Name: 植入颅窗以在清醒小鼠 中重复体内 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学习在清醒小鼠中植入颅窗以进行重复体内成像的技术，该方法可长期追踪神经元和星形胶质细胞的结构与活动，适用于神经发育及神经退行性疾病模型的研究。

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所有动物实验均按照内布拉斯加医学中心大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行。
1. 术前准备
<ol>
	<li>准备用于病毒注射的移液管。使用移液管拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管，并将移液管尖端以20°角进行研磨。将移液管灭菌过夜。</li>
	<li>将无菌明胶海绵切成小方块以制备新鲜的无菌明胶海绵块。将明胶海绵块浸入含有0.5 mL生理盐水的无菌微量离心管中。使用前需在生理盐水中浸泡至少30分钟。</li>
	<li>将海绵切成细条状，制备成新鲜的海绵条备用。</li>
	<li>术前20分钟，对4–6周龄的GLAST-CreER/GCaMP6f小鼠进行腹腔注射，给予0.2 mg/kg地塞米松以预防脑肿胀，并给予5 mg/kg卡洛芬以减轻炎症。 
	&#8203;注意：为了在约40%的星形胶质细胞中诱导GCaMP6f的重组和表达，GLAST-CreER/GCaMP6f小鼠在3周龄时连续5天每日注射100 mg/kg他莫昔芬。</li>
</ol>
2. 手术开始
<ol>
	<li>20 分钟后，使用流速为 1 L/min 的 3% 异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉，持续约 1.5 分钟。</li>
	<li>麻醉成功后，将小鼠固定于立体定位仪上，仪器置于循环水毯上以在整个手术过程中维持小鼠体温在 37 °C。使用鼻夹和耳棒将小鼠固定在框架上。确保鼻夹和耳棒固定稳固，使头部在操作过程中不会移动，但又不能过紧以免损伤颅骨。</li>
	<li>以流速为 1–2 L/min 的 1–1.5% 异氟烷与氧气混合气体维持麻醉。请注意，不同动物维持镇静所需的异氟烷浓度可能有所差异。应持续监测动物的呼吸频率以及对脚趾和尾部夹捏的反射反应，并据此适当调整异氟烷浓度。</li>
	<li>使用棉签涂抹眼膏至每只眼睛，防止手术过程中角膜干燥。</li>
	<li>使用啮齿类动物专用剪毛器，将从颈部至前额（超过眼睛）区域的毛发剪除。操作时需小心，避免误剪动物的胡须。</li>
	<li>先用一片碘伏消毒垫清洁剃毛区域，随后使用一片酒精消毒垫进行二次清洁。</li>
	<li>使用无菌组织镊和手术剪，沿颅骨从前囟（bregma）前方的额缝开始，向后至人字缝（lambda）处切开并移除皮肤。</li>
	<li>皮肤去除后，在颅骨表面滴加约 0.1 mL 的 1% 丁卡因（含肾上腺素 1:200,000 的利多卡因），以减少颅骨出血。</li>
	<li>将无菌碳钢手术刀片（11 号）安装于刀柄上，轻柔刮除颅骨表面的结缔组织。在清除靠近颅骨边缘的结缔组织时需格外小心，残留的组织可能影响后续玻璃盖片或头固定板的牢固粘附。</li>
	<li>使用无菌组织镊将颅骨上松散的结缔组织清除。</li>
	<li>使用无菌棉签将颅骨表面残留的丁卡因彻底擦拭干净。</li>
	<li>完成上述步骤后，使用浸有丙酮的无菌棉签对颅骨进行彻底脱脂处理，并立即用压缩空气吹干颅骨表面。</li>
</ol>
3. 开颅术
<ol>
	<li>使用细头标记笔和直尺，在预定位置测量开孔的合适尺寸。通过与盖玻片（直径 3 或 5 mm）的大小进行比较，确认开孔尺寸；确保开孔略小于盖玻片的尺寸。</li>
	<li>使用牙科钻头，逐步沿开孔轮廓进行划线，使颅骨变薄。钻孔时应缓慢操作，防止穿透颅骨，并以同心圆方式钻磨，以实现颅骨均匀变薄。</li>
	<li>每次完成一圈钻磨后，在钻磨区域滴加一至两滴无菌生理盐水。让生理盐水停留至少 10 秒，以防止颅骨过热并损伤下方的硬脑膜。</li>
	<li>使用无菌棉签吸收残留的生理盐水。向该区域吹入压缩空气，确保所有残留的生理盐水均已蒸发后再继续钻磨。此操作还可吹走残留的骨屑。</li>
	<li>重复步骤 3.2–3.4，直至颅骨被充分磨薄，便于移除。</li>
	<li>用精细镊子轻轻按压颅骨中央区域，检查其是否已充分变薄，以便移除。当颅骨变薄时，应能观察到其轻微移动。钻磨区域应可见下方的血管结构。注意观察，颅骨在变薄处可能出现即将开裂的外观。 
