Name: 跟踪开放全球伤害和治疗性能的前段器官文化平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解前段器官培养平台用于评估开放性眼球损伤并测试稳定损伤的治疗药物。该方法可在无需动物实验的情况下追踪损伤进展超过三天，为眼科研究提供可靠的体外模型。

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本材料基于美国国防部通过机构间协议（#19-1006-IM）与临时角膜修复采购项目（美国陆军医疗物资开发局）合作支持的工作。

在执行本方案之前，需注意有关在科研与培训中使用动物的法律和伦理要求。若使用活体动物获取眼组织，必须在开始前获得当地伦理或法律监管机构（如实验动物管理与使用委员会（IACUC）或伦理委员会等）的批准。若在获取动物使用许可方面存在任何疑问，不得继续进行。我们此前已确定并报道，死亡后24小时内获取并使用的新鲜猪眼在生理状态上最接近活体（in vivo）条件，适用于此类研究（Animal Technologies，Tyler，TX，USA）10,13。本方案全程未使用活体动物，所有组织均通过组织供应商在动物死亡后24小时内获取。
注意：在组织到达之前，制备好器官培养皿（补充方案 1）、夹紧环（补充方案 1）、培养皿支架（补充方案 1）、压力传感器数据采集装置（补充方案 2）以及气动穿刺平台（补充方案 3）。对培养皿、工具和耗材进行灭菌，并准备操作区域。建议设置一个非无菌区域用于眼球的大体解剖，因为眼球通常带有附着的结缔组织和眶周组织。这些初步步骤应在开放的洁净工作台面上进行，随后将眼球无菌转移至生物安全柜 II 级（BSC II）中进行显微解剖（1 号柜）。理想情况下，用于显微解剖的 BSC II 柜应与用于培养皿组装的 BSC II 柜（2 号柜）分开，以减少气流干扰并最大化工作空间。在显微解剖柜内配备解剖显微镜，并配置可视化工作面的设备（如从柜体伸出的摄像头或目镜）。
1. 灭菌步骤、耗材（详见材料表）及准备工作
<ol>
	<li>准备&#160;并进行气体灭菌以下物品（每只眼睛一套）：ASOC培养皿、夹紧环、两个带O形圈的流体连接器、两个18 G针座、四颗螺丝、两段PE-100管（长度应足以从培养箱内的培养皿延伸至注射泵和压力传感器数据采集系统）、两个18 G 90°弯针座、两个三通阀。</li>
	<li>准备并进行高压灭菌以下套件：
	<ol>
		<li>准备并高压灭菌显微解剖器械套件，包含精细镊子一对、Vannas剪刀一对、中号有齿镊子一对、大号剪刀一对、棉签、刀片或手术刀片。</li>
		<li>准备并高压灭菌组装器械套件，包含中号有齿镊子一对、手术剪刀一对和L型扳手一个。</li>
		<li>准备并高压灭菌每日使用套件（数量：每天培养使用一套），包含一个L型扳手，用于每天根据需要将夹紧环紧固到培养皿上。</li>
		<li>高压灭菌四个100 mL烧杯，用于消毒和储存眼球及眼前段组织。</li>
		<li>高压灭菌穿刺用物体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集以下无菌物品：培养皿（每只眼睛1个）、纱布（每只眼睛1-2块）、培养皿架、20 mL注射器（每只眼睛1个）、10 mL注射器（每只眼睛1个）、尼龙注射器滤器（每只眼睛1个）。</li>
	<li>准备无菌培养基：含4% FBS、1× Glutamax、1×庆大霉素、1×抗生素-抗真菌剂（AA）的DMEM培养基（每只眼睛约需30-40 mL完全培养基）。</li>
	<li>准备含AA的PBS：含1×抗生素-抗真菌剂的PBS（约500 mL）。</li>
	<li>准备粗解剖工具包：清洁并干燥的大号手术剪刀和镊子。</li>
	<li>设置非无菌解剖工作区：取用粗解剖工具包中的器械、置于PBS中并冰上保存的去眼球猪眼、手术单、盛有PBS的100 mL烧杯。铺好手术单，并摆放粗解剖所需物品。</li>
	<li>设置无菌解剖工作区：取用显微解剖器械套件、无菌纱布、解剖显微镜、聚维酮碘溶液、无菌PBS、无菌培养基、四个已灭菌的100 mL烧杯、无菌培养皿。将上述物品无菌转移至II级生物安全柜#1中。在解剖显微镜下设置好用于观察眼球的工作区域。</li>
	<li>设置ASOC组装工作区：取用已气体灭菌的套件（培养皿套件和盖子套件）、组装器械套件、无菌培养基、培养皿架、无菌培养皿、无菌注射器和注射器滤器。将上述物品无菌转移至II级生物安全柜#2中。设置好用于培养皿组装的工作区域。</li>
	<li>当眼球稳定并准备进行穿刺（建立系统后72小时），将其无菌转移至II级生物安全柜中。设置OG损伤诱导工作区：气动驱动的损伤诱导装置（组装细节见补充材料3）、升降平台（Lab Jack）和交叉固定虎钳，用于固定ASOC培养皿。</li>
</ol>
2. 组织解剖
<ol>
	<li>使用非无菌解剖工作区准备猪组织。
	<ol>
		<li>从当地屠宰场、动物实验或供应商处获取摘除的猪眼。运输过程中将眼睛置于冰上，并浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）中，收到后立即使用。</li>
		<li>剪除眶周组织并修剪结膜，仅保留角巩膜壳和视神经。使用大号手术剪刀和镊子，在非无菌条件下进行大体解剖操作。</li>
