Name: 5-乙炔基-2-脱氧尿苷/磷酸-组蛋白H3双标记方案用于 果蝇 神经干细胞的细胞周期进展分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习使用EdU和磷酸化组蛋白H3双标记技术对果蝇幼虫大脑神经干细胞进行细胞周期分析的方法。该方案可区分G1、S和M期细胞，有助于研究基因突变对细胞周期的影响。

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本研究由瑞士国家科学基金会（项目资助号 31003A_173188；www.snf.ch）和伯尔尼大学（www.unibe.ch）为 BS 提供资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. Click-it EdU 检测所需试剂与储备液的制备
注意：有关试剂盒及其所含试剂的详细信息，请参见材料表和表1。
<ol>
	<li>在配制溶液前，先将小瓶恢复至室温。</li>
	<li>通过加入 2 mL 二甲基亚砜（DMSO，组分 C）配制 10 mM EdU（组分 A）储备液。充分混匀后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>通过加入 70 μL 二甲基亚砜（DMSO，组分 C）配制 Alexa Fluor 647-叠氮化物（组分 B）工作液。充分混匀后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>将 4 mL Click-iT EdU 反应缓冲液（组分 D）与 36 mL 去离子水混合，配制成 1x 的溶液。剩余溶液于 2–6 °C 保存。</li>
	<li>加入 2 mL 去离子水配制 10x 储备液（200 mg/mL）的 Click-iT EdU 缓冲液添加剂（组分 F）。充分混匀后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>Hoechst 33342（组分 G）于 2–6 °C 保存。DMSO（组分 C）置于干燥器中于 -20 °C 保存。 
	&#8203;注意：操作 DMSO 和 Hoechst 时应佩戴手套。</li>
</ol>
2. 三龄幼虫大脑的解剖及EdU掺入
注意：脑组织解剖方案此前已有描述12。开始解剖前，请确保按照 2.6 和 3.1 节所述，已配制并充分解冻足量的 EdU 溶液和 PFA 溶液。
<ol>
	<li>配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS），加入25.6 g Na2HPO4.7H20、80 g NaCl、2 g KCl 和 2 g KH2PO4 加去离子水至 1 L。调节 pH 至 7.4，随后用去离子水配制 1x 溶液。</li>
	<li>向玻璃凹板（3孔或9孔）的连续两个凹孔中加入Schneiders解剖培养基（SM），向下一个连续的凹孔中加入1×PBS。</li>
	<li>使用镊子夹取游走期三龄幼虫，置于经 PBS 湿润的组织上以清除食物残渣。将幼虫放入含有 PBS 的凹槽中，随后转移至含有 SM 的下一个凹槽中。</li>
	<li>使用一对精细镊子，去除四分之三th 幼虫下部身体
	<ol>
		<li>用一对镊子轻轻夹住幼虫的口钩，另一对镊子夹住另一端的角质层。</li>
		<li>通过向内推压口钩，同时从另一端剥离组织，将幼虫头部翻转。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察带有附着的成虫盘的幼虫脑组织。去除脑组织上附着的其他组织，将脑组织转移至下一个含有SM的连续凹槽中。</li>
	<li>解冻10 mM EdU储备液。用SM将该10 mM储备液稀释，配制成100 μM溶液。</li>
	<li>在Pyrex培养板的另一个凹槽中加入100 μL该100 μM EdU+SM溶液。将约5–10个解剖获得的脑组织置于100 μL 100 μM EdU+SM溶液中，于25 °C孵育2 h。 
	&#8203;注意：由于神经母细胞（NBs）大约每2小时分裂一次，本方案旨在分析一个完整的细胞周期。仅使用完整的脑组织进行后续步骤。在解剖过程中受损的脑组织应予以弃用。</li>
</ol>
3. 固定与免疫染色
<ol>
	<li>在通风橱中配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。
	<ol>
		<li>将 4 g 多聚甲醛粉末加入置于磁力搅拌器上的烧杯中，内含 80 mL 1× PBS，加热至 60 °C。为溶解 PFA，滴加几滴 1 N NaOH。检查 pH 值，必要时用几滴 1 M HCl 调整至 7.0。</li>
		<li>用 1× PBS 定容至 100 mL。将 PFA 溶液分装后，于 2–6 °C 保存，最多可保存 1 个月。对于幼虫脑等较大组织的高效固定，可在 PFA 溶液中添加 0.3% 非离子型去垢剂（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EdU 掺入后，将脑组织转移至含有 4% PFA 的 0.6 mL 微量离心管中。在旋转摇床（nutator）上室温孵育 15 分钟。轻敲管壁，使脑组织沉降至管底。</li>
	<li>去除 PFA 溶液，用含 0.3% 非离子型去垢剂的 PBS（PBST）在室温下洗涤 3 次。确保每次在旋转摇床上洗涤至少 10 分钟。最后一次洗涤后，去除 PBST，加入封闭液（PBST + 5% 牛血清白蛋白），室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>将抗 Miranda 抗体（1:250 稀释）和抗 pH3 抗体（1:200 稀释）溶于 PBST 中（两种抗体置于同一管中）。去除封闭液，加入一抗溶液。在旋转摇床上 2–6 °C 过夜孵育。 
	注意：Miranda 是存在于 CB 神经母细胞（NBs）上的膜蛋白，可用于鉴定 CB 区域中的这些大型圆形细胞13。</li>
	<li>去除一抗溶液，用 PBST 洗涤 3 次。确保每次在室温下于旋转摇床上洗涤 10 分钟。</li>
