Name: 从人类胚胎干细胞中引导肝细胞样细胞诱导的有效方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 了解利用Activin A和CHIR99021将人胚胎干细胞高效诱导分化为功能性肝细胞样细胞的方法。该方案强调维持干细胞未分化状态和适当汇合度的重要性，可用于疾病建模和药物筛选研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到国家自然科学基金（项目编号：81870432 和 81570567，授予 X.L.Z.；项目编号：81571994，授予 P.N.S.）；中国广东省自然科学基金（项目编号：2020A1515010054，授予 P.N.S.）；李嘉诚汕头大学基金会（项目编号：L1111 2008，授予 P.N.S.）的资助。我们谨向汕头大学医学院林 Stanley 教授致以诚挚感谢，感谢其提供的有益建议。

1. 干细胞维持
注意：以下所述的细胞维持方案适用于以贴壁单层培养的 hES03 细胞系。本论文中所有后续方案的操作均应在生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>通过将5倍浓缩的补充培养基稀释至mTesR基础培养基中，制备1倍mTesR干细胞培养基。</li>
	<li>在冰上将5 mL hESC级Matrigel与5 mL DMEM/F12混合，制备30倍hESC级Matrigel储存液。于-20 °C保存。</li>
	<li>取33.3 µL 30倍hESC级Matrigel，用1 mL DMEM/F12稀释，制备1倍hESC级Matrigel工作液。</li>
	<li>提前在4 °C条件下，用每孔1 mL的1倍hESC级Matrigel溶液包被无菌6孔组织培养板，过夜孵育。使用前于室温（RT）放置至少30分钟。</li>
	<li>将冻存的hESC置于37 °C水浴中静置解冻3分钟，不振摇。随后立即用移液器将细胞转移至含有4 mL预热至37 °C的mTesR培养基的15 mL离心管中，轻轻吹打混匀2次。</li>
	<li>在室温下以200 ×g离心2分钟，沉淀hESC细胞。</li>
	<li>吸除上清液，轻轻将细胞重悬于1 mL mTesR培养基中。</li>
	<li>吸去培养板中的DMEM/F12溶液，将细胞以每2 mL mTesR培养基接种1 × 105个细胞的密度接种至6孔板的一个孔中。</li>
	<li>置于含5% CO2的培养箱中孵育，每日更换预热的mTesR培养基以维持细胞生长。当细胞融合度达到约70–80%，或细胞克隆开始相互接触时进行传代。</li>
</ol>
2. 干细胞传代与分化
<ol>
	<li>传代细胞时，吸除培养基，加入1 mL/孔的酶溶液（例如Accutase&#160;），在37 °C孵育5分钟。然后用移液器将细胞转移至含有4 mL预热至37 °C的DMEM/F12培养基的15 mL离心管中。</li>
	<li>在室温下以200 ×g离心2分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用1 mL mTesR培养基轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>提前使用250 µL 1× hESC级Matrigel培养基包被24孔板。按照上述方法，以每孔1 - 1.5 × 105个细胞的密度，将hESC接种于500 µL mTesR培养基中。</li>
	<li>将细胞置于CO2培养箱中，在37 °C孵育24小时。</li>
</ol>
3. 内胚层形成
<ol>
	<li>用含有0.2% BSA的DPBS配制100 µg/mL的Activin A储存液，并用DMSO配制3 mM的CHIR99021储存液。</li>
	<li>通过在RPMI培养基中添加1× B27，制备I阶段分化基础培养基。</li>
	<li>将Activin A加入预热的I阶段分化基础培养基中，使其终浓度为100 ng/mL，同时加入CHIR99021使其终浓度为3 µM。</li>
	<li>吸除细胞中的mTesR培养基，替换为添加了分化因子的I阶段分化培养基（例如，每孔24孔板加入0.5 mL）。</li>
	<li>将细胞置于37 °C的CO2培养箱中孵育3天，每天更换含有新鲜分化因子的I阶段培养基（第0–2天）。 
	&#8203;注意：分化3天后，分化细胞应表达定型内胚层（DE）细胞的标志物，如FOXA2、SOX17、GATA4、CRCR4和FOXA1（进入下一步前，SOX17阳性细胞比例至少需达到80%）。</li>
</ol>
4. 肝祖细胞的分化
<ol>
	<li>通过将 Knockout 血清替代物（KOSR）溶解于 Knock Out DMEM 中，配制成终浓度为 20% 的第二阶段分化基础培养基。</li>
	<li>向适当体积的 KOSR/Knockout DMEM 中添加 1% DMSO、1× GlutaMAX、1× 非必需氨基酸（NEAA）溶液、100 µM 2-巯基乙醇和 1× 青霉素/链霉素（P/S），配制成含上述成分的第二阶段分化培养基。</li>
	<li>在分化第 3 天，吸除原有培养基，更换为第二阶段分化培养基（例如，24 孔板每孔 0.5 mL），随后继续培养 24 小时。</li>
	<li>在分化第 4 天，吸除培养基，更换为第二阶段分化培养基（例如，24 孔板每孔 1 mL）。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基（例如在第 6 天更换）。 
	&#8203;注意：分化培养 8 天后，分化所得细胞应表达肝前体细胞的相关标志物，如 HNF4α、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA（进入下一步前，HNF4α 阳性细胞比例至少需达到 80%）。</li>
</ol>
5. 肝细胞分化
<ol>
	<li>使用含0.2% BSA的DBPS配制10 µg/mL肝细胞生长因子（HGF）和20 µg/mL抑癌素（OSM）的储存液，并用0.22 µm滤膜过滤。</li>
	<li>配制III阶段分化基础培养基（HepatoZYME-SFM（HZM）培养基，添加10 µM氢化可的松-21-半琥珀酸酯和1×青霉素-链霉素溶液）。</li>
	<li>将HGF加入预热的III阶段分化培养基中，使其终浓度为10 ng/mL；将OSM加入同一培养基中，使其终浓度为20 ng/mL。</li>
	<li>在分化第8天，吸除细胞中的II阶段培养基，更换为III阶段培养基（例如，24孔板每孔1 mL）。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、CO2培养箱中继续培养10天，每隔一天更换一次III阶段培养基，并重新添加新鲜的分化因子（第8–18天）。 
