Name: 使用多参数光伏平台对钙流入和HIV-1感染进行单细胞特征描述 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 了解使用光流控平台对HIV-1感染进行单细胞实时监测的方法。该技术可捕获单细胞水平的实时动力学，关联早期信号事件与病毒生命周期延迟步骤，为细胞生物学和病毒学研究提供高通量纵向观察的可扩展替代方案。

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我们感谢 Benjamin Chen 博士在科学讨论方面提供的帮助。本工作由以下基金资助：K08AI120806（THS）、R01DA052255（THS 和 KB）以及 R21AI152833（THS 和 KB）。

1. 成像用细胞的准备
<ol>
	<li>制备新鲜的 Fluo-4 AM 加载溶液：向 1.5 mL 离心管中加入 25 µL 的 100 倍浓缩去垢剂溶剂，再加入 2.5 µL 的 1000 倍浓缩 Fluo-4 AM，涡旋混匀。</li>
	<li>将 2.5 mL 培养基用移液器加入加载溶液中，轻轻颠倒混匀，避光保存。</li>
	<li>将 2 × 106 个 MT-4 细胞在 500 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 新配制的 Fluo-4 AM 加载溶液中，避光保存。</li>
	<li>将重悬的细胞用移液器转移至 35 mm 培养皿中，在 37 °C 下孵育 15–30 分钟，随后在室温下继续孵育 15–30 分钟。</li>
	<li>将细胞悬液转移至离心管中，在 500 × g 条件下离心 3 分钟，吸除含加载溶液的上清液。</li>
	<li>用移液器将细胞沉淀在 1 mL 培养基中重悬，于 500 × g 离心 3 分钟进行洗涤。</li>
	<li>用培养基将细胞沉淀重悬，调整细胞浓度至 2 × 106 个细胞/mL（最少 50 µL），避光保存。</li>
</ol>
2. 光流控系统的准备、细胞加载和细胞捕获
<ol>
	<li>使用润湿溶液制备芯片，以促进细胞捕获。
	<ol>
		<li>具体操作为：将含有 2 mL 润湿溶液和 50 mL 去离子水的离心管与新的光流控芯片一起装载到仪器上，运行Wet Chip功能。该功能将通过系统流路自动向芯片灌注润湿溶液，在 50 °C 下孵育芯片，并用去离子水冲洗芯片 3 次。</li>
		<li>完成水冲洗后，用 250 µL 培养基进行 3 个循环的芯片冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在上样前，向步骤 1.8 得到的细胞悬液中添加 1:100 的 F-127 去垢剂溶质，以降低细胞黏附于芯片通道的可能性。</li>
	<li>使用仪器的导出针，通过Load操作和Small Volume Import功能，从 1.5 mL 离心管中导入细胞，设定细胞包体积为 5 µL。</li>
	<li>采用优化的光电定位（OEP）参数进行细胞捕获，电压为 4.3 V，笼速为 5 µm/s。捕获过程通过 OEP 实现。可使用Autopen功能自动完成捕获：该功能将自动识别单个细胞，用 OEP 笼将其包围，并移至邻近的围栏区域。若自动捕获后仍有目标细胞未被捕获，可使用Manual pen功能，通过鼠标点击选择目标细胞，再点击另一次选择目标围栏区域。</li>
	<li>捕获完成后（无论是Autopen功能自动结束，还是已获得所需数量的被捕获细胞），用 250 µL 培养基进行 3 个循环的冲洗，以清除芯片中残留的未被捕获细胞。</li>
</ol>
3. 单细胞感染与功能成像
<ol>
	<li>细胞铺板后，获取细胞在FITC、Texas Red和DAPI通道的荧光图像，以测定Fluo-4、mCherry和自发荧光的基线水平。</li>
	<li>通过导出针将HIV-1悬液缓慢加入微芯片中，使终浓度为每2 × 106个细胞加入13 ng HIV-1 NL-CI。</li>
	<li>加入HIV-1后，立即在10分钟的时间过程中连续获取FITC和DAPI通道的图像。</li>
	<li>在感染后第1、2、3和4天（DPI）获取Texas Red和DAPI通道的图像。</li>
</ol>
4. 使用 FIJI 软件分析单细胞功能成像数据
<ol>
	<li>在每个感兴趣的时间点和成像通道中，使用 FIJI 的点选工具和测量功能，测量每个细胞的 Fluo-4、mCherry 和自发荧光信号。同时通过计算每个细胞所在笔区和芯片区域的平均荧光强度（MFI）来测量背景荧光。</li>
	<li>通过使用测量功能测定区域选择中的 MFI，并从细胞荧光值中减去该值，以校正背景荧光和自发荧光。</li>
	<li>对每张芯片图像的背景荧光进行归一化：测量每个视野中芯片的 MFI，然后从所有其他芯片的 MFI 测量值中减去背景荧光最低的芯片的 MFI 值。</li>
	<li>对每个含细胞的笔区的背景荧光进行归一化：测量每个视野中每个细胞所在笔区的 MFI，然后从该视野中每个细胞的原始 MFI 值中减去该值。</li>
	<li>校正细胞自发荧光：将每个细胞在第 0 天和第 4 天的 DAPI MFI 值从其对应的第 0 天和第 4 天 mCherry MFI 值中减去。</li>
</ol>

