Name: 从真核细胞 中快速体内 固定和分离转化复合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 学习利用甲醛交联技术快速固定酵母和HEK 293细胞中的翻译复合物，实现RNA与蛋白质相互作用的稳定化分析。该方法适用于RNA测序、质谱和显微镜等多种下游应用。

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本工作得到了澳大利亚研究理事会发现项目基金（DP180100111，授予T.P.和N.E.S.）、国家健康与医学研究委员会研究者基金（GNT1175388，授予N.E.S.）以及研究奖学金（APP1135928，授予T.P.）的支持。作者们感谢澳大利亚国立大学先进显微镜中心的显微镜澳大利亚设施所提供的技术支持，该设施由大学及联邦政府共同资助。

作者声明无利益冲突。

甲醛固定是一种方便且常用的方法，可实现生物分子的快速体内交联10,36,45,46,47,48。与其他可能的生物分子靶标相比，成功捕获翻译复合物需要在细胞或其他材料快速冷冻的同时立即进行固定。若不及时稳定，多种与翻译相关的过程可能继续进行，导致复合物分布偏离未受干扰的体内状态49。与其他翻译抑制和核糖体复合物稳定方法相比，甲醛能够迅速穿透细胞膜，并以非特异性方式形成交联，因而有望最大限度地保留翻译复合物中间体的多样性，使其更接近天然分布状态50。
本文所述方法已在酵母和哺乳动物细胞中建立并优化，其他研究团队也已在此基础上开发出适用于更多样化生物材料的方法，例如在完整脊椎动物（如斑马鱼胚胎）中的应用10,38,39,49,51,52。尽管这些研究共同证实了该方法的通用性和广泛适用性，但由于需要进行优化和调整，翻译复合物的快速甲醛交联在转移至新型生物材料时仍被认为具有一定难度。
该方法成功的关键要求之一是对甲醛浓度以及细胞收集和破碎技术进行重新优化。通透性较差、体积小且呈圆形的酵母细胞需要更高浓度的甲醛（至少高10倍）并对固定后的细胞进行物理破碎。相比之下，培养中的大型扁平贴壁哺乳动物细胞容易发生过度固定，因此在固定过程中需轻柔操作，而固定复合物的提取则可通过使用去垢剂进行化学裂解膜结构来完成。交联不足可能导致较不稳定或寿命较短的中间产物解离或渗漏至后续状态；而交联过度则可能对核糖体组分的分离与研究产生不利影响，并引发选择性偏差，例如导致较重复合物更显著的损耗。据我们观察，即使是微小的变化，例如所用贴壁人源细胞的类型不同，也可能影响交联复合物的回收产量，因而需要重新优化交联方案。我们还可以预见，具有显著不同通透性特征的细胞（如植物细胞）将需要对固定条件进行更广泛的额外优化52。然而，很难设想有任何类型的生物材料会完全不适用于该方法。
与哺乳动物细胞固定方案相关的一个考虑因素是用作输入的细胞材料的密度和数量。建议细胞持续生长至少2天，期间不进行传代培养或其他干扰，以避免对外部细胞翻译动态产生影响。该建议适用于大多数细胞类型，但对于大多数贴壁细胞，保持汇合度不超过70%可确保避免显著的接触抑制效应，此类效应可能对翻译速率产生负面且不可预测的影响。
甲醛固定的另一个有趣且可能具有独特便利性的特征源于其无选择性的反应性，即对混合分类系统中翻译复合物的稳定作用。细菌，尤其是线粒体、叶绿体以及各种细胞内寄生生物的翻译复合物，历来难以通过特异性的翻译抑制剂进行靶向研究。相比之下，在TCP-seq数据中，映射到线粒体转录组的足迹序列可被清晰观测到38,39,50。一个值得关注的后续发展方向是利用该方法研究整个微生物群落（如土壤、水体或肠道样本）中的翻译过程，因为在这些复杂环境中，若采用其他方法实现可靠且快速的翻译终止及复合物稳定，将面临较大困难。
还应指出，对于最复杂的材料（如坚硬和/或体积较大的组织），在细胞破裂及材料均质化后可立即使用甲醛进行固定，且并无任何限制。该方法已被广泛用于在利用特定小分子抑制剂稳定翻译复合物时，消除细胞通透性带来的延迟。33,53,54,55鉴于甲醛固定在传统上一直被使用，并取得了极好的效果 离体/体外 样品稳定化在电子显微镜等应用中的作用45,56,57,58在这种情况下，我们可以预期负面效应会更少，特别是与从充分固定的细胞中提取翻译复合物效果不佳相关的问题。
我们的研究结果证实，快速甲醛固定法可用于稳定高度瞬时的复合物，例如包含 eIF4A 的复合物。值得注意的是，与哺乳动物不同，酵母中的 eIF4A 与帽结合复合物 eIF4F 的结合要弱得多，因此总体上与翻译复合物的结合也较弱。在酵母中，任何对核糖体材料进行的较彻底纯化过程通常都会导致 eIF4A 的丢失29,59,60,61,62,63。然而，在经过 in vivo 固定的酵母样品中，可以在所有预期存在 eIF4A 的翻译复合物组分中实现其可靠富集。先前发表的 Sel-TCP-seq 数据已展示了与核糖体结合更强的 eIF2 和 eIF3 的富集情况（同时也揭示了瞬时发生的共翻译蛋白复合物组装）39。因此，该方法适用于检测与翻译复合物结合较强和较弱的各类组分。
综上所述，我们介绍了一种可用于深入研究翻译起始阶段变化的方法，尤其适用于需要最小程度干扰mRNA上核糖体分布的情况。重要的是，该方法适用于稳定翻译复合物中相对不稳定且动态的组分（如eIF4A），并在经过必要优化后可广泛使用。我们还提供了证据，表明甲醛固定在研究翻译过程快速动态变化的情境中具有实用价值，从而为研究细胞对环境变化或应激条件的快速反应等课题开辟了新的方向。