	&#8203;注意：分化18天后，分化所得细胞应表达肝细胞的特征性标志物，如AAT、ALB、TTR、HNF4α、NTCP、ASGR1、CYP3A4。白蛋白阳性细胞的比例通常超过90%。</li>
</ol>
6. RNA 提取、cDNA 合成及 RT-qPCR 分析
<ol>
	<li>吸弃细胞培养基，加入适量 RNAiso Plus 试剂（例如，24 孔板每孔加 0.3 mL）。将上清液收集至 1.5 mL 离心管中，室温静置 5 分钟。</li>
	<li>加入 60 µL 氯仿试剂，室温放置 5 分钟，然后在 12,000 x g 下离心 15 分钟。</li>
	<li>吸取 125 µL 上清液转移至另一离心管中，加入 160 µL 异丙醇，充分混匀后室温静置 10 分钟。</li>
	<li>在 12,000 x g 下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，向沉淀中加入 75% 乙醇，在 7,500 x g 下离心 5 分钟。</li>
	<li>室温干燥后，加入 40 µL DEPC 处理水溶解 RNA。进行 qPCR 时，按照逆转录试剂盒说明书，使用 2 µg 总 RNA 进行逆转录。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，使用商业化的试剂盒进行 RT-qPCR。</li>
	<li>以未诱导的干细胞为参照标准化基因表达水平，并以 GAPDH 为内参进行归一化后确定表达倍数变化。</li>
</ol>
7. 分化作用的免疫荧光验证
<ol>
	<li>通过将0.1% Tween-20加入PBS中，制备1× PBST洗涤缓冲液。</li>
	<li>吸去贴壁细胞的培养基，并在摇床上用PBS于室温下短暂洗涤一次。</li>
	<li>吸去PBS，每孔加入500 µL冰甲醇（24孔板），于-20 °C过夜固定细胞。</li>
	<li>去除甲醇，并在摇床上用PBS于室温下每次10分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>用含5% BSA的PBS溶液500 µL，在摇床上室温封闭细胞1–2小时。</li>
	<li>用封闭液将一抗按1:200比例稀释。</li>
	<li>每孔加入300 µL一抗溶液，在摇床上4 °C避光孵育过夜。</li>
	<li>过夜孵育后，在摇床上用PBST于室温下每次10分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>用封闭液将二抗按1:1000比例稀释，制备二抗溶液。</li>
	<li>每孔加入300 µL二抗溶液，在摇床上室温避光孵育1小时。</li>
	<li>吸去二抗溶液，并在摇床上用PBST于室温下每次10分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>加入300 µL浓度为1 µg/mL的DAPI溶液孵育3–5分钟，然后用PBST洗涤两次。</li>
	<li>吸去PBST后，加入适量PBS，用于荧光显微镜下拍照。</li>
</ol>
8. 蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>通过将 0.1% Tween-20 加入 Tris 缓冲盐水（TBS）中，制备 1x TBST 洗涤缓冲液。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用商用试剂盒制备 SDS-PAGE 电泳缓冲液和 Western 转膜缓冲液。</li>
	<li>将总细胞蛋白（40 µg）在 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上进行分离，并在 SDS-PAGE 电泳缓冲液中以 15 mA 恒定电流电泳约 2 小时。</li>
	<li>在低温条件下，以 300 mA 恒定电流将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续 2 小时。 
	注意：运行时间和转膜时间可能因所用设备以及凝胶类型和浓度的不同而有所变化。</li>
	<li>在摇床上，用含 3% BSA 的 TBST 溶液室温封闭膜 1 小时。</li>
	<li>在摇床上，加入一抗溶液（1:1000 稀释），4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>过夜孵育后，在摇床上用 TBST 室温洗涤印迹膜 3 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>在摇床上，加入二抗溶液（1:2000 稀释），室温孵育 2 小时。</li>
	<li>弃去二抗溶液，在摇床上用 TBST 室温洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>使用化学发光试剂显色，随后进行自显影检测免疫反应条带。以 β-actin 作为上样对照。</li>
</ol>
9. 吲哚菁绿摄取
<ol>
	<li>在DMSO中配制200 mg/mL的吲哚菁绿储备液。</li>
	<li>将吲哚菁绿溶液加入III期分化培养基中，配制成终浓度为1 mg/mL的工作液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1–2小时。</li>
	<li>吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次。</li>
	<li>在显微镜下拍照。</li>
</ol>
10. 过碘酸-雪夫（PAS）染色和苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>吸弃贴壁细胞的培养基，并用 PBS 短暂洗涤两次。</li>
	<li>进行细胞固定时，吸弃 PBS，加入预冷的甲醇，在 -20 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>采用 PAS 染色法观察糖原储存情况，并使用试剂盒按照制造商说明书进行 H &amp;#38; E 染色以观察双核细胞。</li>
	<li>使用荧光显微镜拍摄图像。</li>
</ol>
11. CYP 活性检测
<ol>
	<li>根据制造商的说明，使用市售的基于细胞的检测方法（P450-Glo Assays）测定CYP450活性。</li>
	<li>进行三次独立重复实验。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。</li>
</ol>