	<li>在 PBST 中按 1:500 稀释 Alexa Fluor 488 标记的抗兔抗体和 Alexa Fluor 568 标记的抗大鼠抗体，配制二抗溶液。去除 PBST，向解剖得到的脑组织中加入二抗溶液。在避光、旋转摇床条件下于 2–6 °C 过夜孵育，并用 PBST 洗涤 3 次（步骤 3.5）。</li>
</ol>
4. EdU 检测、DNA 染色和封片
<ol>
	<li>&#160;为配制 EdU 检测混合液，将组分（见表 2）在 1.5 mL 离心管中混合。</li>
	<li>最后一次洗涤后（步骤 3.6），吸除 PBST，向解剖所得脑组织中加入 EdU 检测混合液。在室温下避光孵育 30 分钟（使用振荡器）。随后在避光条件下用 PBST 洗涤 2 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>进行 DNA 染色时，将 Hoechst 33342（组分 G）用 PBST 按 1:2,000 比例稀释，配制成 5 μg/mL 的溶液。</li>
	<li>第二次洗涤后（步骤 4.2），吸除 PBST，向脑组织中加入 500 μL 的 5 μg/mL Hoechst 溶液。避光孵育 10 分钟。随后吸除 Hoechst 溶液，并用 PBST 洗涤 1 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>轻敲离心管管壁使脑组织沉降至管底，吸除 PBST，仅保留 50–100 μL 液体。</li>
	<li>剪去 200 μL 微量移液器吸头的尖端，小心地将脑组织转移至洁净的玻璃载玻片上。用滤纸条轻轻吸除载玻片上的多余 PBST，注意避免滤纸接触脑组织。</li>
	<li>在脑组织上滴加一滴水溶性、非荧光封片剂，调整脑组织方向，使腹神经索朝向载玻片，脑叶朝上。将脑组织排成单列，以便后续连续成像。</li>
	<li>轻轻盖上盖玻片，将载玻片置于 2–6 °C 过夜。 
	&#8203;注意：封片剂在过夜后会固化，因此无需使用指甲油封固盖玻片。</li>
</ol>
5. 成像
注意：有关本实验方案中使用的激光扫描显微镜和油浸物镜的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>在Acquisition软件中，选择63x物镜。</li>
	<li>在已固定的脑组织上方的盖玻片上滴加一滴浸油，以便通过目镜更易定位组织。</li>
	<li>使用DAPI/Hoechst 33342通道，通过目镜找到脑组织，然后切换至软件中的采集模式。</li>
	<li>设置4个成像通道，分别用于Hoechst 33342（DNA）、Alexa Fluor 488（pH3）、Alexa Fluor 568（Miranda）和Alexa Fluor 647（EdU）。使用dye-assistant工具，该工具将自动为所选荧光染料配置激发激光器和发射滤光片。</li>
	<li>设置视野范围，使其涵盖整个脑叶。通过以0.8 μm间距采集z轴层扫图像，对脑叶的完整体积进行成像。将一次成像会话中的所有图像以*.lif库格式存储。</li>
</ol>
6. 图像分析
注意：以下步骤描述了如何使用 ImageJ 软件对已获取的图像进行分析，并将细胞分选为 G0/G1 期、S 期、S&#62;G2/M 期（从 S 期进展到 G2/M 期）以及 M 期。
<ol>
	<li>从以下网址下载 Fiji（Fiji 即 ImageJ）：https://fiji.sc/。打开 Fiji 后，将 .lif 文件拖放至 Fiji 界面。 
	注意：Fiji 是预装了多个插件的 ImageJ 版本14。将 .lif 文件导入 Fiji 时会自动启动 Bio-formats 插件，该插件用于处理 .lif 文件。Bio-formats 插件还可用于打开其他显微镜品牌生成的图像文件，例如尼康显微镜生成的 nd2 文件。此插件已预装在 Fiji 中。</li>
	<li>在 Bio-formats 插件中，从 堆栈查看 选项卡选择 数据浏览器，并在 内存管理 选项卡中启用 使用虚拟堆栈。 
	注意：包含 8–10 个大脑 z 堆栈的 .lif 文件通常大小为 300–400 兆字节。在内存较低的计算机上，同时打开多个此类文件可能迅速耗尽 ImageJ 可用内存，导致无法继续进行图像处理。虚拟堆栈为“只读”模式，处理时无需高内存，是将大型数据集加载至 Fiji 的理想选择。</li>
	<li>在 ImageJ 中观察显示的多通道图像。通过菜单栏中的 图像 | 颜色 | 通道工具 更改各通道的颜色。在 CB 区域观察 Miranda 标记的神经母细胞（NBs），其表现为较大的圆形细胞。</li>
	<li>使用 椭圆 工具在每个 NB 上绘制感兴趣区域（ROI），以避免重复计数。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 菜单栏 中，选择 分析 | 工具 | ROI 管理器。标记当前 z 切片中的所有 NB，并在标记每个细胞后按 t 键。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当当前 z 切片中的所有 NB 均被标记后，切换至 pH3 和 EdU 通道，手动统计 EdU 阳性 NB、pH3 阳性 NB、同时对 EdU 和 pH3 双阳性染色的 NB，以及两种标记均阴性的 NB 数量。</li>
	<li>在后续 z 切片中继续搜索 NB，删除旧的 ROI，并添加新的 ROI，以在不同堆栈中完成 NB 计数。</li>
	<li>准备一个电子表格，包含以下列：1. EdU- pH3-：代表细胞周期 G0/G1 期的双阴性细胞；2. EdU+：此类细胞已掺入 EdU，正处于 DNA 复制阶段（S 期）；3. EdU+ pH3+：此类双阳性细胞已完成 S 期，已进入 G2 或 M 期；4. pH3+：此类 NB 正处于有丝分裂阶段。</li>
	<li>计算每个脑叶中上述四类 NB 所占的百分比。使用电子表格软件绘制柱状图，展示各分类中 NB 百分比的汇总数据。</li>
</ol>