生物体在其生命周期中会经历动态的细胞内和细胞外变化，需要快速响应以维持稳态并确保生存。为实现环境适应，真核细胞会调节其代谢活动 通过 基因表达调控。基因表达调控可在转录和/或翻译过程中施加影响；其中翻译水平的响应通常发生得更为迅速1,2,3,4例如，翻译水平的变化通常在应激开始后1-30分钟内出现，而转录水平的改变则在应激暴露数小时后发生3,4,5由于细胞质中信使（m）RNA分子持续存在，翻译水平的调控可更快速地实现对基因表达的改变。相反，在转录水平，必须先合成新的mRNA分子，并在真核生物中经过加工并从细胞核输出，导致响应时间显著延迟。2,4,6,7,8.
急性应激的翻译响应通常表现为整体翻译产出的下降，同时选择性上调对细胞存活至关重要的蛋白质1,3,4,9。由于翻译过程消耗大量能量，降低蛋白质合成输出被认为至关重要3,7。为实现选择性抑制与上调，翻译响应依赖于一系列复杂的调控机制。这些调控可作用于翻译的各个阶段：多肽生物合成的起始、延伸、终止以及核糖体的再循环10,11,12,13，但最显著的作用发生在起始阶段5,7,9,10,13。在起始阶段，小核糖体亚基（SSU）在真核起始因子（eIFs）的协助下结合到mRNA的5'非翻译区（UTR），并沿其扫描，直至识别起始密码子2,5,6,8,11,12,13。调控机制通常靶向影响结合、扫描及起始密码子识别的eIFs。例如，起始因子eIF2是一种关键的翻译因子，可协助将起始Met-tRNAiMet招募至SSU，在应激条件下常成为调控靶点4,6,11。在酵母中，营养缺乏和渗透压应激可诱导该因子的磷酸化1,4,11,14,15；而在哺乳动物细胞中，氨基酸饥饿、内质网（ER）应激、紫外线应激、病毒感染以及氧浓度变化均可触发这一响应8,9,11。在哺乳动物细胞对缺氧的响应中，特定mRNA翻译的快速上调尤为明显，表现为全局性的快速翻译抑制，同时选择性上调缺氧诱导因子（HIFs）的生物合成。HIFs作为转录因子，进一步在DNA转录水平引发长期的细胞重编程8,9,16。在酵母中，热应激也观察到类似响应：热休克蛋白（HSPs）的翻译迅速表达，随后出现延迟的转录水平响应17,18。除营养缺乏和热休克外，酵母在不同氧气8,19、盐度5、磷酸盐、硫20,21及氮22,23水平下的翻译响应也已被广泛研究。这些研究对酵母在烘焙和发酵等工业应用中具有广泛意义24,25。翻译响应还有助于深入理解神经退行性疾病和心脏病等疾病，这些疾病常伴随氧化应激等细胞内应激状态。总体而言，翻译响应是真核生物基因表达调控的重要组成部分，有助于快速适应多种应激条件。
为了研究翻译响应，需要采用能够提供翻译景观最小失真快照的方法。多聚核糖体分析是一种用于研究mRNA翻译的经典方法，涉及分离mRNA的多聚（核糖）体组分 通过 蔗糖梯度超速离心26,27该方法可用于探究单个mRNA的翻译水平（通过逆转录聚合酶链反应等检测方法，RT-PCR）26），或与高通量技术（微阵列或RNA-seq）结合进行全局分析28,29）。更进一步的方法是核糖体谱分析，该方法能够在全基因组范围内研究延伸中的核糖体在mRNA分子上的位置，同时推断翻译效率在转录组中的分布以及主要和替代起始位点的利用情况30,31核糖体谱分析涉及分离并测序由核糖体占据而受到保护的 mRNA 片段。核糖体谱分析已在多种条件下为翻译动态提供了深入见解，包括缺氧应激、热休克和氧化应激。31,32该技术已适用于多种来源材料，包括酵母和哺乳动物细胞。
尽管多核糖体分析和核糖体图谱技术在拓展翻译研究能力方面发挥了基础性作用，但翻译过程包含多种翻译中间体和复合物，这些方法难以捕获。11,13另一个局限性源于无法研究快速响应类型，因为翻译复合物要么被稳定化 体内 通过添加特异性翻译抑制剂（抗生素），导致特定的核糖体分布伪影，或 离体 细胞裂解时特异性地（抗生素）或非特异性地（高盐或镁离子）剥夺寿命较短或稳定性较差的中间产物33,34,35.
甲醛被广泛用于交联核酸与蛋白质，例如在染色质免疫沉淀（ChIP）和交联免疫沉淀（CLIP）研究中。由于其分子尺寸小且细胞通透性良好，可实现快速的体内作用36。基于甲醛快速交联的特性，核糖体谱分析方法已扩展为翻译复合物谱测序（TCP-seq）10,36,37,38,39,40。TCP-seq 最初在酵母中建立，能够捕获所有翻译中间体，包括扫描或翻译终止后的SSU复合物以及多种核糖体构型37,38,41,42。该方法已在多项研究中得到应用10,38,39,41,42，其中一些研究采用翻译抑制剂与甲醛交联相结合的方法，以促进翻译过程的阻滞。该技术的一个进一步改进版本——选择性 TCP-seq39，最近已被用于对交联复合物进行免疫纯化，从而拓宽了 TCP-seq 的应用范围。甲醛交联具有快速、高效且可逆的特性，使这些方法适用于研究瞬时的 mRNA：翻译复合物相互作用，特别是在高度动态的翻译水平响应通路中的研究。
本文详细阐述了用于全面稳定和分离翻译复合物的 体内 甲醛交联过程。我们分别提供了适用于酵母和哺乳动物细胞的精细实验方案（图1）。此外，我们还概述了交联稳定化材料的后续应用示例（图1），例如通过免疫印迹（western blotting）检测共纯化的蛋白质因子、免疫辅助纯化（或“免疫沉淀”；IP）以及富集含有特定目标因子的翻译复合物、电子显微镜分析和RNA测序。
<img alt="细胞分级分离实验流程：酵母培养物固定、裂解、沉淀；蛋白质-RNA分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62639/62639fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1示意图展示了典型实验装置的概览。 主要步骤 体内 翻译复合物的甲醛稳定化流程以流程图形式展示，并补充了关键所需仪器的相关信息。