<ol><li>Aberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+inflammation%2C+and+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Antiviral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aging, inflammation, and HIV infection.</a> Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).</li>
<li>Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+effects+of+inflammation+on+health+during+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection.</a> Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).</li>
<li>Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors%3A+Key+mediators+of+HIV-1+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Fromtiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation.</a> Fromtiers in Immunology. 6, 585(2015).</li>
<li>Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X1+receptor+antagonists+inhibit+HIV-1+fusion+by+blocking+virus-coreceptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).</li>
<li>Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+are+required+for+HIV-1+infection+of+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages.</a> Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).</li>
<li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+HIV-cell+fusion+assay+for+discovery+of+virus+entry+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technology%22%5BJournal%5D)">High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).</li>
<li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+Antagonists+inhibit+HIV-1+productive+infection+and+inflammatory+cytokines+interleukin-10+%28IL-10%29+and+IL-1%CE%B2+in+a+human+tonsil+explant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model.</a> Journal of Virology. 93 (1), 01186(2019).</li>
<li>Sorrell, M. E., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-gated+purinergic+receptors+regulate+HIV-1+Tat+and+morphine+related+neurotoxicity+in+primary+mouse+striatal+neuron-glia+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).</li>
<li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).</li>
<li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2RX7+at+the+host-pathogen+interface+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).</li>
<li>Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+mode+of+human+immunodeficiency+virus+transfer+between+T+cells+is+mediated+by+sustained+Env-dependent+neutralization-resistant+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses.</a> Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).</li>
<li>Dale, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li>
<li>Gee, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca%282%2B%29-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+measurements+as+a+method+in+studies+on+activity+of+purinergic+P2X+receptor+channels%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).</li>
<li>Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+potency+and+incomplete+neutralization+of+broadly+neutralizing+antibodies+against+cell-to-cell+transmission+of+HIV-1+with+transmitted+founder+envs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02425(2017).</li>
<li>Beaumont, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+cell+characterization+using+nanofluidic+technology+facilitates+real-time+phenotypic+and+genotypic+elucidation+of+intratumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity.</a> bioRxiv. , 457010(2018).</li>
<li>Le, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assuring+clonality+on+the+beacon+digital+cell+line+development+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform.</a> Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247(2020).</li>
<li>Mocciaro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+cell+identification+and+sorting+%28LACIS%29+for+selection+of+edited+clones+on+a+nanofluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device.</a> Communications in Biology. 1, 41(2018).</li>
<li>Winters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single+B+cell+antibody+discovery+using+nanopens+and+structured+light%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light.</a> MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).</li>
<li>Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput-compatible+assays+using+a+genetically-encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator.</a> Science Reports. 9 (1), 12692(2019).</li>
<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+to+identify+inhibitors+of+HIV-1+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58074(2018).</li>
<li>Soare, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X1+selective+antagonists+block+HIV-1+infection+through+inhibition+of+envelope+conformation-dependent+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion.</a> Journal of Virology. 94 (6), 01622(2020).</li>
</ol>