		<li>将眼睛放回盛有新鲜PBS并置于冰上的容器中，直至所有实验所需眼睛完成初步/大体解剖。</li>
		<li>将眼睛置于密闭容器中，浸入10%聚维酮碘溶液2分钟，随后无菌转移至II级生物安全柜#1。后续所有操作均需在无菌条件下进行，以尽量减少实验设置过程中的污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无菌条件下解剖前段结构。
	<ol>
		<li>经聚维酮碘溶液处理2分钟后，将眼睛依次转移至三份连续的无菌含抗生素PBS（AA-PBS）中清洗，以去除眼表残留的聚维酮碘，同时保持眼组织的无菌状态。完成三次清洗后，将组织保存于AA-PBS中待用。</li>
		<li>使用刀片/手术刀和弯头剪刀将眼球半切。将眼球置于经AA-PBS浸湿的纱布上，用无菌刀片或手术刀在眼球赤道附近（前段占40%，后段占60%）做初始切口。随后使用弯头手术剪沿切口完整半切眼球，分离出前段（角膜部分）。 
		注：围绕前段的切口必须连续完整，避免巩膜边缘出现锯齿状或粗糙切口，否则在器官培养装置建立后可能导致液体泄漏。</li>
		<li>使用显微剪刀作为铲具，将前段中的玻璃体清除。用显微剪刀将晶状体从前段中取出。将前段结构保留在AA-PBS中，待后续解剖步骤使用。 
		注：所有待解剖的眼球均可在此步骤暂存，并逐一完成后续解剖流程。</li>
		<li>在解剖显微镜下，从虹膜边缘逐步向虹膜根部做放射状剪切，直至暴露小梁网（TM）。小梁网为色素组织，其纤维呈环状排列于角巩膜壳周围。小心地向虹膜根部剪切可暴露位于组织下方的小梁网深层结构。</li>
		<li>在与初始切口相同深度处，围绕虹膜做360°环形剪切，以完全暴露整个小梁网区域。根据需要清除覆盖在小梁网上的任何残留虹膜组织。</li>
		<li>修剪小梁网后方的睫状体残余部分，仅保留小梁网区域后方约1 mm宽的薄层组织。</li>
		<li>将已完成解剖的前段（AS）置于培养基中，待后续在II级生物安全柜#2中进行前段器官培养（ASOC）装置的建立。 
		注：若由单人完成解剖及器官培养皿组装，所有眼球均可在此阶段暂存，直至开始ASOC设置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在器官培养皿中设置前房段
<ol>
	<li>将一个角膜巩膜（AS）置于培养皿中，使AS倒置（杯口向上）。使用棉签蘸取培养基，轻轻擦拭角膜中央区域，以去除任何色素。用镊子夹住眼球，并用同一棉签在巩膜周围擦拭，清除多余的色素。</li>
	<li>将AS翻转并放置在培养皿底部的凸起区域上方，使角膜正对培养皿中的凸起部分。将夹紧环放置在新放置的AS上方。</li>
	<li>将四个螺丝插入对应的孔中，以固定夹紧环并将AS压紧在环下。使用L型扳手轻轻手动拧紧螺丝。 
	注意：在实验期间每天都会进行拧紧操作，因此初始拧紧的目标是确保培养基不泄漏，同时避免损坏夹紧环。</li>
	<li>使用无菌的培养皿组件，将上盖盖在培养皿上并整体翻转。安装培养皿支架。将带有O型圈的流体连接器连接到底部培养皿的螺纹接口上。</li>
	<li>在第一个流体连接器上，连接一个18 G 90°弯头针座、一段管路、一个18 G针座、一个尼龙注射过滤器、一个三通阀，以及一支装有培养基的20 mL注射器。</li>
	<li>在第二个流体连接器上，连接一个18 G 90°弯头针座、一段管路、一个18 G针座、一个三通阀，以及一支无菌10 mL注射器的筒身部分（该部分将作为储液器，用于收集来自ASOC的液体和气泡）。</li>
	<li>将两个三通阀适当打开至注射器方向，通过步骤3.5中标识的流体连接端口，缓慢推动培养基使系统流通，从而充盈AS、填充管路，并最终流入储液器。 
	注意：如果培养基渗入ASOC培养皿中，说明AS与夹紧环之间的密封不够紧密。</li>
	<li>通过缓慢推动培养基进入培养皿并翻转装置，将气泡排出至储液器，从而去除系统中的气泡。</li>
	<li>将培养皿和支架竖直放置。在支架底部下方放置一个培养皿的底座部分，注意不要缠绕管路。</li>
</ol>
4. 开始眼前段器官培养
<ol>
	<li>ASOC 现已准备就绪，可进行孵育。将 ASOC 培养皿放入细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中。确保已知并记录 ASOC 培养皿在培养箱内相对于压力传感器的高度，以便准确计算眼内压（补充方案 4）。</li>
	<li>将管路从 37 °C、5% CO2 培养箱门底部引出，以避免妨碍箱门的正常开关。将 20 mL 注射器连接至设定流速为 2.5 µL/min 的注射泵。</li>
	<li>将带有储液器的管路置于压力传感器仪器端。在向管路中持续灌注 PBS 的同时，将侧边三通阀连接至压力传感器装置，以防止气泡进入管路。 
	注意：系统设置完成后，应将储液器中的 PBS 排空，以减少器官培养期间因微生物生长导致储液器污染的可能性。</li>
	<li>开始采集眼内压数据前，首先确认已插入 microSD 卡用于保存数据文件，然后开启压力传感器装置以开始数据采集。 
	&#8203;注意：压力传感器数据采集设备的设置详情见 补充方案 2。</li>
</ol>
5. ASOC的日常维护
<ol>
	<li>在ASOC平衡24小时后，将其从37 °C、5% CO2的培养箱中取出，并放入II级生物安全柜中。 