文中概述了交联材料可能的下游应用，包括已成功使用但本方案未直接涵盖的方法实例，如RNA的SPRI磁珠纯化、RNA测序和质谱分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62639/62639fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>酵母提取物</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>70178</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖（右旋糖）</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>49139</td><td></td></tr><tr><td>硫酸腺嘌呤</td><td>Amresco</td><td>0607-50G</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>F11635-500ML</td><td>ACS级试剂，37&amp;nbsp;wt. % 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，含10-15%甲醇作为稳定剂（防止聚合）</td></tr><tr><td>RNaseOUT&amp;trade; 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>Invitrogen&amp;trade; byThermo Fischer Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&amp;trade;，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>COEDTAF-RO Roche by Merck</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁溶液</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸溶液</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ambion&amp;trade; RNase I，克隆型，100 U/&amp;micro;L&lt;/em&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;SUPERase&amp;bull;In&amp;trade; RNase抑制剂（20 U/&amp;mu;L）&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen&amp;trade; by Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>酸性苯酚:氯仿:异戊醇 125:24:1（pH 4.0-5.0）</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>P1944-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&amp;trade; 羊抗小鼠IgG磁珠</td><td>Invitrogen&amp;trade; by Thermo Fisher Scientific)</td><td>11033</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠（3 M），pH 5.5</td><td>Invitrogen&amp;trade; by Thermo Fisher Scientific)</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>糖原（5 mg/ml）</td><td>Invitrogen&amp;trade; by Thermo Fisher Scientific)</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯级</td><td>Merck; Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Amersham&lt;sup&gt;&amp;trade;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;Hybond&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; P 蛋白印迹膜，PVDF</td><td>Merck</td><td>GE10600023</td><td>PVDF膜用于蛋白印迹</td></tr><tr><td>Bolt&amp;trade; 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm，Mini Protein Gel</td><td>Invitrogen&amp;trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>NW04120BOX</td><td>蛋白凝胶</td></tr><tr><td>4X Bolt&amp;trade; LDS 上样缓冲液</td><td>Invitrogen&amp;trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>B0007</td><td>&amp;nbsp;LDS上样缓冲液</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein&amp;trade; Kaleidoscope&amp;trade; 预染蛋白标准品</td><td>BioRad</td><td>1610375</td><td>蛋白分子量标准</td></tr><tr><td>20X Bolt&amp;trade; MES SDS 电泳缓冲液</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>B0002</td><td>PAGE电泳缓冲液</td></tr><tr><td>Intercept&amp;reg; (PBS) 封闭缓冲液</td><td>LI-COR</td><td>927-70001</td><td>Odyssey封闭缓冲液（PBS）</td></tr><tr><td>IRDye&amp;reg; 800CW 羊抗小鼠IgG二抗</td><td>LI-COR</td><td>92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye&amp;reg; 800CW 羊抗兔IgG二抗</td><td>LI-COR</td><td>92632211</td><td></td></tr><tr><td>TAP标签多克隆抗体</td><td>Invitrogen&amp;trade; by