R.P.S. 是 Sema4 的员工。其他作者没有利益冲突需要披露。

所述用于研究单细胞中钙离子内流与 HIV-1 有效感染之间关系的方法，可被调整用于研究细胞内钙动力学对其他感兴趣激动剂或拮抗剂的响应。细胞成像前处理操作简便，耗时较少，所需试剂亦可通过多家常用厂商提供的便捷试剂盒获得。基于 Fluo-4 的钙离子检测方法在文献中已有充分描述，且该平台可轻松将 HIV-1 替换为其他病毒或感兴趣化合物进行研究。本方法适用于不同细胞类型和培养基质，支持使用其他或额外的荧光通道，并可同时或依次成像多种荧光染料。
此外，该方法可广泛适用于纵向时间过程中荧光标记事件的研究。标准的高通量方法（如流式细胞术）无法实现对随时间变化的离散事件进行配对研究。传统的单细胞荧光显微成像受限于通量、细胞在视野间的迁移以及耗时较长。通过将荧光成像与高通量、自动化的单细胞培养相结合，该方法能够在短期和长期时间间隔内揭示相关的分子动力学、后续效应及相互作用。需要注意的是，软件和图像分析的优化对每项应用都至关重要。
显微镜配备明场以及Cy5、Texas Red、FITC和DAPI荧光通道16...

慢性炎症是导致艾滋病病毒（HIV）相关早期发病和死亡的主要原因1,2,3。HIV可通过多种机制激活炎症信号通路，近期证据表明P2X受体在HIV进入细胞过程中发挥作用，这类受体属于钙离子通道型腺苷三磷酸（ATP）受体3,4,5,6,7,8,9,10。嘌呤能受体P2X亚型（P2XR）可能是促进此类炎症的重要因素。然而，HIV与P2XR相互作用的分子机制在很大程度上尚不清楚，且可能影响HIV-1病毒生命周期的早期和晚期阶段。明确驱动HIV相关慢性炎症的通路及其动力学特征，对于推进HIV感染者治疗方案的发展至关重要。
为了评估HIV-1是否直接激活P2X受体，必须平行检测P2XR的激活和HIV-1感染。P2XR活性和HIV-1感染的检测方法已分别建立：细胞内钙离子流入是P2XR激活的指标，而HIV-1的增殖性感染可通过RNA丰度进行定量。使用Fluo-4钙离子敏感性染料可检测钙离子流入产生的荧光信号，而HIV-NLCI11,12,13,14,15这种携带mCherry荧光报告蛋白的HIV病毒可用来可视化HIV-1感染。
由于P2X激活的指标（急性细胞钙离子内流）与HIV-1感染的指标（HIV-1 RNA合成）发生在不同的时间尺度上（数分钟 versus 数天），目前缺乏一种能够对P2X受体激活和HIV-1感染进行配对分析的高通量方法。传统的高通量实验技术（如流式细胞术）虽可实现细胞群体分析，但无法评估单个细胞中急性事件与长期事件之间的关联。而采用标准荧光显微镜进行单细胞成像的方法通量较低。这些实验技术的局限性凸显了开发新型高通量技术的必要性，以直接测量急性与长期细胞事件之间的关联。
所描述的光流控系统是一种新型平台，能够实现单细胞分选与分离、培养、成像以及软件自动化16,17,18,19。该系统为传统成像方法的局限性提供了一种集成化、高通量的替代方案。Beacon 平台包含一个由二氧化碳（CO2）和温度控制的培养箱，用于支持芯片上的细胞生长。芯片上具有光敏晶体管，可在特定光照下产生电场梯度。由此产生的介电泳力可用于将单个细胞在纳米流控芯片上移动至目标区域。细胞被分选到芯片上的“围栏”（pens）中，这些结构可形成物理屏障以实现单个细胞的隔离。在整个芯片中持续进行的层流培养基流动可防止细胞从围栏中迁移，同时允许营养物质及实验特异性试剂等小分子粒子扩散。芯片上方设有荧光显微镜。通过软件自动化，可在用户指定的时间点自动采集芯片的图像。
所有细胞表征均采用光流控系统进行单细胞筛选与操控。该系统集成了机械、微流控和光学组件，可实现单细胞的操控、检测、培养和成像。细胞被加载并培养在一次性纳米流控装置上，该装置包含3,500个独立腔室（笔室），每个腔室可容纳亚纳升级别的液体体积。利用光诱导介电泳效应，可将细胞在笔室内进行精确定位。 &#34;笼具&#34; 并在温度和 CO₂ 条件下培养2-受控条件。微流控系统可在芯片上灌注培养基或缓冲液，用于细胞培养或药物处理。通过可驱动的针头，可将细胞从孵育且封闭的培养板中导入和导出。&#160;可在明场以及荧光通道（包括 DAPI、FITC、TRed 或 Cy5）下以 4 倍或 10 倍放大倍数对芯片区域进行成像，以表征细胞表型或进行功能分析。整个系统通过软件实现自动化，可用于预设的工作流程或自定义实验。
HIV-1 感染与 P2XR 之间的关系已被研究，但尚未有报道能够并行直接表征这些相互作用的高通量方法。在此，作者描述了一种通过追踪单细胞水平上的急性钙离子内流及随后的 HIV-1 有效感染来研究 HIV-P2XR 相互作用的方法学。值得注意的是，该方法建立了一种新工具，可对单个细胞中的多个靶标进行直接、高通量、纵向的测量。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;Beacon光流控系统</td><td>Berkeley Lights</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;胎牛血清</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;FIJI</td><td>开源软件</td><td>PMID: 22743772, 22930834</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Fluo-4钙离子成像试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>&amp;nbsp;F10489</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;HIV-1 NLCINL4-3</td><td>Benjamin Chen实验室</td><td>PMID: 28148796</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Hyclone青霉素-链霉素溶液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>&amp;nbsp;SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;MT-4细胞</td><td>NIH艾滋病试剂库</td><td></td><td>&amp;nbsp;ARP-120</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;OptoSelect 3500芯片</td><td>Berkeley Lights</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;移液器吸头</td><td>Denville Scientific</td><td>&amp;nbsp;P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Prism 9.0.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;RPMI-1640培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;R8758</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Fisher Brand</td><td>&amp;nbsp;13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>组织培养罩</td><td>多种型号</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75培养瓶</td><td>Corning</td><td>3073</td><td></td></tr></tbody></table>