<ol><li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li>
<li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review+of+regulation%2C+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li>
<li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li>
<li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894(2015).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers%3A+A+comparative+study+with+Ki67%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).</li>
<li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li>
<li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miranda%2C+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division%2C+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li>
<li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NVX-412%2C+a+new+oncology+drug+candidate%2C+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015(2012).</li>
<li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53%2Fp21%28WAF1%29+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li>
<li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+S-phase+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Developing S-phase control.</a> Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li>
<li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li>
<li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29-coupled-fluorescence-intensity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

EdU 掺入及其随后与细胞通透性叠氮化物发生的“点击”反应，相较于早期使用的 BrdU 方法具有实际优势7。然而，该反应由 Cu(I) 离子催化，某些染料在此铜催化剂存在下可能不稳定，这一点已被 Click-it EdU 试剂盒制造商明确警示。当在完成 EdU 检测步骤后进行免疫染色实验时，红光通道染料 Alexa Fluor 568 和 Cy3 未观察到预期的信号强度。然而，若在 EdU 检测步骤之前完成免疫染色反应，则实验结果良好。采用该方案，使用四个通道分别可视化 Hoechst、pH3、Miranda 和 EdU。
本方案中另一个优化的步骤是采用分离的脑组织直接摄取EdU，而不是通过向幼虫喂食添加EdU的果蝇食物。由于完整的黑腹果蝇（Drosophila）神经母细胞周期持续约2–2.5小时16，因此本方案中脑组织在EdU中孵育2.5小时，可实现对神经母细胞一个完整细胞周期的追踪。对EdU和pH3均无阳性染色的细胞为静息细胞。在三龄幼虫中，由于神经母细胞正处于活跃...