	注意：在压力数据采集过程中，由于ASOC从培养箱中取出（高度变化）并在柜内进行调整，这些时间段在数据上会表现为尖峰。</li>
	<li>检查培养皿下方每个孔位是否存在泄漏。若发现泄漏，需检查培养皿下方的流体连接是否紧密，必要时重新拧紧。使用无菌L型扳手拧紧夹紧环上的螺丝，以检查培养皿上盖是否存在泄漏。 
	注意：AS巩膜组织在24小时内会因压缩而厚度减小，因此需要重新拧紧夹紧环。</li>
	<li>吸除培养皿孔中的培养基。 
	注意：小梁网正在过滤从泵入ASOC的培养基中渗出的液体，因此在ASOC培养皿边缘区域会有培养基存在。</li>
	<li>重复步骤3.7和3.8，以排除任何滞留的气泡。</li>
	<li>重新填充注射泵上的注射器，确保注射泵正常运行，并确认阀门位置正确，以保证向ASOC持续灌注。随后将ASOC培养皿放回37 °C、5% CO2 的培养箱中。 
	&#8203;注意：理想情况下，这些步骤应每天执行一次。然而，若起始培养基体积为20 mL，结合ASOC培养皿孔的容积以及2.5 µL/min的泵速，系统通常可连续运行数天而无需干预。</li>
</ol>
6. 使用气动穿刺装置诱导 OG 损伤
注意：气动穿刺装置的构建详见补充方案 3。在眼内压（IOP）稳定后诱导视网膜神经节细胞（OG）损伤，通常在培养3天后达到稳定。根据生理眼内压，可接受的眼内压值为5-20 mmHg，可通过分析眼内压数据文件或按照补充方案 2中所述设置压力测量系统中的LED指示灯来确定。
<ol>
	<li>按照步骤1.10所述准备BSC II级生物安全柜以进行OG损伤诱导。将穿刺平台连接至压缩空气管线。将无菌穿刺物固定在卡盘上。 
	注意：可使用空气压缩机为装置供能，但若压力高于50 psi，压缩气罐或实验室内置气源管线亦可满足要求。</li>
	<li>将穿刺平台上的压力调节器设定为50 psi，以确保对直径不超过4.5 mm的物体产生足够的穿刺力。将十字移动虎钳置于穿刺平台前方的实验升降台上，用于在损伤诱导过程中固定ASOC培养皿。</li>
	<li>从37 °C、5% CO2培养箱中取出ASOC装置，在移除皿盖并妥善放置后，将其垂直放入十字移动虎钳中（图2）。保持前房灌注状态，但关闭通向压力传感器的三通阀端口，以防止传感器因过压而受损。</li>
	<li>将活塞臂伸展至最大距离，并将角膜顶点置于距离穿刺物1 mm范围内。随后回缩活塞臂，并将前房组织整体向穿刺物方向推进1 cm。 
	注意：该距离已优化，可在高效诱导损伤的同时避免触碰ASOC培养皿。</li>
	<li>通过开启设备并使用装置上的第二个开关打开电磁阀来触发穿刺装置。完成穿刺后，再次按下第二个开关以将穿刺装置从眼球上撤回。通过肉眼观察及检查损伤部位是否有培养基渗漏，确认损伤是否成功诱导。</li>
	<li>从虎钳中取出ASOC培养皿；将皿盖重新盖回装置上，并打开通向压力传感器的流体管路。将ASOC装置放回37 °C、5% CO2培养箱中。 
	&#8203;注意：此时可在前房中施加治疗性物质，以评估其对封闭OG损伤的效果。</li>
</ol>
7. 从培养物中去除ASOC
注意：根据终点分析方法的不同（参见代表性结果中可能的终点检测方法），气道上皮细胞（AS）可能需要保持在气液界面培养皿中膨胀状态，而其他方法则需要将AS组织从培养腔室中分离。以下方法描述了如何将AS从器官培养皿中取出，并移除其余装置。
<ol>
	<li>从37 °C、5% CO2 培养箱中取出ASOC培养皿。关闭三通阀与注射器及储液器之间的连接，并将管路从系统上断开。丢弃注射器、储液器和滤器。将三通阀、管路和针头接头放入单独的容器中，以备清洗和灭菌。</li>
	<li>将针头接头从培养皿底部的流体连接处断开。卸下流体连接器和O型密封圈。将所有部件放入清洗和灭菌用的容器中。</li>
	<li>使用L型钥匙卸下夹紧环上的四个螺钉。小心取下夹紧环。</li>
	<li>使用镊子将AS从培养皿中取出，根据终点分析和成像需求，将其置于固定液中或适当的生物危害废物容器中。</li>
</ol>
8. 眼内压数据的分析
<ol>
	<li>将 microSD 卡连接至计算机，删除包含最近一次实验运行数据的 .txt 文件。 
	注意：该文件名称由控制微控制器的代码设定，每次实验均应更新（参见 补充方案 2）。</li>
	<li>将数据导入电子表格。</li>
	<li>将数据整理为 12 列：时间（单位为 min）以及 11 个压力传感器通道各自的 mV 信号。前十个通道对应十个 ASOC 实验装置。最后一个传感器信号为暴露于空气中的对照通道，用于确认 mV 信号未因输入信号变化而改变。绘制对照通道随时间变化的曲线，以确认 mV 信号在整个实验过程中保持稳定。</li>
	<li>利用各传感器初始校准所得的斜率-截距方程，将十个通道的 mV 信号转换为 mmHg（参见 补充方案 4）。</li>
	<li>绘制时间（转换为天数以简化数据分析）与十个通道中每个通道的关系图，以确定眼内压（IOP）在实验时间过程中的波动情况。</li>
	<li>确定数据中关键时间点的平均 IOP 值，以便更直观地比较各组之间的数值差异及其在诱导青光眼（OG）损伤前后的变化。在每个 24 小时区间内，取 2–3 小时的数据进行平均，以确定 ASOC 实验每一天的 IOP 值。 
	注意：代表性 IOP 结果见 图 4。</li>
</ol>

