体外重建人类视网膜母细胞瘤

视网膜母细胞瘤是儿童时期最常见的眼内肿瘤。临床样本难以获取，而小鼠模型无法形成视网膜母细胞瘤。因此，体外生成视网膜母细胞瘤对于观察其发生、增殖和生长过程，以及开发新型治疗药物至关重要。

该方案的效率可达到约100%，但视网膜母细胞瘤的生成时间因个体差异而有所不同，通常在第45天至第120天之间。为维持视网膜母细胞瘤或RB1基因敲除的人胚胎干细胞，需将基因编辑后的H9细胞培养于经生长因子减少型基底膜基质包被的6孔板中，并每天更换培养基。传代细胞时，将细胞在37°C的EDTA缓冲液中孵育3.5分钟，或在室温下孵育5分钟。

将细胞培养至融合度达到80%。随后，为启动视网膜细胞分化，移除培养基，并用1 mL DPBS冲洗细胞。接着，加入1 mL Dispase缓冲液，37°C孵育5分钟，使细胞集落隆起。

在显微镜下观察细胞克隆。当克隆边缘开始卷起时，吸除Dispase缓冲液，并用一毫升DPBS轻轻冲洗细胞一次。然后向孔中加入一毫升培养基一，使用10微升标准移液器吸头将克隆切割成小块。

使用细胞刮刀刮取培养基中剩余的细胞。将细胞收集到15毫升离心管中，通过离心收获细胞。离心后，保留约50微升上清液，以分散培养基中的细胞。

然后加入250 µL生长因子减少的基底膜基质，通过轻轻振荡混匀。混匀后，将含有悬浮细胞的15 mL离心管放入37 °C培养箱中。经过20分钟孵育后，细胞与生长因子减少的基底膜基质应形成固化的凝胶。

接下来，向15毫升离心管中加入1毫升培养基一。使用1毫升移液器将凝固的凝胶吹打两到三次，以分散团块。然后加入另外9毫升培养基一，并将细胞悬液转移至10厘米细胞培养皿中。

将培养皿置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。此日记为第0天。第1天，使用显微镜观察细胞。

通常情况下，每块凝胶中可观察到三至四个囊肿。在第五天，将上清液收集至15毫升离心管中，使囊肿沉降至管底，然后用新鲜培养基替换上清液。将管中的囊肿分散至两个10厘米培养皿中，确保每个培养皿中至少含有300个囊肿。

第7天，大多数附着在培养皿上的囊肿会铺展开并形成贴壁克隆。第10天，更换为新鲜培养基一，确保所有囊肿仍附着在培养皿上。从第13天到第17天，在显微镜下观察细胞，以确认细胞正在铺展。

第15天，用一毫升DPBS冲洗细胞一次后，加入一毫升Dispase溶液，在37摄氏度下孵育。五分钟后，移除Dispase缓冲液，并用一毫升DPBS轻轻冲洗细胞培养物。然后向每个10厘米培养皿中加入10毫升培养基二，在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中孵育。

24小时后，贴壁培养的细胞会自发脱离并自组装形成视网膜类器官。脱离后第3天，将细胞从细胞培养皿中收集至15毫升离心管中。待类器官沉降后，吸除管中上清液，并将类器官转移至新的非黏附性培养皿中，加入10毫升培养基二，继续培养4天。

脱离后一周，将培养基更换为培养基三，并从当天起始终使用培养基三培养类器官。在视网膜类器官培养的第27天，视泡结构已清晰可见，约90%的类器官呈现该结构。视网膜母细胞瘤的首次检测出现在第45天，到第50天时可明显触及。

当培养至第90天时，视泡结构主要被视网膜母细胞瘤包裹。此时可将视网膜母细胞瘤分离出来，并进一步作为细胞系进行培养。在第105天，超过80%的视网膜类器官已完全被视网膜母细胞瘤包绕。

与H9来源的视网膜类器官相比，这些类器官高表达增殖标志物Ki67和癌基因标志物SYK，表明其具有肿瘤发生特性。此外，视网膜母细胞瘤类器官中视锥前体细胞标志物ARR3和光感受器前体细胞标志物CRX的高表达表明，它们起源于视锥前体细胞。此处展示了视网膜母细胞瘤生成过程中三个形态学阶段的下方和上方结果。

根据形态学特征可轻松区分已分化与未分化的人类胚胎干细胞。应选择未分化的细胞用于视网膜母细胞瘤的形成。在第5天，形成的球体应为中空而非实心。

视网膜母细胞瘤来源于具有视泡结构的视网膜类器官。下部类器官不会产生视网膜母细胞瘤。在操作过程中，所有枪头应保持低温，基底膜基质应在4°C下融化后再加入离心管中。

这是该分化方案中的关键步骤。