	注意：此阶段的训练至关重要，需准确判断颅骨变薄的程度。</li>
	<li>在尝试移除颅骨前，检查小鼠是否已完全麻醉。若未完全麻醉，应逐步增加异氟烷维持浓度，以防止移除颅骨时发生脑肿胀。</li>
	<li>将一小块浸透生理盐水的明胶海绵置于变薄的颅骨上。再向变薄的颅骨区域滴加一至两滴生理盐水。 
	注意：在变薄的颅骨上保持充足的生理盐水，有助于减少出血，并在移除骨瓣时保护硬脑膜。</li>
	<li>使用微型 15° 尖刀片，小心地将刀片插入变薄的颅骨中，并沿变薄区域进行切割。保持明胶海绵浸润于生理盐水中，随时准备用于止血。</li>
	<li>使用镊子小心抬起并移除颅骨。操作应尽可能轻柔，避免损伤下方组织和血管结构。务必格外小心，切勿损伤硬脑膜。</li>
	<li>骨瓣移除后，立即在皮层上放置一块新的浸透生理盐水的明胶海绵。滴加数滴生理盐水，防止明胶海绵干燥，以免对下方组织造成损伤。</li>
</ol>
4. 病毒注射
<ol>
	<li>使用立体定位仪进行病毒注射。
	<ol>
		<li>将AAV1.CaMKII.0.4.Cre（滴度为3 × 1013基因组拷贝(GC)/mL）用生理盐水按1:5,000比例进行系列稀释。</li>
		<li>在一小块封口膜上配制AAV1.CaMKII.0.4.Cre（1:5,000）与AAV1.CAG.FLEX.tdTomato（滴度为5 × 1012 GC/mL）的混合液。</li>
		<li>将尖端尺寸为20 µm的无菌斜面玻璃移液管轻轻接触溶液表面，吸入病毒混合液。</li>
		<li>降低移液管使其刚好接触脑表面，随后再下降200–300 µm以进行L2/3层注射。使用细胞内微注射给样系统（见材料表），在2分钟内施加12–15次压力注射（20 psi，脉冲持续时间9 ms）。每次注射时观察移液管内液面弯月面是否下降，以确保移液管未堵塞。</li>
		<li>注射完成后，将移液管在脑组织中停留4–5分钟，以防止回流，随后缓慢撤出移液管。</li>
		<li>在2–3个位点重复上述注射操作（各注射点间距约500 µm）。</li>
		<li>将使用过的玻璃移液管、封口膜、移液器吸头以及用于Cre病毒系列稀释的微量离心管弃入含10%次氯酸钠的废液缸中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 颅窗植入
<ol>
	<li>移除任何凝胶泡沫，并使用一小条海绵条吸干残留的生理盐水。</li>
	<li>向开口处滴加数滴抗生素恩诺沙星（22.7 µg/mL），静置1分钟。1分钟后，用新的海绵条吸除残留的恩诺沙星。重复此过程两次。</li>
	<li>第三次清洗后，向开口处滴加数滴生理盐水，静置&#160;1分钟。1分钟后，用新的海绵条吸除残留的生理盐水。再重复此清洗步骤两次，第三次清洗后，在开口处滴加少量生理盐水。</li>
	<li>将盖玻片覆盖在开口上。使用镊子确保盖玻片完全贴合开口，以获得高质量图像。</li>
	<li>在轻轻固定盖玻片位置的同时，将氰基丙烯酸酯粘合剂凝胶（材料表）涂抹在盖玻片周围边缘，以密封窗口与颅骨之间的缝隙。注意避免胶水渗入盖玻片下方，并尽量减少胶水接触盖玻片表面。</li>
	<li>在粘合剂凝胶上覆盖一层速干胶，再在其上添加一层牙科水泥液体，使其固化。</li>
	<li>取一个合适尺寸的直升机式头固定板，在其中央开口周围涂上一层薄胶。将头固定板置于盖玻片上方，短暂等待胶水干燥。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，加入牙科水泥粉末至管壁0.1 mL刻度处。加入7–8滴快速固化瞬干胶，混匀。用剪去尖端以形成较大开口的19 G针头连接1 mL注射器吸取该混合物。</li>
	<li>通过直升机杆的侧孔注入该混合物，直至其从两侧渗出。将牙科水泥/粘合剂混合物涂抹至其余暴露的颅骨表面，以牢固固定头固定板，从而减少成像过程中的运动伪影。</li>
	<li>让混合物在空气中干燥至少15分钟。</li>
	<li>皮下注射0.5 mL生理盐水至小鼠体内，以促进其恢复。</li>
</ol>
6. 术后处理
<ol>
	<li>将小鼠从立体定位仪中取出，并放回其笼中。</li>
	<li>将笼子的一部分放置在循环水加热毯、凝胶加热垫或等温垫上，以辅助小鼠恢复。</li>
	<li>除常规饮食外，为动物提供少量饲料颗粒和湿粮，以进一步促进恢复。术后恢复期间，每天添加新的饲料颗粒和湿粮。</li>
	<li>术后第二天，每只小鼠注射一次5 mg/kg的卡洛芬和5 mg/kg的恩诺沙星。</li>
	<li>第2至6天，每只小鼠每天注射一次5 mg/kg的卡洛芬和两次5 mg/kg的恩诺沙星，具体方案需经当地实验动物护理与使用委员会（IACUC）批准。两次恩诺沙星注射间隔至少8小时。</li>