<ol><li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver%3A+Nutritional+and+Physiological+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li>
<li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li>
<li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death & Disease. 10, 763(2019).</li>
<li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li>
<li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li>
<li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li>
<li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li>
<li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li>
<li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li>
<li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li>
<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li>
<li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%2FmTORC2+regulates+TGF-beta%2FActivin+signalling+by+modulating+Smad2%2F3+activity+via+linker+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212(2015).</li>
<li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li>
<li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li>
<li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection%2C+spreading+and+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li>
<li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li>
<li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种分三阶段诱导hESCs&#160;生成HLCs的逐步方法。第一阶段使用Activin A和CHIR99021将hESCs分化为定型内胚层（DE）；第二阶段使用KO-DMEM和DMSO将DE进一步分化为肝前体细胞；第三阶段使用HZM培养基联合HGF、OSM及氢化可的松21-半琥珀酸钠盐，将肝前体细胞继续分化为肝样细胞（HLCs）。
使用本方案时需考虑以下关键步骤。细胞的初始分化密度以及培养基更换的准确时机是成功分化的关键因素。开始分化时，必须确保初始接种密度适当，细胞汇合度约为30-40%，此时细胞刚刚开始相互接触，且在视野下细胞间隙均匀分布呈网状结构。在分化过程中，必须在规定时间精确更换相应的分化培养基，尤其是在第一阶段以及每个更换阶段的关键时刻，以确保细胞以模拟胚胎发育过程的模式和阶段进行分化。
将人胚胎干细胞（hESCs）分化为定型内胚层（DE）的第一阶段尤为重要。在分化第一阶段，通常会有大量细胞脱离并漂浮起来，此阶段是细胞命运决定的关键时期，但此时细胞仍保留增殖能力。因此，第一阶段结束时，细胞汇合度可达约90...

