快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

该实验流程包括在严格控制的环境条件下培养细胞，使用融化的水/冰快速冷却细胞，并用预先优化浓度的甲醛和孵育时间进行固定。随后，通过过量含有伯氨基的化合物（如甘氨酸或Tris）终止固定反应。收集细胞，洗涤后可冷冻保存。

固定后的细胞可通过机械或化学方法裂解，所得裂解液可用于根据核糖体组分的分子大小、沉降特性或亲和标记进行分离。该方法可获得多种用途的材料，适用于免疫辅助纯化与检测、电子显微镜下含特定因子复合物的富集。经过交联深度封闭后，可进一步开展基于RNA扩增或杂交的分析，实现RNA测序和质谱分析。

在摇床中培养一升酵母菌液，起始光密度在600纳米处不超过0.05个吸光度单位，并在30摄氏度下使用蛋白胨和葡萄糖培养基。准备一台制备型离心机，配备适用的转子和离心瓶，用于在4摄氏度下以5000 ×g离心收集酵母细胞的液体悬浮液。记录酵母细胞生长过程中的光密度值。

如果关注的是对数生长期，则在收集时，细胞在600纳米处的吸光度必须介于0.6至0.8吸光度单位之间。一旦细胞准备就绪，需在化学通风橱内设置一个冰盒，其中放置一个装有250克洁净碎冰的烧杯，并将25毫升胰蛋白酶以及新购入的、以甲醇稳定的37%甲醛溶液置于通风橱内。将最新的一份细胞培养物倒入装有冰的烧杯中。

然后加入75毫升37%的甲醛，使终浓度为2.2%（重量/体积），剧烈搅拌混合物直至冰完全融化。冰融化后，设置计时器孵育10分钟。孵育结束后，将培养物转移至预冷的离心管中，在4°C、5000 ×g条件下离心5分钟以沉淀细胞。离心过程中，将一个50毫升离心管预冷，并将含有甘氨酸的新鲜配制缓冲液A置于冰上，用于中和残留的甲醛。

离心后，将离心管置于冰上，使沉淀一侧与冰接触。将离心管移入通风橱，并将上清液弃入甲醛废液容器中。使用25毫升移液管将旧管中的细胞沉淀重悬于20毫升缓冲液A中，并转移至50毫升离心管中。

用缓冲液A定容至40毫升，于4摄氏度、5000 G离心5分钟收集洗涤后的细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于40毫升缓冲液A1中（即不含甘氨酸的缓冲液A），以去除甘氨酸污染。再次于4摄氏度、5000 G离心5分钟收集细胞沉淀。

用缓冲液 A 再重复洗涤一次。弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上。称量含有沉淀的离心管，湿细胞质量应约为每升细胞培养物一克。

用液氮填充衬有铝箔的聚苯乙烯盒，液氮深度约为三厘米。将50毫升离心管直立放入盒中。加入550微升缓冲液A2，通过移液吹打重悬沉淀，并涡旋10秒。

加入10微升浓度为每微升40单位的RNase抑制剂，再次涡旋振荡10秒。使用1毫升移液器将细胞悬液逐滴加入含有液氮的50毫升容器中。为下一步操作做准备，将1.5毫升无核酶管和10毫升不锈钢研磨罐置于干冰上预冷。

使用洁净的无菌刮勺将冷冻的细胞悬液液滴转移至研磨罐中。将研磨罐浸入液氮中一分钟，确保液相部分始终高于连接处。设置冷冻混合研磨仪在27赫兹条件下振荡研磨一分钟。

将密封的研磨罐在混合球磨机中以27赫兹振荡1分钟。像之前一样，将研磨罐在液氮中重新冷却，并再振荡1分钟。将研磨罐转移至装有干冰的冰盒中，并与1.5毫升无核溶液管一同放置。

使用小型钢制刮勺将研磨后的样品转移至加有垫料的离心管中。随后将离心管置于零下80摄氏度保存。在两个T175培养瓶中，用DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）加10%胎牛血清，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养HEK 293细胞，使其生长至60%至70%融合度。

在预定固定时间至少三小时前，将 T175 培养瓶中的培养基更换为精确的 30 毫升预热完全培养基。准备一个装满碎冰的冰盒，并连同所需缓冲液一起置于冰上，放置于通风橱内。为快速冷却细胞，从培养箱中取出 T175 培养瓶，将其紧贴冰面，确保最大面积接触。

在化学通风橱内，将锥形瓶倾斜至侧放，使培养基聚集在细胞所在位置的对侧。用移液器直接将168微升37%（质量/体积比）的甲醛加入积聚的培养基中，终浓度为0.2%甲醛。