ThermoFischer Sientific</td><td>CAB1001</td><td></td></tr><tr><td>抗β-肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>84097</td><td>BioUltra，分子生物学级，&amp;ge;99.5%（HPLC）</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇溶液</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>43816</td><td>BioUltra，分子生物学级，~1 M 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Terumo 1CC/mL 注射器</td><td>Terumo Syringe</td><td>878499</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>(Merck/Sigma-Aldrich)</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>含钙镁的磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Tris盐酸盐</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢研磨罐</td><td>Retsch</td><td>02.462.0059</td><td></td></tr><tr><td>MM400 混合研磨仪</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td></td></tr><tr><td>梯度分馏仪</td><td>Brandel</td><td>BRN-BR-188</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605271</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 带锁装置的微量离心管</td><td>Eppendorf Safe-Lock</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel 电泳槽</td><td>(Thermo Fisher Scientific)</td><td>A25977</td><td>PAGE电泳槽</td></tr><tr><td>5 mL 开口薄壁超透明离心管，13 x 51 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>13.2 mL 认证无菌开口薄壁聚丙烯离心管，14 x 89 mm - 50支装</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 超滤装置</td><td>Merck</td><td>UFC5030</td><td>Ultracel-30 再生纤维素膜，0.5 mL 样品体积</td></tr><tr><td>Thermo Sorvall Evolution RC 地面超速离心机</td><td>Cambridge Scientific</td><td>15566</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-90K</td><td>GMI</td><td>8043-30-1191</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 175 cm² 培养瓶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 锥形离心管</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL1250</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL1100</td><td></td></tr><tr><td>DNA低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>5810 R 冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>适用于50 mL离心管</td></tr><tr><td>轨道摇床培养箱</td><td>Ratek</td><td>OM11</td><td></td></tr><tr><td>Frezco 17 微型离心机</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf DNA低吸附管</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; Protein LoBind 管</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108116</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 摆动桶转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&amp;trade; 150i CO2 培养箱，150 L</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mL 超细II型短胰岛素注射器</td><td>BD Medical</td><td>328822</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 带鲁尔锁扣头的注射器</td><td>BD Medical</td><td>302113</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 16 mm 皮下注射针头</td><td>Terumo</td><td>TUAN2516R1</td><td></td></tr></tbody></table>