	<li>第7至20天，每天为小鼠注射一次5 mg/kg的卡洛芬。</li>
</ol>
7. 成像前动物适应
<ol>
	<li>术后第14天，检查颅窗的光学清晰度。不要使用颅窗不清晰或有其他损伤（如过度血管生成）的小鼠。</li>
	<li>在荧光显微镜下检查tdTomato的表达情况。若能识别标记的细胞，则开始进行动物适应性训练。</li>
	<li>适应性训练第一天（抓握训练）
	<ol>
		<li>抓握小鼠数分钟，然后将其放回笼中。每次抓握训练之间间隔15分钟，共重复三次。</li>
		<li>第三次训练后，用一小块布将小鼠包裹起来进行适应性训练。</li>
		<li>将包裹在布中的小鼠抓握约1分钟。</li>
		<li>训练结束后，将小鼠放回笼中。此过程再重复两次，每次间隔15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>适应性训练第二天
	<ol>
		<li>称量并记录小鼠体重。</li>
		<li>用布包裹小鼠，并通过其头固定板将其固定在气浮式饲养笼的头部固定装置上。</li>
		<li>让饲养笼暴露在光线下。</li>
		<li>让小鼠在可移动的饲养笼中固定15分钟。</li>
		<li>适应性训练结束后，将小鼠从饲养笼中取出，并关闭气流。</li>
		<li>再次称量小鼠体重并将其放回笼中。注意仅保留体重减轻不超过10%的小鼠。在任何一天的适应性训练期间体重减轻超过10%的小鼠应排除在成像实验之外。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>适应性训练第三天及之后
	<ol>
		<li>在将小鼠固定到气浮式饲养笼之前，称量并记录其体重。</li>
		<li>将小鼠固定到气浮式饲养笼上。</li>
		<li>用一个能提供黑暗内部环境的物体（如盒子）覆盖饲养笼，让小鼠保持固定状态30分钟。</li>
		<li>30分钟后，移开覆盖物，取出小鼠，并关闭气流。</li>
		<li>适应性训练结束后，再次称量并记录小鼠体重。</li>
		<li>每天重复此过程，每次增加小鼠在饲养笼中固定的时长15分钟。持续进行，直到小鼠能够在饲养笼中固定1.5小时，这大约相当于一次双光子成像实验的持续时间。</li>
		<li>为使小鼠适应噪音，可在显微镜上进行部分适应性训练，使其适应激光扫描镜发出的声音。对未能充分适应的小鼠（如出现发声或应激性排便）应予以排除。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 多光子成像
<ol>
	<li>术后3周开始成像，以等待颅窗澄清。</li>
	<li>使用定制或商用的多光子显微镜进行成像，显微镜需配备钛宝石激光器，并采用高数值孔径（NA）的水浸物镜采集图像。 
	注：通过使用565 nm二向色镜和两个外部光电倍增管实现双通道成像。使用535/50带通滤光片检测GCaMP6f发射光，使用610/75带通滤光片检测tdTomato信号。图 1 和 2 所示图像采用25倍水浸物镜（1.05 NA）和共振扫描器采集。每个感兴趣区域由轴向间距为1 µm的图像堆栈组成。每个光学切片采集分辨率为512 × 512像素，0.18 µm/像素。成像区域为根据立体定位坐标确定的初级运动皮层前肢区域。</li>
	<li>将激光波长设定为920 nm（若使用红移的GECI，则设为990 nm）。</li>
	<li>将小鼠放置于可移动的家笼上，并将头固定板夹紧至头部固定臂。</li>
	<li>在颅窗中心滴加数滴水。</li>
	<li>使用显微镜的宽场模式，选择2-3个血管结构清晰可辨的位置。保存这些血管的图像，并记录电机控制器上显示的X和Y坐标，以便在后续成像会话中重新定位tdTomato标记的树突。每次实验时调整X和Y坐标，使其与保存的血管图像对齐。</li>
	<li>在完成血管成像并记录位置后，定位表达tdTomato的神经元区域（图1）。对神经元的突触结构（树突和轴突）以及星形胶质细胞中的GCaMP6f活性进行成像。 
	注：树突将作为可靠的解剖标志，用于在多日重复成像中准确返回相同区域，对同一树突和星形胶质细胞进行长期追踪。在头部固定稳定且小鼠适应固定条件后，未观察到成像平面发生可检测的位移。X和Y方向上的位移可通过运动校正进行补偿。</li>
	<li>成像结束后，将小鼠放回笼中。 
	注：小鼠通常在显微镜上停留不超过2小时。当成像时间较长时，物镜下的水可能会蒸发，实验过程中应适时补充水分。也可使用超声耦合凝胶替代水。</li>
</ol>