细胞分裂周期包括G1期（第一间隙期）、复制/S期、G2期（第二间隙期）和M期（有丝分裂期）。在经历这些阶段的过程中，细胞在转录、翻译以及细胞骨架系统的重组方面会发生显著变化1,2。响应发育和环境信号，细胞可能暂时停止分裂而进入静息状态（G0期），或发生分化并永久停止分裂3。其他情况，如DNA损伤，可能导致细胞过早分化或发生凋亡3,4。此类信号的响应由细胞周期检查点介导，这些检查点作为监控系统，确保在细胞进入分裂周期下一阶段之前，关键的细胞过程保持完整5。因此，针对调控DNA复制、检查点及有丝分裂机制的基因研究，需要分析突变细胞或通过siRNA敲低这些基因时可能出现的细胞周期进程异常。此外，此类分析也可用于评估细胞整体健康状况以及细胞对药物处理的反应。
5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）是一种胸苷类似物，可在DNA复制过程中掺入DNA中6。该方法曾被广泛用于鉴定处于S期的细胞。然而，后续需要进行强烈的DNA变性处理，以便利用抗BrdU抗体检测BrdU6。这种剧烈处理可能破坏细胞表位，从而阻碍通过免疫染色对样本进行进一步表征。EdU的掺入及其随后通过铜催化的“点击反应”与小分子、可穿透细胞膜的荧光标记叠氮染料进行检测，避免了剧烈变性步骤的需要7。因此，该方法成为比BrdU掺入更为实用的替代方案。
此外，已有文献将pH3描述为有丝分裂期/M期细胞的可靠标志物8。组蛋白H3是一种与DNA结合的核心组蛋白蛋白，在G2晚期至M期早期发生磷酸化，并在后期末期去磷酸化8。目前已有多种商用抗体可用于通过标准免疫染色方案检测pH3。因此，对EdU和pH3进行双重染色可同时检测处于S期和M期的细胞。此外，处于G1期和G2早期的细胞对这两种标志物均不会呈现阳性染色。
果蝇 神经干细胞或成神经细胞（NBs）提供了一个特征明确的干细胞模型，其中细胞通过不对称分裂产生一个与母细胞相同的自我更新的成神经细胞和一个注定分化的神经节母细胞（GMC）。9此外，多种遗传工具和神经母细胞特异性抗体使该系统适用于遗传操作和活细胞成像。因此，已有多个研究利用神经母细胞研究调控不对称分裂和细胞命运决定的基因9在幼虫大脑的中央脑（CB）和视叶（OL）中存在不同的神经母细胞群体9用于本研究的是 CB 神经母细胞（NBs）。这些三龄幼虫期的 CB 神经母细胞是体积较大的细胞，也适用于研究调控有丝分裂纺锤体组装的因素。分析细胞周期进程缺陷的实验方案将为这类研究提供重要的工具。
早期发表的实验方案采用了商业试剂盒，例如Click-iT EdU Alexa Fluor细胞增殖检测试剂盒，该试剂盒提供多种反应组分以及与不同Alexa Fluor染料标记的叠氮染料，用于EdU的掺入与检测10。然而，此类试剂盒所提供的试剂与常用于二抗的一些荧光标签不兼容。本研究测试了该EdU检测试剂盒（Click-iT EdU Alexa Fluor细胞增殖检测试剂盒，配备Alexa Fluor 647偶联的叠氮染料），在黑腹果蝇（Drosophila）三龄幼虫神经母细胞（NBs）中进行应用，并尝试与抗pH3抗体及Miranda抗体（神经母细胞标记物）进行共染色。此外，使用Alexa Fluor 568或Cy3标记的二抗来检测神经母细胞质膜上的Miranda信号11。然而，在完成EdU检测后再进行免疫染色时，这些二抗未能观察到预期的信号强度和染色模式（未发表结果）。
对于EdU掺入实验，Daul及其同事所描述的方案需要将幼虫喂食含有EdU和溴酚蓝（BPB）的Kankel-White培养基10。幼虫摄取添加了EdU和BPB的食物后，可在其肠道中观察到蓝色，从而确认摄食行为。尽管该方法曾用于Mms19功能缺失型（Mms19P）三龄幼虫的EdU掺入实验，但Mms19P幼虫似乎并未有效进食，因其肠道中几乎未检测到蓝色（未发表结果）。Mms19P幼虫表现出严重的发育畸形，并最终停滞在三龄阶段。这可能在某种程度上影响了三龄幼虫的摄食行为，从而使EdU喂食方案不适用于此类情况。
在系统研读现有文献并深入开展关键步骤标准化工作的基础上，本文提出了一种无需通过饲喂幼虫EdU即可实现果蝇（Drosophila）神经母细胞（NBs）EdU/pH3双标记的替代方法。此前虽有研究采用EdU与pH3双染色法分析NBs的细胞周期，但未提供详细的实验方案4，这为其他实验室重复该技术带来了不必要的障碍。此外，评估不同试剂与EdU检测试剂盒的兼容性并进行进一步优化，往往是一个耗时的过程。本文提供了一套详尽的分步操作流程，涵盖幼虫脑组织解剖后EdU的体外掺入、抗pH3抗体免疫染色，以及后续的共聚焦显微镜成像与图像分析，从而将NBs划分为四个明确的细胞周期阶段：G0/G1期、S期、S&#62;G2/M期（从S期向G2/M期过渡）以及M期。文中明确了需要优化的关键步骤，并提供了针对大规模图像数据集进行图像分析的实用建议。此外，本文还分析并比较了野生型NBs与近期报道存在细胞周期延迟的Mms19P&#160;NBs中的EdU/pH3检测结果11。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;果蝇品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P{&lt;em&gt;EPgy2&lt;/em&gt;}&lt;em&gt;Mms19EY00797&lt;/em&gt;/TM3, &lt;em&gt;Sb1 Ser1&lt;/em&gt; &lt;em&gt;(Mms19&lt;sup&gt;p&lt;/sup&gt;)&lt;/em&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#15477</td><td>Mms19 基因第三外显子中的P元件插入突变品系</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td><td>本实验室构建</td><td></td><td>Mms19p 背景下表达eGFP标记的Mms19蛋白</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#3605</td><td>野生型品系 (w;+;+)</td></tr><tr><td>一抗</td><td></td><td></td><td>稀释比例</td></tr><tr><td>大鼠抗Miranda抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab197788</td><td>1/250</td></tr><tr><td>兔抗pH3抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9701</td><td>1/200</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠Cy3抗体</td><td>Jackson Immuno</td><td>112-165-167</td><td>1/150</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠Alexa Fluor 568抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1/500</td></tr><tr><td>山羊抗兔Alexa Fluor 488抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A27034</td><td>1/500</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount 封片剂</td><td>Polysciences Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Click-it EdU 标记试剂盒，Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s 果蝇培养基</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td><td>Merck</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fischer Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>非离子型去垢剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRISM</td><td>GraphPad 软件</td><td>版本 5</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 激光共聚焦显微镜，配备63倍油镜、1.4 NA 平场复消色差物镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount 封片剂</td><td></td><td></td><td>水溶性、无自发荧光的封片介质</td></tr><tr><td>Pyrex 3孔或9孔玻璃凹板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 h3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