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作者声明不存在利益冲突。本文所表达的观点仅为作者的观点，不代表美国陆军军医部、陆军部、国防部或美国政府的官方政策或立场。

在使用ASOC OG损伤平台时，有几个关键步骤需要特别强调，以提高采用该方法时的成功率。首先，在前房解剖过程中，保留小梁网至关重要，但正确操作具有挑战性。如果小梁网遭到破坏，眼球将无法维持生理眼压，因而不符合实验使用标准。建议先在常规条件下练习解剖过程，待掌握正确的解剖技术后再引入额外的无菌操作要求。其次，在将眼球安置于ASOC培养皿中时，必须确保固定程度适中：既要足够紧密以防止液体泄漏，又要避免过紧而损坏ASOC培养皿。若眼球固定不牢，液体会通过非生理途径渗出，导致眼内压（IOP）极低甚至无法检测。然而，用于固定眼球的夹紧环为塑料材质，若过度拧紧则容易断裂。必须在两天内持续夹紧眼球，因为位于夹紧环下方的巩膜组织会在最初的24小时内发生压缩，导致组织松弛。建议在第1天拧紧夹环至感受到阻力为止，并在培养24小时后再次重新拧紧至相似程度，以获得最佳实验效果。
第三，在使用该模型时，必须充分了解流体流动在任何时候的流向。每个ASOC培养皿都连接了多个三通阀，用于引导来自注射泵或10 mL注射器储液器的液体流动，并连接至压力传感器。在不同的实验设置阶段，需要将阀门置于特定位置，以排出眼内气...