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<li>Delekate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+P2Y1+receptor+signalling+mediates+astrocytic+hyperactivity+in+vivo+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 5, 5422(2014).</li>
</ol>

本文介绍了一种在清醒、头部固定的小鼠中植入慢性颅窗的实验方案，用于在气浮式家庭笼中进行皮层星形胶质细胞和神经元的体内成像。文中提供了应用颅窗成像表达GECI的星形胶质细胞及神经元突触结构的具体示例。结合双光子显微镜技术，可连续多日重复记录星形胶质细胞的钙信号动态及突触结构动态。
慢性颅窗能够提供良好的光学成像质量，并允许对相同的神经元和胶质结构进行多次成像。该方法还可在用盖玻片封闭颅骨开窗前，实施颅内病毒注射。 
使用者应当意识到植入慢性颅窗所带来的一些局限性。要获得高质量的颅窗并确保动物存活，需要丰富的经验与大量练习。此外，该手术具有侵入性，可能引发炎症反应。手术期间及术后恢复阶段的药物处理包括使用抗炎药物和抗生素31。在研究神经炎症模型的实验中，使用抗炎药物可能并不合适，因为这些药物可能会影响所研究的现象本身。
最近的研究表明，硬脑膜淋巴管生成可因颅窗植入而发生32。因此，慢性颅窗可能不适用于研究硬脑...