体内细胞周期进程分析通常用于研究调控有丝分裂和DNA复制的基因。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）被用来研究复制期/S期的进程，而抗磷酸化组蛋白H3的抗体则被用来标记有丝分裂期的细胞核和细胞。结合这两种标记方法，可将细胞周期分为G0/G1期（间隙期）、S期（复制期）和M期（有丝分裂期），并作为评估有丝分裂相关基因敲低或无效突变体对细胞周期进程影响的重要工具。然而，用于标记EdU标记细胞的试剂与多种荧光标记的二抗不兼容，这使得使用一抗和标记的二抗来标记pH3阳性有丝分裂细胞的免疫染色变得复杂。本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）幼虫神经干细胞中对EdU和pH3进行双重标记的逐步实验方案，该系统被广泛用于研究有丝分裂因子。此外，还提供了一套图像分析与定量方法的流程，用于将标记的细胞划分为三个不同类别：G0/G1期、S期、S&gt;G2/M期（从S期向G2/M期的进程）以及M期。

双叶型的Drosophila三龄幼虫脑已被用作研究基本细胞和发育过程的模型系统9。本研究的重点是介绍一种用于分析CB区域EdU和pH3标记的神经母细胞（NB）细胞周期进程的实验方案（图1）。CB区域的神经母细胞分为I型和II型，表现出典型的不对称分裂模式9。每次I型神经母细胞分裂产生一个具有自我更新能力的神经母细胞和一个注定分化的中间神经前体细胞（GMC）9。相比之下，II型神经母细胞产生可进行过渡性扩增的未成熟神经前体细胞（INP），这些细胞能够自我更新并进一步生成2个GMC9。尽管在OL区域存在一个独立的神经母细胞群体，但本研究聚焦于CB区域的神经母细胞，因其体积较大且可通过神经母细胞特异性标记物轻松识别。
本研究中，使用Miranda来识别和分析中央脑神经母细胞（CB NBs）（<strong class="x...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一种多步骤实验流程，可能需要进行大量优化。本文提供了一个详细方案，描述了该流程的全部步骤，包括图像分析和定量方法，以区分处于不同细胞周期阶段的细胞。

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

体内细胞周期进程分析通常用于研究调控有丝分裂和DNA复制的基因。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）...

本方案不仅详细阐述了EDU掺入和免疫染色的每一步操作，还介绍了图像采集、图像处理方法，并提供了一些分析大型数据集的实用技巧。该技术可用于确定细胞所处的G1期、S期和M期，对于研究非有丝分裂基因突变相关的细胞周期分析尤其具有应用价值。如果没有相关技术的前期知识或经验，预计需要两到三个月的时间才能掌握。首先，在凹玻片的连续两个凹槽中加入 Schneider 培养基或 SM，并在下一个凹槽中加入 PBS。使用镊子夹取游走期三龄幼虫，将其放置在浸有 PBS 的组织上，以清除残留的果蝇食物。将幼虫置于含有 PBS 的凹槽中，随后转移至下一个含有 SM 的连续凹槽。在解剖显微镜下，用精细镊子去除幼虫下半身的四分之三。然后用一对镊子轻轻夹住幼虫的口钩，另一对镊子夹住另一端的表皮。通过将口钩向内推，同时从另一端剥离组织，将幼虫头部翻转至内向外的状态。观察带有附着的成虫盘的幼虫脑。去除附着在脑组织上的其他组织，并将脑组织转移至载玻片凹槽中的SM中。