从人类胚胎干细胞中引导肝细胞样细胞诱导的有效方法

本手稿描述了人类胚胎干细胞（hESC）分化成功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细协议，在hESC分化过程中连续补充Activin A和CHIR99021，以最终内分泌体（DE）。

人类胚胎干细胞衍生的肝细胞样细胞在疾病建模和药物筛选中很有用。这是有效诱导人类胚胎干细胞分化成功能性肝细胞样细胞的有效可重复方法。人类胚胎干细胞的无差别状态和适当汇合对于成功分化肝细胞细胞至关重要。

为了维持干细胞，涂层无菌的六井组织培养处理板与1毫升1倍的人类胚胎干细胞合格Matrigel每口井，并储存在4摄氏度过夜。在使用前将盘子放在室温下30分钟。在37摄氏度的水浴中解冻冷冻保存的 HESEs 三分钟而不摇晃，然后立即将干细胞输送到含有 4 毫升预热、37 摄氏度 MTESR 介质的 15 毫升离心管中。

离心液和吸气超自然，然后轻轻地重新悬浮细胞在一毫升的MTESR介质。从盘子中吸气 DMEM F-12 介质。将细胞播种到六井板中，密度为1×10至5个细胞，在两毫升的MTESR中孵化，并在5%的二氧化碳孵化器中孵化。

通过每天用预热的 mTESR 介质替换介质来维护细胞。在大约70%到80%的汇合中，或者当细胞群落开始接触时，通过细胞。对于通过的细胞，吸气介质，并在37摄氏度下用每口酶溶液一毫升孵育细胞5分钟。

将细胞通过管道输送到15毫升离心管中，管内含有4毫升DMEM F-12预热至37摄氏度。准备24井板涂上250微升的1X hESC合格的矩阵介质。种子 hESCs 的密度为 mTESR 介质的 500 微升，每口井的密度为 1 到 1.5 倍 10 至第 5 个细胞。

将 Activin A 添加到每毫升 100 纳米的最终浓度和 CHIR99021 的最终浓度中，在适当量的预热阶段一分化基本介质中加入三微摩尔。经过三天的分化，分化细胞应表示最终内皮细胞的标记，如FOXA2、SOX17、GATA4、CXCR4和FOXA1。在分化的第三天，吸气介质，替换为第二阶段介质，孵育24小时。

在第四天到第八天每隔一天更换一次介质。经过八天的分化，分化细胞应表示肝祖细胞的适当标记，如HNF4α、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA。在第八天，从细胞中吸气第二阶段介质，代之以第三阶段介质。

允许细胞在37摄氏度的二氧化碳孵化器中孵化10天，每隔一天用新添加的分化因子改变介质。经过18天的分化，分化细胞应表示肝细胞的特征标记，如AAT、ALB、TTR、HNF4阿尔法、NTCP、ASGR1、CYP3A4。显示了 hESC 中肝细胞状细胞的示意图图和每个分化阶段的明亮场图像。

在第一阶段，ACTIVIN A和CHIR99021被添加三天，以诱导干细胞形成内皮细胞。在第二阶段，内皮细胞在用分化介质治疗五天后分化成肝祖细胞。在第三阶段，10天后，早期肝细胞已经成熟并分化成肝细胞状细胞中的肝细胞生长因子和雄激素。

在分化的最后阶段，细胞表现出典型的肝细胞表型。RT-PCR、免疫荧光染色和西性染色用于检测内皮细胞、肝前体细胞和成熟肝细胞的标记物。分化细胞在每个阶段都显示出高表达水平的分化相关基因和蛋白质，如第三天SOS17的内皮标记、第8天的肝前体标记HNF4阿尔法、第14天的法新社和第18天的成熟肝细胞标记ALB。

HLC 表现出绿色染色和广泛的细胞质酸转移染色。肝细胞表现出典型的双核形态。CYP3A4的酶活性，即HLC肝脏中必需的代谢CYP，通过酶检测得到证实。

将人类胚胎干细胞定位在适当的密度下，并在下一天开始分化至关重要。在第一阶段，轻轻触摸介质，因为细胞容易浮起来。Activin A和其他小分子的结合可以进一步提高分化效率，并在此过程中产生更成熟的肝细胞状细胞。

该技术可为探索肝细胞移植、肝组织工程、生物人工肝和疾病建模提供平台。