5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸-组蛋白H3双标记方案用于 果蝇 神经干细胞的细胞周期进展分析

在该协议中，我们不仅详细介绍了EDU掺入和免疫染色的每个步骤，还解释了图像采集，图像处理，并提供了一些分析大型数据集的技巧。该技术允许在G1，S和M阶段分配细胞。这对于影响有丝分裂基因的非突变研究的细胞周期分析特别有用。

我们预计，如果人们没有这种技术的先验知识或经验，他们会挣扎两到三个月。首先，将施耐德解剖培养基或SM添加到光泽点板的两个连续凹陷中，并将PBS添加到随后的凹陷中。使用一对镊子，挑选游荡的三龄幼虫，并将它们放在用PBS缠绕的纸巾上，以清除苍蝇的食物残渣。

将幼虫置于具有PBS的洼地中，然后放置含有SM的连续凹陷区。接下来在解剖显微镜下，使用细镊子去除幼虫下半身的四分之三。然后用一对镊子轻轻抓住幼虫嘴钩，并用另一对镊子握住另一端的角质层。通过将嘴钩向内推，同时剥离另一端的组织，将幼虫头内向外翻转。

观察附着假想盘的幼虫大脑。去除附着在大脑上的其他组织，并将大脑转移到随后的SM连续抑郁中。将100微升100微摩尔EDU SM溶液加入Pyrex板上的另一个凹陷中，并在该溶液中孵育约5至10个解剖的大脑，在25摄氏度下孵育2小时。固定和免疫染色后，取出PBST，并将EDU检测鸡尾酒加入解剖的大脑中。

然后在室温下在黑暗中孵育它们。30分钟后，在黑暗中每次洗涤，用PBST洗涤样品两次，每次洗涤10分钟。对于DNA染色，每毫升制备5微克Hoechst 33342溶液。

第二次洗涤后取出PBST，并向解剖的大脑中加入500微升的Hoechst溶液，然后在黑暗中孵育它们。10分钟后，取出Hoechst并用PBST洗涤样品10分钟。将管子敲到实验室工作台上，让大脑安定下来。

从试管中取出PBST，留下50至100微升。切下200微升微量颗粒尖端的末端，用它来将大脑转移到干净的载玻片上。通过用滤纸条擦印从载玻片中取出访问PBST。

不要让滤纸碰到大脑。将一滴水溶性、非荧光安装介质滴到大脑上，并定向大脑，使腹侧神经索面向载玻片，叶朝上。将大脑排列在单个文件中，以便更容易地连续成像大脑。

轻轻地将盖玻片放在大脑顶部，并在2至6摄氏度下将滑轨孵育过夜。从采集软件中选择63次物镜。在安装的大脑正上方的盖玻片上滴一滴浸入油，以便更容易通过目镜定位组织。

使用dappy Hoechst 33342通道，通过目镜找到大脑，然后在软件中切换到采集模式。设置 4 个通道来映像 Hoechst 33342、Alexa floor 4 8 8、Alexa floor 5 6、8 和 Alexa floor 6 4 7。使用染料助手工具自动设置所选染料激发激光器和发射滤光片。

设置视野，使其包含整个脑叶。通过获得相距0.8微米的税收间隔来成像脑叶的整个体积。将成像会话中的所有图像以点 L I F 库格式存储。

对于图像分析，打开斐济，然后将LIF文件拖放到斐济。从堆栈查看选项卡中选择数据浏览器，并从bio formats插件的内存管理选项卡中使用虚拟堆栈。观察图像J中显示的多通道图像，使用图像，颜色和通道工具从菜单栏更改通道的颜色。

并监测米兰达标记的神经母细胞，它们在中枢脑区域显示为大圆形细胞。使用椭圆工具在每个神经母细胞上绘制一个感兴趣的区域，以避免对神经母细胞进行两次计数。从图像 J 菜单栏中，选择分析、工具和 ROI 管理器。

标记当前Z部分中的所有神经母细胞，并在标记每个细胞后按T。一旦标记了当前Z切片中的所有神经母细胞，将通道更改为pH3和EDU，并手动计数EDU阳性神经母细胞，pH3阳性神经母细胞，EDU和pH3阳性神经母细胞的数量，以及未染色任何一种标志物的神经母细胞的数量。搜索神经母细胞和后续 Z 部分，删除旧的 ROI 并添加新的 ROI 以计算不同堆栈中的神经母细胞。

准备一个电子表格，并计算每个叶在所有四个类别中存在的神经母细胞的百分比。使用电子表格软件准备条形图，显示每个类别中神经母细胞百分比的池数据。这里显示了来自标记有米兰达，EDU和pH3的三龄幼虫脑的中枢脑神经母细胞。

将细胞分配到G1 / G0，S，SG2 / M和M阶段。在EDU pH3分析中，与野生型神经母细胞相比，MMS19在M期发现功能丧失神经母细胞的比例显着更高。MMS19:eGFP在MMS19功能丧失背景中的表达挽救了M期细胞比例为野生型水平。

重要的是不要使用受损的大脑进行后续步骤。在开始解剖之前，应新鲜制备ED溶液。该资产可用作快速初始筛选，以识别特定细胞周期阶段的缺陷。

然后，可以对特定阶段进行更详细的分析。