用蛋白毒性应激器治疗大 肠杆菌 后蛋白质聚合物的提取和可视化

暴露在压力中会导致蛋白质聚集，并导致细菌表型行为发生重大变化。本视频中描述的程序允许在压力处理后提取和可视化蛋白质聚合物。与其他已公布的程序相比，此协议要求较低的细胞数量和避免复杂的物理中断过程，以及耗时的洗涤和孵化步骤。

此协议可用于研究各种克阴性和克阳性细菌中的蛋白质聚合。您还可以分析基因缺失的影响或比较蛋白毒化合物的功效。首先接种大肠杆菌株MG1655和尿病原性大肠杆菌株CFT073的单一菌落，每粒进入5毫升的利生肉汤，或LB，介质。

在37摄氏度和300转/分下孵育两种肉汤培养物，时间为14至16小时。将每个菌株稀释到 600 纳米（OD600）的光学密度为 0.1，放入包含 70 毫升 MOPS-g 介质的 500 毫升烧瓶中。在 37 度和 300 rpm 下孵化烧瓶，直到达到中日志阶段。

孵化后，将每种培养物的20毫升转移到三个预热的125毫升烧瓶中，并在37摄氏度和300转时孵育它们两分钟。在 MOPS-g 介质中准备每毫升两毫克的抗菌化合物溶液。将此解决方案添加到每个培养物中，以达到所需的浓度，并添加未经处理的控制所需的 MOPS-g 介质体积。

经过 45 分钟的压力处理后，确定每个培养的 OD600。对于每个样品，4 毫升培养物，其中 OD600 为 1 到 15 毫升离心机管。将细胞颗粒重新用于50微升冰冷裂解缓冲器。

在冰上孵化样品30分钟。在样品中加入360微升的冰冷缓冲器A，然后通过管道轻轻混合。将样品转移到两毫升微中心管中，其中约200微升的0.5毫米玻璃珠。

在温度混合器中在 8 摄氏度下孵育管子 30 分钟，在 1400 rpm 时进行摇晃。在冰上孵育管子五分钟，不摇晃，以安顿玻璃珠。然后将细胞裂解物的200微升转移到1.7毫升微中心管中。

在16，000次克和4摄氏度下离心细胞解解20分钟。收集超纳特，稍后将用作可溶性蛋白质样本。使用移液器在 200 微升冰冷缓冲器 A. Centrifuge 中以 16，000 倍 g 和 4 摄氏度的速度将颗粒重新悬浮在 20 分钟内。

然后小心地完全取出超高那。使用移液器小心地将颗粒重新浸入 200 微升冰冷缓冲器 B. Centrifufus 管中，并小心地取出超高分子。然后用缓冲器A.resuspend颗粒在100微升1倍减少SDS样品缓冲器中重复洗涤，并在95摄氏度的热混合器中煮5分钟。

将一卷100%TCA与先前收集的四卷可溶性蛋白质样本混合，在4摄氏度下孵育10分钟，用于蛋白质沉淀。将样品在21，000次克和4摄氏度下离心5分钟，以获得沉淀物，并去除超高纳特。使用200微升冰冷丙酮清洗颗粒，去除细胞碎片。

再次离心样品以获得沉淀物，并去除超高纳特。要从颗粒中取出剩余的丙酮，请将热混合器中的微中心管保持在 37 摄氏度，并打开盖子。然后加入100微升1倍减少SDS缓冲完全溶解颗粒，并在95摄氏度下煮沸样品5分钟。

立即将样品加载到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，或将样品存储在零下 20 摄氏度，以便稍后继续。准备文本手稿中描述的两种分离凝胶。使用一毫升移液器将凝胶倒在玻璃板之间，确保上两厘米的凝胶不含混合物。

在分离凝胶上添加 70% 乙醇，在两层之间创建均匀的界面。分离凝胶聚合后，使用文本手稿中的说明准备堆叠凝胶。然后从分离的凝胶中取出乙醇，并添加堆叠凝胶溶液。

小心地插入一个梳子，用所需的口袋数量，而不引入气泡，并允许凝胶聚合20至30分钟。将每个样品的四微升以及蛋白质梯子装载到单独的井中。然后在室温下以 144 伏特的三甘氨酸运行缓冲器中运行凝胶 45 分钟。

使用预加热的费尔班克斯溶液 A 将摇摇器上的凝胶涂上 30 分钟，预加热的费尔班克斯溶液 D 将摇摇器上的凝胶除色，直到达到所需的背景。与未经治疗的细胞相比，当细胞以每毫升175微克和抗菌剂每毫升200微克进行治疗时，蛋白质聚集量有所增加。在更敏感的MG1655菌株中，不溶性蛋白质分数的增加更为明显。

与未经治疗的细胞相比，当细胞以每毫升175微克和抗菌剂每毫升200微克进行治疗时，可溶性蛋白质的数量有所减少。在尝试此协议时，请记住，在 600 纳米下对光学密度的正常化对于比较样品中蛋白质聚合的程度非常重要。