开放性眼球（OG）损伤若在受伤后未得到及时治疗或至少稳定处理，可能导致永久性视力丧失1。然而，在偏远地区，例如农村地区或军事作战场景的战场，由于难以及时获得眼科干预，延误治疗的情况十分普遍。当无法立即进行治疗时，目前的标准处理方法是使用硬质眼罩保护受伤眼，直至可实施医疗干预。在军事医学中，目前的延误时间最长可达24小时，但预计在未来城市环境的作战行动中，由于无法实施空中后送，这一时间可能延长至72小时2,3,4。在眼科干预资源有限的偏远农村等民用场景中，延误时间可能更长5,6。未治疗的OG损伤因眼球的密水结构遭到破坏，极易发生感染和眼内压（IOP）丧失7,8。若伤后至治疗之间的延迟时间过长，IOP的丧失将影响眼内组织的存活能力，使任何医疗干预都难以恢复视力9。
为了推动开发易于应用的治疗手段，以在患者获得眼科专家救治前临时封闭眼球破裂伤（OG）创口，此前已建立了一种台式眼球破裂伤模型10,11。利用该模型，可在眼内压（IOP）通过压力传感器实时监测的同时，在完整的猪眼球上模拟高速损伤。随后可应用治疗手段，评估其封闭眼球破裂伤创口的能力12。然而，由于该模型使用完整的猪眼球，仅能评估治疗手段的即刻效果，无法追踪治疗手段在患者抵达专科医疗前长达72小时内的长期效能，而在此期间治疗手段必须维持创口的稳定。因此，本方案中建立并详细描述了一种前段眼组织器官培养（ASOC）眼球破裂伤模型，作为评估治疗手段长期效能的实验平台13。
ASOC 是一种广泛使用的技术，可用于在眼球摘除后维持前房无血管组织（如角膜）长达数周14,15,16,17。在 ASOC 建立过程中，通过以生理流速灌注液体并保护调节眼内压（IOP）的组织——小梁网流出道区域，使前房维持在生理 IOP 条件下18,19。ASOC 平台能够生理条件下维持组织、利用气动驱动装置诱导眼压升高（OG）损伤、施加治疗干预，并在损伤后至少 72 小时内持续监测损伤的稳定情况13。
本文提供的方案详细阐述了如何逐步使用ASOC平台。首先，介绍了ASOC平台的搭建与制备方法；接着，详细说明了如何无菌分离眼前段组织并保留小梁网，随后将眼前段组织安置于定制的器官培养皿中进行培养。然后，描述了如何制造开放性眼球损伤，并在损伤后立即应用治疗干预措施。最后，本方案概述了可用于该方法的表征参数，这些参数可评估眼球的功能性、机械性和生物学特性，以及损伤稳定效果。总体而言，该模型为加速开发用于稳定和治疗开放性眼球损伤的产品提供了迫切需要的平台，有助于改善伤后视力预后不良的现状。