基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与hiv-1感染表征

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 引起一种慢性感染，全球超过 3700 万人受到影响。尽管接受抗逆转录病毒治疗，人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者仍会出现与慢性炎症相关的共病。然而，这些炎症信号尚未被充分表征。早期病毒进入事件对细胞信号激活及下游基因表达的影响，尚未在单细胞水平上被全面捕捉。本文作者描述了一种方法，该方法将活细胞荧光显微镜技术原理应用于一种自动化的单细胞平台，可在用户自定义的时间范围内培养并成像细胞，从而实现对动态细胞过程的高通量分析。该检测方法可追踪 HIV-1 感染后立即发生的早期事件的单细胞活体荧光显微图像，特别是病毒感染引发的钙离子内流，以及利用荧光报告病毒检测 productive 感染的发展过程。MT-4 细胞加载钙离子敏感性染料后，培养在纳米流控装置的独立小室中。培养的细胞被 HIV-1 报告病毒（HIV-1 NLCI）感染。位于纳米流控装置上方的荧光显微镜在急性 HIV-1 暴露后的 8 分钟内连续测量钙离子内流。在同一细胞群体中，productive HIV-1 感染情况在随后的 4 天内进行检测。通过对这些时间序列的成像数据进行分析，可明确病毒与宿主受体相互作用及信号通路动态变化。作者提出了一种集成化、可扩展的传统成像方法替代方案，采用一种新型的光流控平台，具备单细胞分选、培养、成像和软件自动化功能。该检测方法可在不同条件下（包括细胞类型、激动剂或拮抗剂效应）测量多种参数，从而评估各类事件的动力学特征。这是首个建立的用于纳米流控高通量纵向单细胞培养与成像的方法：该技术可广泛适用于研究细胞信号动力学及动态分子相互作用。