在小鼠大脑皮层中进行体内多光子荧光显微成像的能力，对于研究细胞信号传导与结构1,2,3,4,5,6,7,8,9、疾病病理学10,11以及细胞发育过程12,13至关重要。通过植入慢性颅窗，可实现纵向成像，从而在活体动物中对皮层区域进行数天、数周甚至数月的重复成像13,14。多光子显微技术因其采用红外激光，具有更佳的成像深度和更低的光损伤，特别适用于体内重复成像。该技术使得研究人员能够观察不同皮层区域内特定细胞的分子与细胞动态过程。
多光子显微镜已被用于小鼠神经元和胶质细胞的活体成像15,16,17,18,19,20。可通过多种策略对特定细胞类型和感兴趣区域进行标记。一种常用方法是利用Cre-Lox重组系统，以细胞特异性方式驱动遗传编码的荧光蛋白表达。该方法可使用基因修饰小鼠实现，例如将tdTomato &#34;floxed&#34; 小鼠（Ai14）与在特定启动子驱动下表达Cre重组酶的小鼠进行杂交21。另一种方法是通过病毒注射实现细胞和位点特异性的标记。在此方法中，将一种在细胞特异性启动子驱动下编码Cre重组酶的病毒，与另一种编码目的floxed基因的病毒共同注射到特定脑区。同时接收到两种病毒载体的适当细胞类型将表达目标基因。这些基因可以是结构性标记物，如tdTomato，用于观察细胞形态的变化22，也可以是遗传编码的钙指示剂（GECIs），如GCaMP和/或RCaMP，用于检测钙动力学23。遗传重组方法可单独或联合使用，以标记一种或多种细胞类型。第三种方法无需转基因小鼠或病毒载体（后者包装容量有限），即在胚胎期进行DNA构建体的在体电穿孔24。根据电穿孔的时间不同，可靶向不同类型的细胞25,26,27。
进行双光子成像时，可以在小鼠清醒或麻醉状态下进行成像。通过固定在小鼠头骨上的头夹板固定小鼠，可实现清醒状态下的成像28。采用一些方法允许动物相对自由地活动，可降低该过程带来的应激反应，例如使用自由漂浮式、气浮支撑的泡沫塑料球29、自由漂浮式跑步机1，或气浮式饲养笼系统——在该系统中，小鼠通过头夹板固定，可在开放的腔室中自由移动30。对于上述每种成像条件，首先都需要让小鼠适应成像装置。本文描述了使用气浮式饲养笼系统进行小鼠适应训练及成像的操作流程。
本方案描述了用于长期观察的慢性颅窗植入方法 体内 在皮层中进行成像。本文将使用在星形胶质细胞中条件性表达GCaMP6f的小鼠，以监测钙信号动态。此外，本文还描述了使用tdTomato作为神经元标记的病毒注射操作流程。这有助于确定神经元突触结构的变化和/或其可用性，作为结构标记物，实现对同一星形胶质细胞的重复成像。在整个实验方案中，关键步骤将被重点强调，以确保从双光子显微镜获得最佳质量的图像。

<table><tbody><tr><td>15&lt;sup&gt;o &lt;/sup&gt;尖刃刀片</td><td>Surgistar</td><td>6500</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>19 G 针头</td><td>BD</td><td>305186</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>病毒载体</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-Cre</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>病毒载体</td></tr><tr><td>Acteone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>试剂</td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>Fisher Scientific</td><td>Covidien 5750</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>磨边仪</td><td>Narishige</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>碳化钨钻头</td><td>SS White Dental</td><td>14717</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>卡洛芬（Rimadyl），50 mg/mL</td><td>Zoetis Mylan Institutional, LLC.</td><td></td><td>药物</td></tr><tr><td>压缩空气</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022-523</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>836-WC NO BINDER</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>盖玻片，1号厚度，3 mm/5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720, 64-0700</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>牙科钻</td><td>Aseptico</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>地塞米松，4 mg/mL</td><td>Mylan Institutional, LLC.</td><td></td><td>药物</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>Duralay 液体（牙科水泥液体）&amp;nbsp;</td><td>Patterson Dental</td><td>602-8518</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Duralay 粉末（牙科水泥粉末）&amp;nbsp;</td><td>Patterson Dental</td><td>602-7932</td><td>试剂</td></tr><tr><td>恩诺沙星，2.27%</td><td>Bayer</td><td></td><td>药物</td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>Fiber Lite 高强度照明器</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>镊子（大号）</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>镊子（小号）</td><td>World Precision Instruments</td><td>501764</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm95.1(CAGGCaMP6f)Hze&lt;/sup&gt;/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>货号：024105</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>Germinator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>货号：012586</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>头固定板</td><td>Neurotar</td><td>型号 1，型号 3</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>15&lt;sup&gt;o &lt;/sup&gt;尖刃刀片固定器</td><td>World Precision Instruments</td><td>501247</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>手术刀片固定器</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>碘伏消毒片</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td></td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>带诱导箱的桌面式异氟烷系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>SurgiVet</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Office Depot</td><td>KG517</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>40140</td><td>快速固化瞬干胶</td></tr><tr><td>Loctite 454</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9194415</td><td>氰基丙烯酸酯凝胶胶水</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td></td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>氮气</td><td>Matheson</td><td>NI M200</td><td>气体</td></tr><tr><td>氧气</td><td>Matheson</td><td>OX M250</td><td>气体</td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker</td><td></td><td>细胞内微量注射分配系统</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>17014340</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>啮齿动物毛发修剪器</td><td>Wahl</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>生理盐水（0.9% 氯化钠）</td><td>Med Vet International</td><td>RX0.9NACL-30BAC</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>手术刀片，11号</td><td>Integra</td><td>4-111</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>503667</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>Sugi 海绵条（海绵条）</td><td>Kettenbach Dental</td><td>31002</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>SURGIFOAM（明胶海绵）</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>带26 G针头的注射器</td><td>BD</td><td>309625</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>水循环保温毯</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>设备</td></tr><tr><td>含肾上腺素的利多卡因 MPF（1:200,000），10 mg/mL</td><td>Fresenius Kabi USA</td><td></td><td>药物</td></tr></tbody></table>