<table><tbody><tr><td>10-32 聚碳酸酯直插头，外螺纹管接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K431</td><td></td></tr><tr><td>10-32 沉头内六角螺钉，&amp;frac12;&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>92196A269</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>球头L型内六角扳手</td><td>McMaster-Carr</td><td>5020A25</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Intramedic&amp;nbsp;PE 160 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-12E</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>高温硅胶O型圈，宽2 mm，内径4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233T47</td><td></td></tr><tr><td>大型镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365</td><td></td></tr><tr><td>大型手术剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>中号带齿镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501217</td><td></td></tr><tr><td>钉子（穿刺物）</td><td>McMaster-Carr</td><td>97808A503</td><td></td></tr><tr><td>尼龙注射器滤器</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 mm）</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯三通旋塞阀，带公&amp;nbsp;鲁尔&amp;nbsp;锁</td><td>Fisher</td><td>NC9593742</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢18 G&amp;nbsp;90度&amp;nbsp;角分配针头</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A81</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢18 G 直型 &amp;frac12;&#039;&amp;rsquo; 分配针头</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A675</td><td></td></tr><tr><td>带盖无菌100 mL 烧杯</td><td>VWR</td><td>15704-092</td><td></td></tr><tr><td>Vannas&amp;nbsp;剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP5070</td><td></td></tr></tbody></table>