在Pyrex板的另一个凹槽中加入100微升100微摩尔的EDU SM溶液，并将大约5至10个解剖得到的脑组织放入该溶液中，在25摄氏度下孵育2小时。固定和免疫染色后，去除PBST，向解剖得到的脑组织中加入EDU检测混合液。然后将样品置于中性摇床上，室温避光孵育。30分钟后，在避光条件下用PBST洗涤样品两次，每次10分钟。进行DNA染色时，配制5微克/毫升的Hoechst 33342溶液。第二次洗涤后移除 PBST，向解剖出的脑组织中加入 500 微升 Hoechst 溶液，然后在避光条件下孵育。10 分钟后，移除 Hoechst 溶液，并用 PBST 洗涤样品 10 分钟。轻敲离心管管壁，置于实验台面上，使脑组织沉降下来。移除管中的PBST，留下50至100微升。剪去200微升移液器吸头的尖端，用其将脑组织转移至洁净的玻璃载片上。用滤纸条轻压载片以吸除多余的PBST。切勿让滤纸接触脑组织。在脑组织上滴加一滴水溶性、非荧光的封片剂，调整脑组织方向，使腹神经索朝向载玻片，脑叶朝上。将脑组织排列成单列，以便于连续成像。轻轻将盖玻片置于脑组织上方，将载玻片在2至6摄氏度条件下孵育过夜。在采集软件中选择63倍物镜。在固定好的脑组织上方的盖玻片上滴加一滴浸油，以便通过目镜更易于定位组织。使用 DAPI Hoechst 33342 通道，通过目镜找到脑组织，然后切换到软件中的采集模式。设置 4 个通道以成像 Hoechst 33342、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 Alexa Fluor 647。使用染料辅助工具自动设置所选染料的激发激光器和发射滤光片。调整视野，使其涵盖整个脑叶。通过以0.8微米的间距采集图像，对脑叶的整个体积进行成像。将一次成像会话中的所有图像以.lif文件格式存储。进行图像分析时，打开 Fiji，然后将 LIF 文件拖放至 Fiji 中。在堆栈查看选项卡中选择数据浏览器，并在 Bio-Formats 插件的内存管理选项卡中使用虚拟堆栈。在 ImageJ 中观察显示的多通道图像。通过菜单栏中的图像、颜色和通道工具，更改各通道的颜色。观察标记有 Miranda 的神经母细胞，它们在大脑中央区域呈现为较大的圆形细胞。使用椭圆工具在每个神经母细胞上绘制感兴趣区域，以避免重复计数。从图像 J 菜单栏中选择分析、工具和 ROI 管理器。标记当前Z层面中的所有神经母细胞，并在标记每个细胞后按T键。当当前Z层面中的所有神经母细胞标记完成后，切换至pH3和EDU通道，手动统计EDU阳性神经母细胞、pH3阳性神经母细胞、同时为EDU和pH3阳性的神经母细胞，以及两种标记均不着色的神经母细胞数量。搜索神经母细胞及其后续Z层面，删除旧的感兴趣区域（ROI），添加新的ROI，以在不同图像堆栈中计数神经母细胞。准备一个电子表格，计算每个脑叶中四类神经母细胞所占的百分比。使用电子表格软件绘制柱状图，展示各分类中神经母细胞百分比的汇总数据。此处显示的是利用 Miranda、EDU 和 pH3 标记的三龄幼虫脑中央脑神经母细胞。细胞被划分为 G1/G0、S、SG2/M 和 M 期。在 EDU pH3 分析中，与野生型神经母细胞相比，MMS19 功能缺失的神经母细胞处于 M 期的比例显著升高。在 MMS19 功能缺失背景下表达 MMS19:eGFP 可使 M 期细胞的比例恢复至野生型水平。后续步骤中切勿使用受损的脑组织。ED溶液应在开始解剖前新鲜配制。该工具可用于快速初步筛选，以鉴定特定细胞周期阶段的缺陷。随后可对某一特定阶段进行更详细的分析。