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

为了充分理解行为动物中神经元和胶质细胞的细胞生理学，有必要对它们的形态进行可视化并记录其活动 体内 在行为活动的小鼠中进行成像。本文描述了一种植入慢性颅窗的方法，以实现对清醒且头部固定的动物脑内细胞进行长期成像。结合遗传学策略与病毒注射技术，可利用结构或生理标记物对特定细胞及目标区域进行标记。本实验方案展示了如何结合病毒注射技术，在表达GCaMP6的皮层星形胶质细胞周围标记神经元，从而通过颅窗同时对这两类细胞进行成像。利用双光子显微镜，可在清醒、具有行为能力的动物中对同一群细胞连续成像数天、数周甚至数月。该方法使研究人员能够实时观察细胞动态变化，并可用于解答神经科学领域的多项重要问题。

颅窗的质量可通过神经元结构的清晰度来评估。在高质量的颅窗中，树突棘清晰可见（图1）。通过保存结构和位置数据，可对同一只动物进行数天、数周甚至数月的重复成像，以观察相同的细胞（图1）。图1中的图像来自初级运动皮层的前肢区域（在5 mm窗口内）。可测量多种参数，包括树突棘和轴突终扣的密度与动态变化，以研究突触结构可塑性。通过分析钙信号的时空动态，可研究星形胶质细胞的活性（图2）。根据显微镜的性能（例如共振扫描器、控制物镜的压电马达）以及具体的科学问题，可进行单焦平面、三维体积或多个区域的时间序列成像，以在所需的采集频率下监测钙活性。
<img alt="延时显微镜，突触多日生长，荧光成像，神经元过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62...