图1 展示了通过荧光显微镜获取的芯片格式及原始成像数据。图2 显示了通过mCherry信号对未感染细胞和感染细胞进行识别与聚类的结果。这些细胞聚类被用于钙离子内流动力学的分析，结果如图3所示，表明HIV感染细胞中存在早期钙离子内流现象。图4 显示钙离子内流与mCherry荧光信号之间存在显著正相关关系20。
<img alt="微流控芯片示意图；FITC、TRex信号用于分析钙离子和HIV；时间推移成像及数据图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62632/62632fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"><...

本文介绍了一种在纳米流体装置上对单个细胞进行监测以研究急性事件及有效的HIV-1感染的实验方案。成像数据可明确病毒与宿主受体之间的相互作用以及信号通路的动力学变化。这是首个用于高通量、纵向单细胞培养与成像的纳米流体技术方法，可用于研究信号动力学和分子相互作用。

基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与HIV-1感染表征

HIV-1 引起一种慢性感染，全球感染人数超过 3700 万。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者会经历……

该方案可在单细胞水平上捕捉实时动力学信息。我们能够测量单个细胞在HIV感染后的参数变化，并将早期信号事件与病毒生命周期的后续步骤相关联。这是一种可整合且可扩展的替代方法，取代了传统的成像技术，采用一种新型的光流控平台，实现单细胞分选、培养、成像及软件自动化。这是首个建立的用于纳米流控、高通量、长期单细胞培养与成像的方法。该技术可广泛应用于研究多种疾病状态下细胞信号传导动力学及动态分子相互作用。对该方法进行可视化演示，对于阐明实验装置的构建、细胞如何通过光学方式被分选至微室以及如何通过芯片设置灌注过程至关重要。首先，配制新鲜的Fluo-4 AM负载溶液：取25微升100倍浓缩的去垢剂溶剂和2.5微升1,000倍浓缩的Fluo-4 AM，加入1.5毫升离心管中，涡旋混匀。加入2.5毫升培养基至负载溶液中，颠倒混匀。将两百万个MT-4细胞在500 × g条件下离心3分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2毫升配制好的Fluo-4 AM负载溶液中。用移液器将重悬的细胞加入35毫米的培养皿中。在37摄氏度孵育15至30分钟，然后在室温下再孵育15至30分钟。将细胞悬液转移至离心管中，在500 × g下离心3分钟，随后弃去上清液。用一毫升培养基通过移液重悬细胞沉淀，并在500 × g下离心3分钟以进行洗涤。用培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升两百万个细胞，体积至少为50微升。为使用润湿液准备芯片（润湿液有助于细胞捕获），将含有2毫升润湿液和50毫升去离子水的离心管与新的光流控芯片一起装入仪器，运行“润湿芯片”功能，使润湿液充满芯片。将芯片在 50 摄氏度下孵育，并用清水冲洗芯片三次。清水冲洗完成后，用 250 微升培养基进行三个循环的冲洗。在上样前，向此前步骤获得的细胞悬液中添加占 1/100 的 F127 去垢剂溶质，以降低细胞黏附于芯片通道的可能性。使用仪器的导出针通过加载操作和小体积导入功能，从1.5毫升离心管中导入细胞，细胞包体积为五微升。采用优化的光电子定位（OEP）电压4.3伏特和每秒五微米的笼速，使用自动圈选功能对细胞进行圈选；该功能将自动识别单个细胞，用OEP笼将其包围，并将其移至附近的圈选区域。若自动圈选后仍有目标细胞残留，请使用手动圈选功能选择目标细胞及其目标圈选区域。完成画线后，用250微升培养基冲洗芯片三次，以清除芯片中残留的未固定细胞。画线完成后，在FITC、Texas Red和DAPI通道中获取细胞的荧光图像，以测定Fluo-4、mCherry及自发荧光的基线水平。通过出口针头缓慢将HIV-1悬液加入芯片，使HIV-1的浓度达到每两百万细胞13纳克HIV-1 NLCI。在加入HIV-1后立即开始，在10分钟的时间过程中反复采集FITC和DAPI通道的图像。在感染后第1、2、3和4天分别采集Texas Red和DAPI通道的图像。该方法用于通过mCherry检测来鉴定和聚类HIV感染与未感染细胞。mCherry信号变化高于或低于40,000平均荧光强度的细胞分别被归类为mCherry高表达群体或mCherry低表达群体。通过在九分钟的时间过程中重复检测Fluo-4荧光以测量细胞内钙水平，分析这些聚类的钙离子内流动力学，结果表明在HIV感染细胞中存在早期钙离子内流。钙离子内流与mCherry荧光之间呈现出显著的正相关关系。进行该实验操作时，必须注意使用处于对数生长期的细胞进行病毒生产和感染，因为过度生长的细胞会导致本实验信号显著降低。操作 HIV-1 可能具有危险性，因此在执行该操作时，应始终遵循美国职业安全与健康管理局（OSHA）《血液传播病原体标准》所规定的 BSL-2 级别防护措施。这项技术令人振奋，因为它将使我们能够在受控条件下研究单细胞的表型或转录变化。该技术在多种细胞类型中具有广泛的应用潜力，可用于关联刺激对分子通路的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用多参数光伏平台对钙流入和HIV-1感染进行单细胞特征描述