5-ethynyl-2-deoxyuridinephospho-histone-h3-dual-labeling-protocol-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸-组蛋白H3双标记方案用于 果蝇 神经干细胞的细胞周期进展分析

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。...

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

活细胞周期分析方案 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪对组织进行分析的方法被描述。该方案可同时提供有关相对细胞大小、细胞数量、DNA含量以及通过谱系示踪或组织特异性荧光蛋白表达鉴定细胞类型的信息。 体内.

活细胞周期分析 果蝇 使用Attune声学聚焦流式细胞仪和Vybrant DyeCycle Violet DNA染料进行组织分析

在怀孕小鼠中给予两种胸苷类似物EdU和BrdU，可分析胚胎小鼠脑内神经细胞和前体细胞的细胞周期进程。该方法有助于确定基因毒性应激（包括电离辐射）对脑发育的影响。...

评估基因毒性应激后小鼠发育大脑中神经干细胞与前体细胞的细胞周期进程

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila...

超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

本方案描述了如何生成一个 果蝇 对驱动蛋白-5小分子抑制剂敏感的S2细胞系。还概述了这些细胞在基于细胞的错误校正检测中的应用。...

生成一个 &#34;人源化&#34; 果蝇 对Kinesin-5药物抑制敏感的S2细胞系

细胞表现出不同的形态，并与其邻近细胞建立多种相互作用。本方案描述了如何利用成熟的Gal4/UAS表达系统揭示单个细胞的形态，并研究细胞间的相互作用。...

多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

本方案旨在可视化Drosophila多线细胞中的异染色质聚集体。...

用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。...

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。...

延长活体成像果蝇雌性Drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

学习使用EdU和磷酸化组蛋白H3双标记技术对果蝇幼虫大脑神经干细胞进行细胞周期分析的方法。该方案可区分G1、S和M期细胞，有助于研究基因突变对细胞周期的影响。

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案果蝇神经干细胞

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