利用GCaMP3报告系统体外评估心脏重编程过程中的心肌特异性钙流
2022年2月22日
本文描述了一种Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J（下文简称αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠报告基因品系的建立及其在心脏重编程评估中的应用。从小鼠品系中分离得到的新生小鼠心肌成纤维细胞（NCFs）可被转化为诱导性心肌细胞（iCMs），从而可通过钙离子（Ca2+）流信号，便捷且高效地评估iCMs的重编程效率及功能成熟度。
本方案中描述的方法将为评估心肌重编程研究中心内细胞（ICMs）的功能成熟度提供一个有价值的平台。钙离子流仅在心内细胞中被观察到，因此可作为评估心内细胞功能成熟度的一种手段。该小鼠品系简化了评估流程，并提高了实验结果的可重复性。
本方案是评估心肌细胞重编程领域内心肌细胞（ICMs）功能成熟度的一种新方法。该方法也可用于评估心肌细胞分化及心脏功能。首先获取8至10只出生0至2天（P0至P2）的幼鼠，以分离1000万只新生心脏成纤维细胞（NCFs）。
通过低温使仔鼠深度麻醉。在荧光显微镜下观察心脏，确保具有目标基因型的心脏显示出钙离子流，表现为GCaMP3荧光且心脏仍在搏动。其他基因型的心脏不会显示荧光。
心脏分离后，将其切成四个松散相连的部分。在6厘米培养皿中，用预冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）反复彻底清洗数次，以减少分离细胞中的血细胞污染。用8毫升37摄氏度的温热0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化心脏组织10分钟。
弃去胰蛋白酶上清液，加入5毫升含有0.5毫克/毫升预热的II型胶原酶的Hank's平衡盐溶液。充分涡旋混匀，在37°C下孵育5分钟。孵育结束后，再次充分涡旋混匀，静置使未消化的组织通过重力沉降下来。
将上清液收集到含有5毫升冷的成纤维细胞培养基的15毫升锥形管中。用成纤维细胞培养基稀释细胞，使接种密度约为每立方厘米2×10⁴至2.5×10⁴个细胞。然后将细胞接种至培养皿或培养板中。
接种后第二天，贴壁的成纤维细胞应呈椭圆形至圆形。在第0天，将NCF以每立方厘米约1×10⁴至2×10⁴个细胞的密度接种于成纤维细胞培养基中。在第1天，根据需要将每孔的培养基更换为含病毒的培养基。
在第2天，即病毒感染后24小时，将含有病毒的培养基更换为常规ICM培养基。在室温下使用倒置荧光显微镜检测钙离子流。在10倍物镜下观察GCaMP3阳性细胞，确保明场通道中可见细胞自发搏动。
具有正确基因型的心脏表现出与搏动同步的钙离子流，表现为GCaMP3荧光。而在对照组心脏中未观察到荧光。分离的NCFs在2小时内贴壁，并在接种后一天呈现椭圆形至圆形。
钙离子振荡显示出GCaMP3荧光在最大值与最小值之间的变化，且此类细胞的钙离子振荡呈周期性改变。引入IMAP后，搏动细胞簇的数量显著高于对照组，因为在高倍视野下，IMAP培养基处理组中GCaMP3阳性且具有钙离子流的细胞数量增加。NCFs在分离后应保持新鲜且状态良好。
快速的心脏分离、切割以及适当的消化时间有助于避免细胞活力和状态的下降。该方法为心脏重编程研究人员提供了一种鉴定功能性成熟心肌细胞的途径。结合多种进一步的评估方法，可更全面地了解功能性成熟心肌细胞的特性。
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概述
本文介绍了一种用于评估心脏重编程的新型小鼠报告基因品系 αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3。该已建立的实验方案可通过钙流分析，对由新生小鼠心肌成纤维细胞（NCFs）诱导生成的诱导型心肌细胞（iCMs）进行评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏重编程
- 诱导性心肌细胞
- 钙流分析
背景
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠模型有助于心脏研究。
- 新生小鼠心脏成纤维细胞可被高效转化为诱导性心肌细胞（iCMs）。
- 钙离子流是评估iCM功能成熟的关键指标。
- 该方法提高了心脏重编程研究的可重复性。
研究目的
- 建立一个可靠的平台，用于评估诱导心肌细胞（iCM）功能成熟度。
- 简化心脏重编程研究中的评估流程。
- 为心肌细胞分化及心脏功能提供科学见解。
使用的方法