用于追踪开放性眼球损伤及治疗效果的前房段器官培养平台

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

眼球开放性损伤的视力预后较差，常导致永久性视力丧失。部分原因在于，在眼科医疗资源不易获得的农村环境和军事医学应用中，受伤与医疗干预之间存在较长时间的延误。当眼球失去其防水密封性后，未治疗的损伤容易发生感染，同时由于眼内低压导致组织活力丧失。如果能够合理开发出用于暂时封闭眼球开放性损伤的治疗手段，则有可能恢复眼内压并防止感染，直至获得适当的眼科治疗。为促进产品开发，本文详细介绍了使用前房器官培养开放性眼球损伤平台，以追踪损伤后至少72小时内的治疗效果。猪眼前段组织可在定制设计的器官培养皿中维持，并保持在生理眼内压水平。可通过气动系统制造穿通伤，该系统可产生直径最大达4.5 mm的损伤，与军事相关损伤尺寸相似。损伤后可连续观察72小时的眼内压下降情况，以确认损伤成功诱导及眼球防水屏障的丧失。在造成损伤后将治疗物施加于眼球表面，随后连续数天监测眼内压，即可评估其治疗效果。此外，眼前段损伤模型适用于多种广泛使用的方法，用于功能性及生物学层面监测眼前段生理状态，例如评估透明度、眼球力学性能、角膜上皮健康状况以及组织活力。总体而言，本文所述方法是迈向开发用于暂时封闭眼球开放性损伤的生物材料治疗手段的必要下一步，特别是在眼科医疗资源不易获得的情况下。

通过光学相干断层扫描（OCT）捕获的图像展示了视神经夹伤（OG）损伤眼的典型表现，以说明成功诱导损伤的形态特征。图3展示了对照组和OG损伤眼前段组织在损伤后即刻以及72小时后的图像。图像包含两种视图：穿过损伤部位的横截面图像，以及用于显示图像表面区域的最大强度投影（MIPs）俯视图。对照组眼睛的角膜未见明显结构紊乱，而OG损伤后可清晰观察到贯穿整个角膜的损伤区域。从MIPs图像可见，损伤区域的形状和大小不规则，但损伤范围在72小时内有所缩小。此前研究表明，该变化在多种测试的损伤尺寸中均具有显著性13。
本方案所述 OG 损伤模型的主要数据输出为实验过程中眼内压的变化。数据以毫伏为单位记录，来源于各压力传感器的输出，可通过校准转换为 mmHg（补充方案 4）。文中提供了符合使用标准和不符合使用标准的眼内压随实验时间变化的示例数据（图 4A）。根据压力轨迹数据，眼睛在培养 24 小时后连...

在农村或与军事相关的场景中，眼球开放性损伤可能数天内得不到治疗，从而导致失明。因此需要有效的治疗手段以最大限度减少视力丧失。本文详细介绍了一种眼球开放性损伤的器官培养模型。利用该模型，可对潜在的治疗药物在稳定此类损伤方面的效果进行科学评估。