肝脏是一个高度代谢活跃的器官，具有多种功能，包括解毒、糖原储存以及蛋白质的分泌和合成1。多种病原体、药物及遗传因素均可引起肝脏的病理改变，影响其正常功能2,3。肝细胞作为肝脏的主要功能单位，在人工肝支持系统和药物毒性清除中发挥着重要作用。然而，在基于细胞的治疗以及肝脏疾病研究中，原代人肝细胞的来源十分有限。因此，开发新的功能性人肝细胞来源是再生医学领域的重要研究方向。自1998年人胚胎干细胞（hESCs）建立以来4，由于其具有强大的分化潜能（在适宜环境下可分化为多种组织）和高度的自我更新能力，hESCs被研究人员广泛视为理想的细胞来源，可用于生物人工肝、肝细胞移植乃至肝组织工程5。
目前，通过富集内胚层可显著提高肝细胞分化效率6。在干细胞向内胚层谱系分化的过程中，转化生长因子β（TGF-β）&#160;信号通路和WNT信号通路的水平是内胚层形成阶段的关键调控节点。高水平激活TGF-β和WNT信号通路可促进内胚层的发育7,8。Activin A属于TGF-β超家族的一种细胞因子，因此在人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）的内胚层诱导中被广泛应用9,10。GSK3是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。研究人员发现，GSK3β的特异性抑制剂CHIR99021能够激活典型的WNT信号，并在特定条件下促进干细胞分化，表明CHIR99021在诱导干细胞向内胚层分化方面具有潜在应用价值11,12,13。
本文报道了一种高效且可重复的方法，可有效诱导人胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝样细胞（HLCs）。通过依次添加Activin A和CHIR99021，可获得约89.7±0.8%的SOX17（定型内胚层标志物）阳性细胞。随后进一步成熟培养 体外，这些细胞表达肝特异性标志物，并呈现类似肝细胞的形态（基于苏木精-伊红染色（H &amp;#38; E）及功能，如吲哚菁绿（ICG）摄取、糖原储存和CYP3活性。结果表明，通过该方法可成功将hESCs分化为成熟且具有功能的肝样细胞（HLCs），并为肝病相关研究提供基础 体外 药物筛选

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>用于肝祖细胞分化</td></tr><tr><td>488标记山羊抗小鼠IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0512</td><td>用于免疫荧光，二抗</td></tr><tr><td>488标记山羊抗兔IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZF-0516</td><td>用于免疫荧光，二抗</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td>用于细胞传代</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>peproTech</td><td>120-14E</td><td>用于定型内胚层形成</td></tr><tr><td>抗-白蛋白（ALB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>用于免疫荧光和Western blot，一抗</td></tr><tr><td>抗-人Oct4</td><td>Abcam</td><td>Ab19587</td><td>用于免疫荧光，一抗</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-甲胎蛋白（AFP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8452</td><td>用于免疫荧光和Western blot，一抗</td></tr><tr><td>抗-SOX17</td><td>Abcam</td><td>ab224637</td><td>用于免疫荧光，一抗</td></tr><tr><td>抗-肝细胞核因子4α（HNF4&amp;alpha;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1412164</td><td>用于免疫荧光，一抗</td></tr><tr><td>B-27添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>用于定型内胚层形成</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>ST023-200g</td><td>用于细胞封闭</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046</td><td>用于定型内胚层形成</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td>用于细胞核染色</td></tr><tr><td>DEPC水</td><td>Beyotime</td><td>R0021</td><td>用于RNA溶解</td></tr><tr><td>DM3189</td><td>MCE</td><td>HY-12071</td><td>用于定型内胚层形成</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>用于肝祖细胞分化</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>用于肝祖细胞分化</td></tr><tr><td>H&amp;E染色试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>C0105S</td><td>用于H&amp;E染色</td></tr><tr><td>肝细胞生长因子（HGF）</td><td>peproTech</td><td>100-39</td><td>用于肝细胞分化</td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM（HZM）</td><td>Gibco</td><td>17705-021</td><td>用于肝细胞分化</td></tr><tr><td>氢化可的松-21-半琥珀酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td>用于肝细胞分化</td></tr><tr><td>吲哚菁绿</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606326</td><td>用于吲哚菁绿染色</td></tr><tr><td>Knock Out DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>用于肝祖细胞分化</td></tr><tr><td>Knock Out SR多物种</td><td>Gibco</td><td>A31815-02</td><td>用于肝祖细胞分化</td></tr><tr><td>Matrigel hESC认证级</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（NeAA）</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>用于肝祖细胞分化</td></tr><tr><td>mTesR 5X添加剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85852</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>mTesR基础培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85851</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>Oncostatin（OSM）</td><td>peproTech</td><td>300-10</td><td>用于肝细胞分化</td></tr><tr><td>P450 - CYP3A4（Luciferin - PFBE）</td><td>Promega</td><td>V8901</td><td>用于CYP450活性检测</td></tr><tr><td>PAS染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G1281</td><td>用于PAS染色</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>用于细胞分化</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZB-2305</td><td>用于Western blot，二抗</td></tr><tr><td>Western blot一抗稀释缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0256</td><td>用于一抗稀释</td></tr><tr><td>ReverTraAce qPCR RT试剂盒</td><td>TOYOBO</td><td>FSQ-101</td><td>用于cDNA合成</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>TaKaRa</td><td>9109</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>用于定型内胚层形成</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td>用于二抗配制</td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td>用于RT-PCR分析</td></tr><tr><td>Torin2</td><td>MCE</td><td>HY-13002</td><td>用于定型内胚层形成</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB7485V</td><td>用于洗涤缓冲液配制</td></tr></tbody></table>

