CRISPR干扰（CRISPRI）在瘦素病原物种中基因沉默的应用

我叫贾拉思·纳利，我是爱荷华州艾姆斯市国家动物疾病中心的研究小组的成员，我们致力于瘦身病的研究。肺螺旋体病是一种被忽视的疾病。这是一种全球性疾病。

实际上，我们对这些独特的细菌组是如何引起感染的了解非常有限。因此，今天的介绍是提供一个新的工具的概览，这是可用的，以促进评估瘦素螺旋体病的致病机制，特别是沉默由瘦素皮拉表达的特定基因，使用一种称为CRISPR干扰的技术。然而，选择牛顿殖民地的能力在很大程度上取决于为这些挑剔的瘦子提供最好的生长介质。

所以，首先，我们将向你介绍里克霍恩斯比，谁非常简短地介绍了一个新的媒体，以传播这些挑剔的细菌。然后，我们将向您介绍路易斯·费尔南德斯，他将讨论CRISPR干扰方法，以压制瘦身内的目标基因。嗨，我是里克·霍恩斯比

自从100多年前由阿纳达鉴定以来，瘦子皮拉通常被分离出来，在29摄氏度下繁殖，这种温度既不能反映环境，也不能反映哺乳动物的体温。10年前，美国农业部ERS开始研究瘦子媒体的改进，从这项研究中，霍恩斯比-阿尔特-纳利媒体得到了发展。利用这种媒介，临床医生和研究人员能够更迅速地从外地病例中分离和传播瘦素，并在温度和更类似于哺乳动物宿主的环境中进行体外研究。

我们继续优化这种媒体，但就目前情况而言，HAN已显示出显著改善兽医和人类体外临床隔离以及开发更有效的预防瘦虫病疫苗的潜力。嗨，我是路易斯·费尔南德斯迄今为止，对瘦素螺旋体病的发病机制仍然缺乏探索，这主要是由于缺乏有效和容易执行的遗传管。

在这里，我们将描述一种新技术称为CRISPR干扰或CRISPR。这种技术非常简单，因为我们只需要表达两个成分，一个DNA结合蛋白称为死Cas9，或dCas9，和一个幻想RNA分子称为单导RNA。复杂的dCas9和引导RNA将使我们的目标基因进行碱基配对，从而减少甚至阻止转录。

此外，通过使用新描述的HAN介质，我们可以大幅缩短突变恢复的菌落形成时间。第一步是定义指南 RNA 中将包含的原空间器。这个序列由20个核苷酸组成，这些核苷酸将定义与所需基因目标的碱基配对。

向 Web 服务器 CHOPCHOP 提交核苷酸序列，其参数定义为链球菌、Cas9 和原空间器相邻主题 NGG。根据结果，选择在负趋势中得分最高的原空间器。NGG 主题将不包括在最后序列中。

我们一直在使用lipL32促进器来表达单导RNA，该RNA将在保存的dCas9脚手架上以五金的速度包含可变的20核苷酸。获得盒式磁带后，它将被降级到PMaOri。dCas9 质粒在 Xma1 限制站点。

对于共生瘦细胞生长在29或37摄氏度的HAN介质。在结合的前一天，捐赠者均衡细胞生长在LB介质中，辅以二氨基酸、DAP和光谱霉素。接下来， 在结合的日子烧烤饱和的大肠杆菌文化在 Lb 加 Dap 。

在生物安全罩内，将膜过滤器放在玻璃底座顶部，然后组装过滤装置，然后组装 15 毫升玻璃漏斗。这两件作品都由这个春天的夹子夹在一起。然后将玻璃连接到真空泵，在漏斗中加入五毫升的瘦子。

接下来，添加含有感兴趣的质粒的E.Coliβ 2163菌株。音量会因文化的光学密度而异。我们的目标是一对一的细胞吹笛。

转动真空泵，现在液体，我们将通过膜和细胞将集中在它的顶部。采取过滤器，并把它放在EMJH板加上DAB，双库里尔侧向上。在29摄氏度下孵育板24小时。

然后从板中回收过滤器，并将其放入 50 ML 圆锥管中。使用一毫升液体HAN介质通过管道从过滤器中回收细胞。通过暗场显微镜可视化恢复的细胞。

在这个阶段，可以看到大肠杆菌和瘦小肠杆菌的等量。100 到 200 微升用于将细菌传播到含有光谱霉素的 HAN 板上。在这个阶段，DAP被省略，大肠杆菌不会生长。

板块孕育在37摄氏度和3%的二氧化碳。殖民地应在8至10天之间显现出来。莱普托斯皮拉审讯殖民地是有点棘手的可视化。

在这里，我们展示过度生长的殖民地，使其更容易看到他们。加入100微升液体HAN，加入1.5ML管，用于恢复突变体。建议从每个盘子中至少取出三个菌落。

使用移液器尖端，从盘子中取回各个菌落。阿格尔预计将被单独带走。殖民地应从含有MTP PMaori的控制板中取出。

dCas9 质粒。和板与瘦素含有质粒与 dcas9 和指导 RNA 专为目标基因设计。恢复的细胞现在可以在暗场显微镜下可视化，以确认存在离开可行的瘦肉精。

离开瘦素可视化后，将细胞转移到含有光谱霉素的液体HAN介质中。培养后生长，细胞现在可以恢复沉默确认和表型评估。如果对目标蛋白质的抗体可用，免疫膨胀是一种直截了当的方法来评估沉默。

含有 pMAOri 的利普托斯皮拉。dCas9 单独，或与指南RNA卡斯由 PCR 评估，木侧引。DMT质粒将产生大约300个碱基对的带子，当有引导RNA盒式磁带时，只能达到大约700个底座对。

使用全细胞提取物进行免疫膨胀进行沉默确认，在含有dCas9表达质粒的细胞中废除lipL32蛋白质表达，并引导RNA瞄准该基因。并且链接 A 和链接 B 都不存在包含引导 RNA 的细胞，这是两个基因的特异性。控制唇41可以在所有车道上看到。

因此，我们使用了CRISPR干扰瘦素审讯，我们也使用它对几个额外的致病物种的瘦素。我们用它来压制特定的基因，以及沉默小非编码RNA的表达。我们的研究兴趣在于了解感染的致病机制，因此我们通常会寻找识别差异因素，但很明显，您可以根据自己的研究领域来静音自己的选择基因。

例如，这可能是活力或理解瘦素如何坚持在环境中，或新陈代谢。在任何情况下，你应该能够产生一个特定的突变体，让你执行功能基因组学，并了解有关基因的生物学意义。因此，从我们所有在国家动物疾病中心，我们祝你最好的运气与你的研究。