眼球开放性损伤的视力预后较差，常导致永久性视力丧失。部分原因在于损伤与治疗之间存在较长时间的延迟。

开放性眼球损伤若不及时治疗，可能导致永久性视力丧失。该眼前段器官培养模型可在无需动物实验的情况下评估此类损伤。本方案利用器官培养平台，可对开放性眼球损伤及其治疗进行为期三天或更长时间的动态监测。本实验操作将由博伊斯实验室的研究技术员 Trent Pearson 演示。首先，铺好手术巾，并准备好进行大体解剖所需的器械。在生物安全柜中设置好体视显微镜，用于观察眼球。准备生物安全柜以进行培养皿组装。在生物安全柜内设置开放性眼球损伤诱导工作区。将十字移动台固定在实验升降台上，置于穿刺平台前方。去除多余的眼眶组织并用含抗生素和抗真菌剂的 PBS 冲洗眼睛后，将眼睛置于浸有含抗生素和抗真菌剂 PBS 的纱布上以进行半切。使用无菌剃刀刀片或手术刀在眼球赤道附近做一切口，然后用弯头手术剪沿切口将眼球半切，分离出眼前段。使用显微剪刀作为铲子，从眼前段舀取玻璃体，并用显微剪刀将晶状体从眼前段移除。从虹膜边缘开始，沿径向逐步剪切至虹膜根部，直至暴露小梁网。围绕虹膜进行360度剪切，以充分暴露整个小梁网区域，并根据需要清除覆盖在小梁网上的任何残留虹膜组织。修剪小梁网区域后方的睫状体残余组织，仅保留一毫米宽的薄层组织。将眼前段放置于培养皿中后，将棉签蘸取培养基，轻轻擦拭角膜中央，以去除任何色素。用镊子夹住眼球，通过擦拭去除巩膜周围的多余色素。将倒置的前段结构置于底部培养皿的凸起区域上，确保角膜位于凸起区域的中心。将夹紧环放置在新放置的前段结构上方，并使用L型扳手轻轻拧紧螺丝。将两个带O型圈的流体连接器安装到培养皿底部的螺纹接口上。在第一个流体连接器上依次连接18号90度弯角针座、一段管路、一个18号针座、尼龙注射式滤器、三通阀以及一支装有培养基的20毫升注射器。在第二个流体连接器上依次连接18号90度弯角针座、一段管路、一个18号针座、三通阀（连接方式与第一个流体连接器相同），然后连接一支无菌10毫升注射器的筒身部分，用作收集液体和气泡的储液装置。保持三通阀适当地与注射器连通，通过第一个流体连接口轻轻推动培养基流经系统。为膨胀前段，先用培养基填充管路，最终填满储液器。通过轻轻将培养基推入培养皿并倒置培养皿，以排出气泡。将前房段器官培养皿放入细胞培养箱中。将管路从培养箱门底部引出，以避免妨碍箱门的开关。将管路连同储液器一并置于压力传感器仪器上。在 PBS 流经管路的同时，将侧向三通阀连接到压力传感器装置上，以避免气泡进入管路系统。在准备好的用于开放性损伤诱导的生物安全柜内，将穿刺平台上的压力调节器设定为每平方英寸 50 磅力，以对直径最大为 4.5 毫米的物体产生足够的穿刺力。将横向定位虎钳放置在穿刺平台前方的实验台升降架上。将活塞杆伸展至最大距离，并将角膜顶点置于穿刺物体的1毫米区域内，然后回缩活塞杆，使眼前段向穿刺物体靠近1厘米。要触发穿刺装置，请打开设备电源，并使用设备上的第二个开关打开电磁阀。穿刺完成后，按第二次开关将装置从眼球回撤，通过肉眼观察并检查损伤部位是否有介质渗出，以确认损伤是否成功诱导。术后通过光学相干断层扫描成像评估角膜上皮完整性。在损伤后立即及损伤后72小时对受损的眼前段组织进行成像。对照眼显示角膜无明显结构破坏，而损伤后角膜可见明确的损伤区域。从顶部最大强度投影可以看出，损伤的形状和大小不规则，但在72小时内损伤面积逐渐减小。术前连续三天观察眼内压，以确定其是否稳定在可接受范围内。在代表性结果中，五只眼中有三只的眼内压处于可接受范围内。由于眼球开放性损伤及治疗干预，眼内压发生变化。在诱导眼球开放性损伤后，眼内压显著下降，并在整个实验过程中持续保持在较低水平。使用Dermabond粘合剂治疗损伤组织后，眼内压较未治疗组织有所升高，表明该方法可用于评估治疗手段在恢复眼内压方面的有效性。器官培养中该组织段的初始安装对于组织的长期稳定性至关重要。过度拧紧环状固定器会对组织造成应力，并降低其顺应性。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

跟踪开放全球伤害和治疗性能的前段器官文化平台

本文介绍了一种简化技术，用于从人尸体供体的眼球中切除角膜和摘除视网膜组织。此处描述的技术有助于获取高质量的组织，用于移植、手术或研究目的，同时避免损伤眼球的其他组织。...

一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

在本视频中，我们演示了猪眼球前段（含角膜）的解剖分离。分离得到的组织段可用于器官培养，以研究眼部疾病的病理生理学机制。...

眼前段解剖：一种从猪眼分离带角膜的前段组织的方法

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眼前段培养：一种用于培养猪眼带角膜眼前段的方法

本文描述了一种用于角膜伤口愈合研究的离体角膜器官培养模型的实验方案。该模型系统可用于评估药物在有序的三维多细胞环境中促进再生性愈合或产生药物毒性的效应。...

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将增强现实技术应用于股骨头坏死的髓芯减压术，以实现该手术过程的实时可视化。该方法可有效提高髓芯减压术的安全性和精确性。...

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