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

由人胚胎干细胞（hESCs）衍生的肝细胞样细胞（HLCs）在疾病建模和药物筛选应用方面具有广阔前景。本文提供了一种高效且可重复的hESCs向功能性HLCs分化的实验方法。内胚层谱系的建立是向HLCs分化过程中的关键步骤。本方法通过在hESCs向定型内胚层（DE）分化阶段持续添加Activin A和CHIR99021，调控关键信号通路，随后依次生成肝前体细胞，最终在完全明确的试剂条件下，分阶段获得具有典型肝细胞形态的HLCs。该方法所获得的hESC来源HLCs表达各阶段特异性标志物（包括白蛋白、HNF4α核受体和牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）），并表现出成熟且功能性肝细胞的特有特征（包括吲哚菁绿染色、糖原储存、苏木精-伊红染色以及CYP3A活性），可为肝细胞样细胞在肝脏疾病研究中的应用提供有效平台。

人胚胎干细胞向肝样细胞分化的示意图及各分化阶段的代表性明场图像见图1。在第I阶段，加入Activin A和CHIR99021处理3天，诱导干细胞形成内胚层细胞。在第II阶段，内胚层细胞经分化培养基处理5天后，分化为肝前体细胞。在第III阶段，早期肝细胞在HGF和OSM存在下培养10天后进一步成熟并分化为肝样细胞（图1A）。在分化的最终阶段，细胞呈现出典型的肝细胞表型（细胞呈多边形，分布均匀且规则）（图1B）。
为进一步确认肝细胞分化，采用RT-qPCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测内胚层细胞、肝祖细胞以及成熟肝细胞的标志物（图2）。分化的细胞在各个阶段均表现出较高的分化相关基因和蛋白表达水平，例如第3天内胚层标志物SOX17（89.7±0.8%），第8天肝祖细胞标志物HNF4α（81.3±2.9%），第14天AFP（86.6±0.3%），以及第...