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。

为了充分理解行为动物中神经元和胶质细胞的细胞生理学，有必要对它们的形态进行可视化，并记录其……

本方案描述了如何在清醒且头部固定的的小鼠中进行病毒注射并植入颅窗，以实现对脑细胞的成像。该方法的优势在于，可在多个成像时段内对神经元和星形胶质细胞的结构与活动进行重复观察。该技术可用于研究神经发育或神经退行性疾病模型中神经细胞的变化，或评估依赖经验的可塑性是否受损。首先使用鼻夹和耳杆将麻醉后的小鼠固定在立体定位仪上。使用无菌外科器械，从前囟（bregma）前方的额缝开始，向后至人字缝（lambda），切开并移除皮肤。使用无菌的11号碳钢手术刀片，轻轻刮除颅骨上的所有结缔组织。借助牙科钻，在开孔轮廓上沿同心圆逐步钻磨颅骨，以实现骨片均匀变薄。每次完成一圈同心钻磨后，向钻磨区域滴加一至两滴生理盐水，并让生理盐水停留至少10秒后再继续钻磨。用精细镊子轻轻按压颅骨中央区域，检查颅骨是否已充分变薄并出现移动。确保钻孔部位下方的血管结构完整，且骨组织无裂纹。将微型15度尖刃小心插入变薄的骨组织中进行切割，并使用浸有生理盐水的明胶海绵控制可能出现的出血。用镊子小心抬起并移除骨组织，注意避免损伤硬脑膜。注射时，用病毒混合液填充一支无菌斜面玻璃微量移液管，其尖端直径为20微米。然后将移液管缓慢下降至接触脑表面，并继续下降200至300微米，以实现对第2/3层的注射。使用细胞内微量注射给样系统，在两分钟内施加压力，注射12至15次。进行颅窗植入时，将盖玻片覆盖在颅骨的开孔上。使用镊子确保玻片完全贴合于开孔处。为密封玻片边缘与颅骨之间的缝隙，需在玻片表面的周围涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂凝胶。在粘性凝胶上涂抹一层胶水，然后加入一层牙科水泥液体。待牙科水泥硬化后，在直升机式头板的中央开口周围涂抹一层薄胶水，将合适尺寸的直升机式头板置于盖玻片之上。让胶水干燥。在1.5毫升离心管中加入牙科水泥粉末至0.1毫升刻度处。将七到八滴快干型瞬干胶加入粉末中，混合均匀，然后用剪开以形成较大开口的19号针头，将所得混合物吸入1毫升注射器中。通过直升机杆的侧孔注入粉末混合物，直至其从两侧渗出。将牙科水泥粘合剂混合物涂抹于其余暴露的颅骨表面，以固定头板与颅骨。用布包裹小鼠，并通过其头板将其固定在悬空饲养笼的头部固定臂上，然后使饲养笼暴露于光照下。经过15分钟的适应期后，将小鼠从饲养笼中取出。使用显微镜的宽场模式，选择两到三个易于识别的血管位置。保存血管图像，并记录电机控制器上显示的x和y坐标。对神经元的突触结构以及星形胶质细胞中的GCaMP6f活性进行成像。在代表性分析中，通过连续多天重复成像树突和表达GCaMP6f的星形胶质细胞来评估颅窗的质量。在质量良好的颅窗中，神经元结构清晰，树突棘清晰可见。成像第二天出现了两个新棘突，仅有一个棘突持续存在并在第五天仍可见。在表达GCaMP6f的不同时间点，对星形胶质细胞中的钙活性进行了研究。在一次运动过程中，观察到了涉及整个细胞的全局性事件。该实验方案的两个关键步骤是：在移除颅骨前需充分磨薄颅骨，以及将盖玻片正确地放置在颅骨开窗处。成像可与行为学分析相结合，无论是在成像过程中，还是在行为任务之后（例如学习一项新的运动技能），以确定神经元和星形胶质细胞的结构与功能如何受到学习的调节。

implantation-cranial-window-for-repeated-vivo-imaging-awake

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

植入颅窗以在清醒小鼠 中重复体内 成像

通过结合抛光加固的薄颅骨（PoRTS）颅窗和胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射，我们能够对活体小鼠脑内注射的GBM细胞所引发的胶质瘤发生及生长过程进行长期纵向观察。...

成像胶质瘤起始过程 在体 内 通过抛光并加固的薄颅骨颅窗

本视频介绍了一种在小鼠模型中植入颅窗的手术方法，以实现对大脑不同区域的稳定光学观测。...

小鼠颅窗植入术：一种用于稳定光学接触小鼠脑区的玻璃盖片植入手术方案

关键词：颅窗植入，小鼠模型，光学成像，玻璃盖片，脑部手术，活体成像

本视频展示了通过转基因小鼠颅骨上的光学窗口记录大脑神经活动的过程。这些小鼠表达一种荧光蛋白，可用于检测神经活动。通过小心移除一小部分颅骨以安装光学窗口，随后用黑色水泥覆盖颅骨，以在成像前阻断光线。...

在转基因小鼠脑内植入光学窗口以成像神经活动

来源：Pietruczyk, E. A., 等．小鼠椎板切除术与脊髓窗植入．J. Vis. Exp.

小鼠脊髓窗植入术用于活体成像

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本方案描述了一种带有可更换盖板的新型乳腺成像窗（R.MIW）。植入R.MIW后，可通过活体显微镜对健康及病变乳腺组织在不同发育阶段进行长期、多日、细胞分辨率的成像观察。...

使用可更换盖板的乳腺成像窗进行纵向活体显微成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本方案描述了制备一个大型（6 x 3 mm）2) 使用食品保鲜膜、透明硅胶和盖玻片制作颅窗。该颅窗可允许 体内...

体内 宽场与双光子钙成像技术在小鼠大颅窗中的应用

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。...

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

本方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大尺寸、可重复密封且保留硬脑膜的颅窗。该技术能够在数周时间内对分布式的深部脑网络（如默认模式网络）进行长期、多模态的电生理记录。...

用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

学习在清醒小鼠中植入颅窗以进行重复体内成像的技术，该方法可长期追踪神经元和星形胶质细胞的结构与活动，适用于神经发育及神经退行性疾病模型的研究。

植入颅窗以实现重复观察在体实验清醒小鼠成像

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植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

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