剂。

用一毫升无菌 PBS 每个支架清洗两次。使用微孔板读数仪在 570 和 600 纳米处测量吸光度，并根据制造商的建议计算细胞活力试剂的还原百分比。使用适当的软件对细胞活力结果进行统计分析。

输入生物学重复的三组数值，以生成误差线并表明检测的变异性。使用适当的生物统计学软件进行单因素方差分析，以检验实验时间范围内细胞活力的变化。在图中注明时间点之间的显著性差异，具体说明见文稿正文。

评估了在支架上培养的两种神经母细胞瘤细胞系KellyLuc和IMR32的活力。随着细胞密度的增加，细胞活力检测试剂随时间的还原量增多。通过定量从支架中提取的DNA来间接测量细胞在支架上的生长情况，并计算每个样本中的细胞数量。

随着时间推移，IMR32细胞的生长增加，随后是KellyLuc细胞。通过苏木精、伊红和免疫组织化学染色对细胞在支架上的生长形态和分布进行了直观评估。与侵袭性较低的Kelly细胞系相比，KellyCis83细胞生长更快，并且更深地浸润到两种支架成分中。

在纳米羟基磷灰石上培养14天后，IMR32细胞表现出截然不同的生长模式，形成大而密集的细胞簇。通过免疫组织化学染色，随后进行鬼笔环肽和DAPI染色，监测细胞特异性特征，并观察到Kelly和KellyCis83细胞在胶原-糖胺聚糖支架上肌动蛋白的丰度较高。在体外细胞活性评估中，检测了嗜铬粒蛋白A的分泌水平，结果显示，在胶原-糖胺聚糖支架和胶原-纳米羟基磷灰石支架上培养的细胞比在传统二维培养条件下产生更多的嗜铬粒蛋白A。

耐化学药物的 KellyCis83 细胞系比 Kelly 细胞系分泌更多的嗜铬粒蛋白 A。细胞贴壁后，可使用多种治疗药物进行处理。与传统的二维培养相比，这种方法能提供更接近生理状态的细胞对药物反应的结果。

该技术可帮助研究人员更深入地探究癌细胞在肿瘤微环境中的行为及其对刺激的反应，包括对治疗药物的响应或其他细胞类型的相互作用。