- 从出生0至2天（P0至P2）的新生小鼠中分离心脏成纤维细胞。
- 将新生心脏成纤维细胞转化为诱导性心肌细胞。
- 通过钙流测定评估功能成熟度。
- 评估重编程效率及心脏功能。
主要结果
- 成功将NCFs转化为功能性iCMs。
- 仅在iCMs中观察到的钙流表明细胞已成熟。
- 心脏重编程研究结果的可重复性显著提高。
- 该方案适用于心肌细胞分化的评估。
结论
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠模型是一种有价值的工具。
- 钙流分析可用于评估诱导心肌细胞成熟度。
- 该方法可推动心脏重编程与心脏功能相关研究的发展。
常见问题
行业重要性概要
评估诱导型心肌细胞的功能成熟度仍是再生治疗中心脏重编程领域的一个关键瓶颈。本方案提供了一种直接的、基于报告基因的钙流检测方法，可对诱导型心肌细胞（iCM）的功能成熟度进行客观评价，支持早期发现阶段的靶点验证和机制层面的风险排除。通过将转录重编程与功能性电生理输出相联系，该方法提高了临床前模型的预测可信度，并为心脏修复策略的研发管线决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将转录因子递送（MGT）与重编程细胞中的功能性钙瞬变读数相连接，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：利用GCaMP3荧光筛选成功重编程的诱导心肌细胞（iCMs），减少对基因表达等间接标志物的依赖。
- 预测价值：钙流作为功能性生物标志物，有助于在心脏重编程策略中进行生物学风险评估并增强靶点信心。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性： 建立标准化的基于荧光的平台，用于定量测定iCM成熟检测中的钙流，作为定量因变量。
- 可重复性： 报告基因小鼠品系确保在不同实验中对功能性iCM的检测具有一致性，支持检测的标准化。
- 可扩展性： 兼容荧光显微镜，并可适配高通量成像系统，用于筛选重编程效率。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：提供一种与疾病相关的体系，用于在体外评估iCM功能成熟度，从而连接发现阶段与临床前验证。
- 转化连续性：能够对iCM的成熟过程进行纵向评估，从早期重编程阶段直至具备功能性电生理能力。
- 机制性风险降低：钙流检测有助于区分结构上重编程的细胞与功能上成熟的iCM，减少假阳性结果。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物发现直至临床前评价的整个发现流程，特别能够在转录重编程后、体内验证前实现功能评估。
- 发现生物学：通过确定重编程因子是否不仅诱导标志物表达，还诱导功能性钙处理，支持假设验证。
- 筛选：提供即用型、可重复的生物系统，具有定量的钙流读数，可用于化合物或条件的比较。
- 分析：生成基于荧光的钙振荡频率和振幅的时间数据，实现对不同重编程条件的统计学比较。
- 转化研究：将体外重编程结果与临床前模型相关的心肌细胞功能表型相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的报告系统平台，适用于多种心脏重编程靶点和分化方案。
运营与企业影响
- 科学价值：提供对功能性成熟的直接测量，减少重编程结果中机制解释的模糊性。
- 操作价值：通过基因报告系统的特异性增强标准化与可重复性，降低基于抗体方法带来的变异性。
- 战略价值：通过将分子重编程与功能性电生理成熟度关联，改善决策过程中的“推进/终止”判断。
- 项目组合影响：根据功能性诱导心肌细胞产量及成熟质量，实现对重编程策略的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备小鼠繁育、心脏组织分离和荧光显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于获取αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系以及用于MGT的病毒递送系统。
- 需要标准化的培养条件和时间控制，以确保诱导型心肌细胞（iCM）诱导和钙流检测的一致性。
- 若改用其他成纤维细胞来源或不同物种，可能需要验证报告基因的特异性和钙信号的保真度。
- 实际限制包括依赖细胞自发性收缩来实现钙流可视化，以及转染效率可能存在变异。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