立即混匀。将培养瓶置于冰上继续孵育10分钟。从与细胞相对的一侧倾倒培养瓶，将培养基倒入适当的废液容器中。

使用移液器，在与细胞相对的一侧轻轻加入 30 毫升不含钙离子和镁离子的 Dalbecco 磷酸盐缓冲液，并额外含有 50 毫摩尔甘氨酸。通过轻轻摇晃培养瓶混匀，将培养瓶恢复至水平位置，在冰上继续孵育 10 分钟。将溶液从与细胞相对的瓶口侧倾倒出去，然后轻轻加入 7 毫升标准的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，以解离并重新悬浮细胞。

将烧瓶在室温下孵育5分钟，最多不超过10分钟。将烧瓶垂直放置，使用移液器轻轻冲洗瓶壁上残留的细胞，收集脱落的细胞，并将悬液转移至置于冰上的50毫升离心管中。立即向收集的悬液中加入20毫升完全培养基，并通过轻轻翻转离心管混匀。

将离心管在100 G、4摄氏度条件下离心5分钟，使细胞沉淀。细胞沉淀必须清晰可见。弃去上清液，并在沉淀中加入10毫升不含甘氨酸的达尔伯克氏磷酸盐缓冲液，轻轻重悬。

将离心管再次在100 G、4摄氏度条件下离心5分钟，弃去洗涤缓冲液，将沉淀重悬于800微升冰冷的不含甘氨酸但含有镁离子和钙离子的Dulbecco's磷酸盐缓冲液中。将重悬的细胞转移至一个新的低蛋白结合的1.5毫升微量离心管中。在4摄氏度条件下，以100 G离心3分钟。

使用1 mL移液器小心弃去上清液。此时，细胞沉淀可在-80 °C条件下冷冻保存，或直接进行细胞裂解步骤。在生物安全柜中加入300 µL基于非离子型、非变性去污剂的裂解缓冲液以及7 µL精氨酸酶抑制剂，用1 mL枪头反复吹打充分混匀。

将一根25号针头小心地安装到1至3毫升的注射器上，用力吹打混合物，至少进行七次缓慢向上吸液和快速向下排液的操作。将注射器和针头丢弃至锐器盒中，然后使用31号针头和0.3毫升注射器重复上述步骤。将注射器和针头丢弃至锐器盒中。

将离心管在 4°C 条件下以 12,000 G 离心五分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的低蛋白结合 1.5 毫升微量离心管中。将细胞碎片和裂解液均于 -80°C 保存。

翻译复合物对缓冲液的离子组成较为敏感。省略氯化镁并添加EDTA会消除高沉降特性；尽管氯化钙能够产生更好的结果峰，但其改善效果有限。因此，我们选择了缓冲液一。

2.2% 质量体积比的甲醛能极好地保存多核糖体，且与 4% 质量体积比的甲醛相比，不会降低总体得率。在哺乳动物细胞中，使用了低得多的甲醛浓度，即 0.2% 质量体积比，因为较高浓度会导致多核糖体物质大量损失。

在裂解液及所有后续缓冲液中加入15毫摩尔EDTA后，来自固定细胞的多聚核糖体组分表现出明显较弱的去稳定作用。使用4%固定细胞材料时，50毫摩尔EDTA部分重现了这一效果，材料更耐受，展开程度更低。葡萄糖耗尽可能引发酵母中最显著且最迅速的翻译抑制效应之一。

神经添加物和局部诱导的条件均导致多聚核糖体解聚，但在添加低浓度葡萄糖的情况下，保留的多聚核糖体略多，差异明显。重要的是，经固定细胞提取的多聚核糖体物质在饥饿与非饥饿细胞之间表现出显著差异，表明甲醛固定适用于保存动态翻译过程中的差异。在诸如tacy paysake等方法中，进一步去除不能与完整核糖体有效共沉淀的小核糖体亚基可能更具洞察力；为此，我们采用两步超速离心法，从而分离出SSU、LSU、RS、RNase抗性的diazomes、DS以及通过电子显微镜验证的高阶多聚核糖体。

与未固定的细胞相比，固定细胞的材料显示，在沉降速度最快的核糖体组分中，不稳定型eIF4A的含量升高。利用eIF4A tapi菌株的固定材料，通过磁性IDG珠子捕获并富集含eIF4A的复合物，我们发现在RNase I解离后的第二梯度中，SSU和RS组分中的eIF4A相对于β-actin出现选择性富集，而在LSU组分中则未观察到该现象。与其他翻译暂停方法相比，甲醛穿过细胞膜的作用迅速，且其交联具有非特异性，因而有望最大程度地保留翻译复合物中间体的多样性。

我们的研究结果证实，快速甲醛固定法可用于稳定高度瞬时的复合物，并证明其在细胞快速响应环境变化或应激条件等情形下的实用性。