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

涉及信使RNA（mRNA）快速重分布及mRNA翻译改变的快速响应，与细胞正在进行的稳态调节密切相关。这些调节对于真核细胞在营养和盐度波动、温度变化以及各种化学和辐射胁迫条件下的存活能力和“损伤控制”至关重要。由于RNA水平响应具有高度动态性，且许多RNA:RNA和RNA:蛋白质中间体不稳定，因此仅通过有限的几种方法才能获得有意义的细胞质RNA状态快照。全转录组范围、基于RNA测序的核糖体谱分析（ribosome profiling）类实验是研究翻译调控最具信息量的数据来源之一。然而，若缺乏对RNA及RNA:蛋白质中间体的统一稳定化处理，则可能导致不同的偏差，尤其是在快速响应的细胞通路中。本文提供了一种适用于不同通透性真核细胞的快速固定详细方案，以辅助稳定RNA及RNA:蛋白质中间体。我们进一步提供了基于核糖体及多（核糖）体组分共沉降方法分离稳定化RNA:蛋白质复合物的示例。所分离的稳定化材料可后续用于核糖体谱分析类实验，例如翻译复合物谱分析（Translation Complex Profile sequencing, TCP-seq）及其衍生技术。目前，TCP-seq类方法的通用性已在多种生物体和细胞类型的应用中得到验证。由于交联易于逆转，这些稳定化的复合物还可进一步进行亲和纯化，并通过电子显微镜成像，或分离至不同的多（核糖）体组分后进行RNA测序。因此，基于瞬时冷冻和甲醛固定的处理方法，结合基于沉降或其他类型的RNA:蛋白质复合物富集技术，特别适用于在活细胞中深入探究快速RNA:蛋白质复合物动态的精细机制。