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

我们回顾了近期在手机上利用紧凑且低成本的光流控附件集成荧光显微镜与成像流式细胞术工具的研究成果。这些基于手机的微分析装置可能适用于细胞计数分析，例如执行多种细胞计数任务，或在资源有限的环境中对水样等样品进行高通量筛选。...

基于手机的宽场荧光显微镜与荧光成像流式细胞术

本文描述了一种在单细胞水平上对外周血单个细胞（ex vivo）同时定量96个基因和18种表面蛋白表达水平的方法，可用于鉴定病毒感染细胞与未感染细胞之间差异表达的基因和蛋白。我们应用该方法研究从中国台湾恒河猴中分离的SIV感染的CD4+...

从恒河猴中分离的猴免疫缺陷病毒感染的 CD4+ T 细胞中 mRNA 和表面蛋白表达的单细胞定量分析

实时流式细胞术具有单细胞灵敏度，特别适用于定量活体培养物中多模态受体的功能。利用成年神经前体细胞，通过钙离子指示染料检测钙离子内流、溴化乙锭摄取检测跨膜孔道形成，以及使用荧光乳胶微球检测吞噬作用，对P2X7受体功能进行了评估。...

实时活细胞流式细胞术研究成年神经前体细胞中P2X7受体介导的钙离子内流、孔道形成及吞噬作用

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

本方案描述了用于高通量药物筛选和毒性检测的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）中触发细胞活动的全光学控制与观测方法。展示了在时间和空间上对表型模式进行多参数定量分析的结果，并演示了药物在数小时内产生的长期效应或在数天内进行的连续测量。...

用于毒性测试和表型药物筛选的诱导多能干细胞衍生心肌细胞中钙信号的高通量光学调控与记录

钙离子内流是T细胞信号传导的指标，可用于有效分析T细胞受体刺激后的反应。该方案利用全光谱流式细胞术高度灵活的检测能力，将Indo-1与针对细胞表面分子的多色抗体组合进行多重检测。...

通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流

本方案描述了一种在病毒感染的人肠道类器官中进行钙成像的方法，并提供了一种分析策略。...

利用基因编码钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。...

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

活细胞钙信号成像被广泛用于研究在单层培养的稳定细胞系中的钙离子动员。本方案描述了利用活细胞染料对复杂原代组织进行活细胞荧光成像以检测钙信号，并结合机器学习软件同时量化数千个单个细胞的荧光强度，从而简化分析流程。...

基于荧光的钙成像结合自动细胞分割技术在原代人呼吸道上皮细胞培养中的应用

了解使用光流控平台对HIV-1感染进行单细胞实时监测的方法。该技术可捕获单细胞水平的实时动力学，关联早期信号事件与病毒生命周期延迟步骤，为细胞生物学和病毒学研究提供高通量纵向观察的可扩展替代方案。

基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与HIV-1感染表征

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