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin A和CHIR99021。

由人胚胎干细胞（hESCs）衍生的肝细胞样细胞（HLCs）在疾病建模和药物研究方面具有广阔的应用前景……

人胚胎干细胞来源的肝细胞样细胞在疾病建模和药物筛选中具有重要应用价值。本方法是一种高效且可重复的诱导人胚胎干细胞分化为功能性肝细胞样细胞的技术。人胚胎干细胞的未分化状态及其适当的汇合度对于成功分化为肝细胞样细胞至关重要。为维持干细胞生长，使用1X人胚胎干细胞级Matrigel对无菌的六孔组织培养板进行包被，每孔加入一毫升，并在4摄氏度下保存过夜。使用前将培养板置于室温下30分钟。将冻存的HESEs在37摄氏度水浴中静置解冻3分钟，不要晃动，然后立即用移液器将干细胞转移至含有4毫升预热至37摄氏度的mTESR培养基的15毫升离心管中。将HESEs离心并吸除上清液，然后在1毫升mTESR培养基中轻轻重悬细胞。吸除培养板中的DMEM F-12培养基。以每2毫升mTESR培养基接种5×10⁴个细胞的密度将细胞接种至6孔板中，并在含5%二氧化碳的培养箱中孵育。每天更换预热的mTESR培养基以维持细胞生长。当细胞融合度达到约70%至80%，或细胞克隆开始相互接触时进行传代。传代时，吸除培养基，每孔加入1毫升酶溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。用移液器将细胞转移至含有4毫升预热至37摄氏度的DMEM/F-12培养基的15毫升离心管中。用250微升1X hESC级Matrigel基质胶对24孔板进行包被处理。在500微升mTESR培养基中，以每孔1×10⁵至1.5×10⁵个细胞的密度接种hESC。在预热的阶段一分化基础培养基中加入激活素A，使其终浓度为100纳克/毫升，同时加入CHIR99021，使其终浓度为3微摩尔。分化三天后，分化所得细胞应表达定型内胚层细胞的标志物，如FOXA2、SOX17、GATA4、CXCR4和FOXA1。在分化第三天，吸除培养基，更换为阶段二培养基，继续孵育24小时。在第4至第8天期间，每隔一天更换一次培养基。经过8天的分化后，分化所得的细胞应表达肝前体细胞的相应标志物，例如HNF4 alpha、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA。第8天时，吸去细胞中的第二阶段培养基，并更换为第三阶段培养基。将细胞置于二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育10天，并每隔一天更换一次添加了新鲜分化因子的培养基。经过18天的分化后，分化所得的细胞应表达肝细胞的特征性标志物，如AAT、ALB、TTR、HNF4 alpha、NTCP、ASGR1、CYP3A4。图中展示了由hESCs分化为肝样细胞的示意图及各分化阶段的明场图像。在第一阶段，加入激活素A（activin A）和CHIR99021，持续三天，以诱导干细胞形成内胚层细胞。在第二阶段，内胚层细胞在分化培养基中处理五天后，分化为肝祖细胞。在第三阶段，经过10天培养，早期肝细胞在肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor）和抑癌素M（oncostatin M）作用下进一步成熟并分化为肝细胞样细胞。在分化的最后阶段，细胞表现出典型的肝细胞表型。采用RT-PCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测内胚层细胞、肝前体细胞以及成熟肝细胞的标志物。分化后的细胞在各个阶段均表现出较高的分化相关基因和蛋白的表达水平，例如第3天的内胚层标志物SOX17、第8天的肝前体细胞标志物HNF4 alpha、第14天的AFP以及第18天的成熟肝细胞标志物ALB。HLCs 呈现绿色染色和广泛的细胞质酸性转移染色。肝细胞表现出典型的双核形态。通过酶活性测定实验，确认了 HLCs 中 CYP3A4 的酶活性，CYP3A4 是肝脏中关键的代谢型 CYP 酶。以适当的密度接种人胚胎干细胞，并在次日开始诱导分化至关重要。在第一阶段，操作培养基时应轻柔，因为细胞容易漂浮起来。在此过程中，激活素A与其他小分子的联合使用可进一步提高分化效率，产生更为成熟的肝细胞样细胞。该技术可为肝细胞移植、肝脏组织工程、人工生物肝脏以及疾病模型研究提供一个平台。

an-efficient-method-for-directed-hepatocyte-like-cell-induction-from

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从人类胚胎干细胞中引导肝细胞样细胞诱导的有效方法

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本文介绍了一种可扩展且符合优良生产规范（GMP）的人多能干细胞向肝细胞样细胞分化的体系。该体系为开展基础和应用型人类肝脏研究提供了成本效益高且标准化的人肝细胞样细胞制备方法。...

由人多能干细胞定义明确且可扩展地生成肝细胞样细胞

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。...

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。...

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

通过细胞分选可纯化由多能干细胞衍生的肝细胞，该方法结合使用线粒体染色和活化白细胞细胞黏附分子（ALCAM，也称为CD166）染色。...

活体线粒体染色在细胞分选中的应用以纯化人诱导性多能干细胞来源的肝细胞

了解利用Activin A和CHIR99021将人胚胎干细胞高效诱导分化为功能性肝细胞样细胞的方法。该方案强调维持干细胞未分化状态和适当汇合度的重要性，可用于疾病建模和药物筛选研究。

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

探索更多视频