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。

涉及信使RNA（mRNA）的快速重新分布和mRNA翻译改变的快速反应，与正在进行的稳态调节密切相关……

该实验流程包括在严格控制的环境条件下培养细胞，使用融化的水/冰快速冷却细胞，并用预先优化浓度的甲醛和孵育时间进行固定。随后，通过过量含有伯氨基的化合物（如甘氨酸或Tris）终止固定反应。收集细胞，洗涤后可冷冻保存。固定后的细胞可通过机械或化学方法裂解，所得裂解液可用于根据核糖体组分的分子大小、沉降特性或亲和标记进行分离。该方法可获得多种用途的材料，适用于免疫辅助纯化与检测、电子显微镜下含特定因子复合物的富集。经过交联深度封闭后，可进一步开展基于RNA扩增或杂交的分析，实现RNA测序和质谱分析。在摇床中培养一升酵母菌液，起始光密度在600纳米处不超过0.05个吸光度单位，并在30摄氏度下使用蛋白胨和葡萄糖培养基。准备一台制备型离心机，配备适用的转子和离心瓶，用于在4摄氏度下以5000 ×g离心收集酵母细胞的液体悬浮液。记录酵母细胞生长过程中的光密度值。如果关注的是对数生长期，则在收集时，细胞在600纳米处的吸光度必须介于0.6至0.8吸光度单位之间。一旦细胞准备就绪，需在化学通风橱内设置一个冰盒，其中放置一个装有250克洁净碎冰的烧杯，并将25毫升胰蛋白酶以及新购入的、以甲醇稳定的37%甲醛溶液置于通风橱内。将最新的一份细胞培养物倒入装有冰的烧杯中。然后加入75毫升37%的甲醛，使终浓度为2.2%（重量/体积），剧烈搅拌混合物直至冰完全融化。冰融化后，设置计时器孵育10分钟。孵育结束后，将培养物转移至预冷的离心管中，在4°C、5000 ×g条件下离心5分钟以沉淀细胞。离心过程中，将一个50毫升离心管预冷，并将含有甘氨酸的新鲜配制缓冲液A置于冰上，用于中和残留的甲醛。离心后，将离心管置于冰上，使沉淀一侧与冰接触。将离心管移入通风橱，并将上清液弃入甲醛废液容器中。使用25毫升移液管将旧管中的细胞沉淀重悬于20毫升缓冲液A中，并转移至50毫升离心管中。用缓冲液A定容至40毫升，于4摄氏度、5000 G离心5分钟收集洗涤后的细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于40毫升缓冲液A1中（即不含甘氨酸的缓冲液A），以去除甘氨酸污染。再次于4摄氏度、5000 G离心5分钟收集细胞沉淀。用缓冲液 A 再重复洗涤一次。弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上。称量含有沉淀的离心管，湿细胞质量应约为每升细胞培养物一克。用液氮填充衬有铝箔的聚苯乙烯盒，液氮深度约为三厘米。将50毫升离心管直立放入盒中。加入550微升缓冲液A2，通过移液吹打重悬沉淀，并涡旋10秒。加入10微升浓度为每微升40单位的RNase抑制剂，再次涡旋振荡10秒。使用1毫升移液器将细胞悬液逐滴加入含有液氮的50毫升容器中。为下一步操作做准备，将1.5毫升无核酶管和10毫升不锈钢研磨罐置于干冰上预冷。使用洁净的无菌刮勺将冷冻的细胞悬液液滴转移至研磨罐中。将研磨罐浸入液氮中一分钟，确保液相部分始终高于连接处。设置冷冻混合研磨仪在27赫兹条件下振荡研磨一分钟。将密封的研磨罐在混合球磨机中以27赫兹振荡1分钟。像之前一样，将研磨罐在液氮中重新冷却，并再振荡1分钟。将研磨罐转移至装有干冰的冰盒中，并与1.5毫升无核溶液管一同放置。使用小型钢制刮勺将研磨后的样品转移至加有垫料的离心管中。随后将离心管置于零下80摄氏度保存。在两个T175培养瓶中，用DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）加10%胎牛血清，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养HEK 293细胞，使其生长至60%至70%融合度。在预定固定时间至少三小时前，将 T175 培养瓶中的培养基更换为精确的 30 毫升预热完全培养基。准备一个装满碎冰的冰盒，并连同所需缓冲液一起置于冰上，放置于通风橱内。为快速冷却细胞，从培养箱中取出 T175 培养瓶，将其紧贴冰面，确保最大面积接触。在化学通风橱内，将锥形瓶倾斜至侧放，使培养基聚集在细胞所在位置的对侧。用移液器直接将168微升37%（质量/体积比）的甲醛加入积聚的培养基中，终浓度为0.2%甲醛。立即混匀。将培养瓶置于冰上继续孵育10分钟。从与细胞相对的一侧倾倒培养瓶，将培养基倒入适当的废液容器中。使用移液器，在与细胞相对的一侧轻轻加入 30 毫升不含钙离子和镁离子的 Dalbecco 磷酸盐缓冲液，并额外含有 50 毫摩尔甘氨酸。通过轻轻摇晃培养瓶混匀，将培养瓶恢复至水平位置，在冰上继续孵育 10 分钟。将溶液从与细胞相对的瓶口侧倾倒出去，然后轻轻加入 7 毫升标准的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，以解离并重新悬浮细胞。