基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与HIV-1感染表征

该方案可在单细胞水平上捕捉实时动力学信息。我们能够测量单个细胞在HIV感染后的参数变化，并将早期信号事件与病毒生命周期的后续步骤相关联。这是一种可整合且可扩展的替代方法，取代了传统的成像技术，采用一种新型的光流控平台，实现单细胞分选、培养、成像及软件自动化。

这是首个建立的用于纳米流控、高通量、长期单细胞培养与成像的方法。该技术可广泛应用于研究多种疾病状态下细胞信号传导动力学及动态分子相互作用。对该方法进行可视化演示，对于阐明实验装置的构建、细胞如何通过光学方式被分选至微室以及如何通过芯片设置灌注过程至关重要。

首先，配制新鲜的Fluo-4 AM负载溶液：取25微升100倍浓缩的去垢剂溶剂和2.5微升1,000倍浓缩的Fluo-4 AM，加入1.5毫升离心管中，涡旋混匀。加入2.5毫升培养基至负载溶液中，颠倒混匀。将两百万个MT-4细胞在500 × g条件下离心3分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2毫升配制好的Fluo-4 AM负载溶液中。

用移液器将重悬的细胞加入35毫米的培养皿中。在37摄氏度孵育15至30分钟，然后在室温下再孵育15至30分钟。将细胞悬液转移至离心管中，在500 × g下离心3分钟，随后弃去上清液。

用一毫升培养基通过移液重悬细胞沉淀，并在500 × g下离心3分钟以进行洗涤。用培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升两百万个细胞，体积至少为50微升。为使用润湿液准备芯片（润湿液有助于细胞捕获），将含有2毫升润湿液和50毫升去离子水的离心管与新的光流控芯片一起装入仪器，运行“润湿芯片”功能，使润湿液充满芯片。

将芯片在 50 摄氏度下孵育，并用清水冲洗芯片三次。清水冲洗完成后，用 250 微升培养基进行三个循环的冲洗。在上样前，向此前步骤获得的细胞悬液中添加占 1/100 的 F127 去垢剂溶质，以降低细胞黏附于芯片通道的可能性。

使用仪器的导出针通过加载操作和小体积导入功能，从1.5毫升离心管中导入细胞，细胞包体积为五微升。采用优化的光电子定位（OEP）电压4.3伏特和每秒五微米的笼速，使用自动圈选功能对细胞进行圈选；该功能将自动识别单个细胞，用OEP笼将其包围，并将其移至附近的圈选区域。若自动圈选后仍有目标细胞残留，请使用手动圈选功能选择目标细胞及其目标圈选区域。

完成画线后，用250微升培养基冲洗芯片三次，以清除芯片中残留的未固定细胞。画线完成后，在FITC、Texas Red和DAPI通道中获取细胞的荧光图像，以测定Fluo-4、mCherry及自发荧光的基线水平。通过出口针头缓慢将HIV-1悬液加入芯片，使HIV-1的浓度达到每两百万细胞13纳克HIV-1 NLCI。

在加入HIV-1后立即开始，在10分钟的时间过程中反复采集FITC和DAPI通道的图像。在感染后第1、2、3和4天分别采集Texas Red和DAPI通道的图像。该方法用于通过mCherry检测来鉴定和聚类HIV感染与未感染细胞。

mCherry信号变化高于或低于40,000平均荧光强度的细胞分别被归类为mCherry高表达群体或mCherry低表达群体。通过在九分钟的时间过程中重复检测Fluo-4荧光以测量细胞内钙水平，分析这些聚类的钙离子内流动力学，结果表明在HIV感染细胞中存在早期钙离子内流。钙离子内流与mCherry荧光之间呈现出显著的正相关关系。

进行该实验操作时，必须注意使用处于对数生长期的细胞进行病毒生产和感染，因为过度生长的细胞会导致本实验信号显著降低。操作 HIV-1 可能具有危险性，因此在执行该操作时，应始终遵循美国职业安全与健康管理局（OSHA）《血液传播病原体标准》所规定的 BSL-2 级别防护措施。

这项技术令人振奋，因为它将使我们能够在受控条件下研究单细胞的表型或转录变化。该技术在多种细胞类型中具有广泛的应用潜力，可用于关联刺激对分子通路的影响。