将烧瓶在室温下孵育5分钟，最多不超过10分钟。将烧瓶垂直放置，使用移液器轻轻冲洗瓶壁上残留的细胞，收集脱落的细胞，并将悬液转移至置于冰上的50毫升离心管中。立即向收集的悬液中加入20毫升完全培养基，并通过轻轻翻转离心管混匀。将离心管在100 G、4摄氏度条件下离心5分钟，使细胞沉淀。细胞沉淀必须清晰可见。弃去上清液，并在沉淀中加入10毫升不含甘氨酸的达尔伯克氏磷酸盐缓冲液，轻轻重悬。将离心管再次在100 G、4摄氏度条件下离心5分钟，弃去洗涤缓冲液，将沉淀重悬于800微升冰冷的不含甘氨酸但含有镁离子和钙离子的Dulbecco's磷酸盐缓冲液中。将重悬的细胞转移至一个新的低蛋白结合的1.5毫升微量离心管中。在4摄氏度条件下，以100 G离心3分钟。使用1 mL移液器小心弃去上清液。此时，细胞沉淀可在-80 °C条件下冷冻保存，或直接进行细胞裂解步骤。在生物安全柜中加入300 µL基于非离子型、非变性去污剂的裂解缓冲液以及7 µL精氨酸酶抑制剂，用1 mL枪头反复吹打充分混匀。将一根25号针头小心地安装到1至3毫升的注射器上，用力吹打混合物，至少进行七次缓慢向上吸液和快速向下排液的操作。将注射器和针头丢弃至锐器盒中，然后使用31号针头和0.3毫升注射器重复上述步骤。将注射器和针头丢弃至锐器盒中。将离心管在 4°C 条件下以 12,000 G 离心五分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的低蛋白结合 1.5 毫升微量离心管中。将细胞碎片和裂解液均于 -80°C 保存。翻译复合物对缓冲液的离子组成较为敏感。省略氯化镁并添加EDTA会消除高沉降特性；尽管氯化钙能够产生更好的结果峰，但其改善效果有限。因此，我们选择了缓冲液一。2.2% 质量体积比的甲醛能极好地保存多核糖体，且与 4% 质量体积比的甲醛相比，不会降低总体得率。在哺乳动物细胞中，使用了低得多的甲醛浓度，即 0.2% 质量体积比，因为较高浓度会导致多核糖体物质大量损失。在裂解液及所有后续缓冲液中加入15毫摩尔EDTA后，来自固定细胞的多聚核糖体组分表现出明显较弱的去稳定作用。使用4%固定细胞材料时，50毫摩尔EDTA部分重现了这一效果，材料更耐受，展开程度更低。葡萄糖耗尽可能引发酵母中最显著且最迅速的翻译抑制效应之一。神经添加物和局部诱导的条件均导致多聚核糖体解聚，但在添加低浓度葡萄糖的情况下，保留的多聚核糖体略多，差异明显。重要的是，经固定细胞提取的多聚核糖体物质在饥饿与非饥饿细胞之间表现出显著差异，表明甲醛固定适用于保存动态翻译过程中的差异。在诸如tacy paysake等方法中，进一步去除不能与完整核糖体有效共沉淀的小核糖体亚基可能更具洞察力；为此，我们采用两步超速离心法，从而分离出SSU、LSU、RS、RNase抗性的diazomes、DS以及通过电子显微镜验证的高阶多聚核糖体。与未固定的细胞相比，固定细胞的材料显示，在沉降速度最快的核糖体组分中，不稳定型eIF4A的含量升高。利用eIF4A tapi菌株的固定材料，通过磁性IDG珠子捕获并富集含eIF4A的复合物，我们发现在RNase I解离后的第二梯度中，SSU和RS组分中的eIF4A相对于β-actin出现选择性富集，而在LSU组分中则未观察到该现象。与其他翻译暂停方法相比，甲醛穿过细胞膜的作用迅速，且其交联具有非特异性，因而有望最大程度地保留翻译复合物中间体的多样性。我们的研究结果证实，快速甲醛固定法可用于稳定高度瞬时的复合物，并证明其在细胞快速响应环境变化或应激条件等情形下的实用性。

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科研

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Biology

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一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

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基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

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快速体内真核细胞中翻译复合物的固定与分离

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快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

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