Name: 利用时间分辨蛋白诱导的荧光增强来鉴定稳定的局部构象，一次一α-突触核蛋白单体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解时间分辨单分子蛋白诱导荧光增强技术，用于检测α-突触核蛋白的局部稳定构象变化。该方法可揭示传统技术难以捕获的蛋白质结构亚群动态特征。

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编码A56C α-突触核蛋白突变体的pT-t7质粒由Asaf Grupi博士、Dan Amir博士和Elisha Haas博士赠予我们。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号R01 GM130942，E.L.为子项目负责人）、以色列科学基金会（项目号3565/20，属于KillCorona冠状病毒防控研究计划）、Milner基金以及耶路撒冷希伯来大学（启动资金）的资助。

1. 质粒转化
<ol>
	<li>制备 0.5 L SOC 培养基&#160;
	<ol>
		<li>称取 10 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、0.25 g 氯化钠（NaCl）、0.1 g 氯化钾（KCl）。</li>
		<li>加入重蒸水（DDW）至总体积为 0.5 L。</li>
		<li>加入氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7。</li>
		<li>分装成每份 100 mL 的储存液，并进行高压灭菌。</li>
		<li>使用前，在 100 mL SOC 培养基中加入 0.5 mL 无菌氯化镁（MgCl2）和 1.8 mL 无菌葡萄糖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 BL21 (DE3) 感受态 Escherichia coli 细胞置于冰上解冻。</li>
	<li>轻柔混匀感受态&#160;细胞。</li>
	<li>准备两个 15 mL 离心管。分别标记为转化反应管和对照管。</li>
	<li>将 100 µL 感受态&#160;细胞分装至各管中。</li>
	<li>向转化反应管中加入 1 µL 浓度为 0.1 ng/µL 的质粒。</li>
	<li>将 SOC 培养基置于 42 °C 水浴中预热，用于步骤 1.8。</li>
	<li>将两管样品在 42 °C 水浴中热激 45 秒。（关键步骤！）</li>
	<li>向每管中加入 900 µL 预热的 SOC 培养基。</li>
	<li>在 37 °C、225 rpm 振荡条件下孵育 45 分钟。</li>
	<li>用无菌涂布棒将 200 µL 含转化质粒的细胞涂布于一个含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB（Luria-Bertani）琼脂平板上。</li>
	<li>用无菌涂布棒将 200 µL 含转化质粒的细胞涂布于一个不含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上 （阳性对照）。</li>
	<li>用无菌涂布棒将 200 µL 对照细胞（不含质粒）涂布于一个含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上 （阴性对照）。</li>
	<li>将平板在 37 °C 下过夜培养。</li>
</ol>
2. 蛋白质制备
<ol>
	<li>重组 &#945;-突触核蛋白的表达与纯化
	<ol>
		<li>挑取单菌落，接种于100 mL含相应抗生素的灭菌LB（Luria-Bertani）液体培养基中培养 100 &#181;g/mL 氨苄青霉素在 37 &#176;C （起始）.</li>
		<li>准备四个2 L的锥形瓶，每个锥形瓶中装有1 L的高压灭菌LB培养基 100 &#181;g/mL 氨苄青霉素 （大量接种）.</li>
		<li>测量光密度（OD值 &#955; = 600 nm）下的细胞溶液吸光度。当起始培养物的细胞密度达到 OD&#955;=600 nm 0.6–0.7 时，每 1 L 培养液中加入 10 mL 起始培养液&#160;上一步制备的 LB 培养基。</li>
		<li>在摇床培养箱中培养细菌培养基 37 &#176;C 转速为 200 rpm。</li>
		<li>当细胞密度达到 OD&#955;=600 nm 0.6–0.8 时，通过添加异丙基-β- &#946;每升培养基中加入 -d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使其终浓度为 1 mM。 
		注意：将0.96 g IPTG溶解于4 mL去离子水中，每升细菌培养液加入1 mL配制的IPTG溶液。</li>
		<li>培养细胞4小时后，于50 mL离心管中以5,170 × g离心8分钟收集细胞。 
		注意：每轮操作中，弃去上清液，保留沉淀，并再次用细菌培养物填充同一试管。</li>
		<li>将细菌沉淀物储存在深冻储存设备中（例如，-80 &#176;C）过夜。</li>
		<li>次日，配制 200 mL 裂解缓冲液：含 40% (w/v) 蔗糖和缓冲液 A，缓冲液 A 包含 30 mM Tris-HCl、2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、2 mM 二硫苏糖醇 (DTT)，pH 8.0。</li>
		<li>向每管细菌沉淀中加入 25 mL 裂解缓冲液。</li>
		<li>用无菌塑料巴斯德吸管将沉淀重悬于裂解缓冲液中（见2.1.8）。</li>
		<li>在冰上准备一个带有搅拌磁子的无菌250 mL锥形瓶。</li>
		<li>加入 5 mL 裂解缓冲液，然后将重悬均匀的细胞转移至其中。</li>
		<li>在室温下以200 rpm的速度搅拌细胞20分钟。</li>
		<li>将溶液分装至50 mL离心管中，离心 4 &#176;C 30分钟，17,400 × g 转速下离心。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>将无菌的250 mL锥形瓶与搅拌子置于冰上。</li>
		<li>加入15 mL溶解缓冲液（90 mL冷却的缓冲液A和 37 &#181;L MgCl₂2 溶解至超过溶解度极限后过滤，将溶液加入各试管中。使用无菌塑料巴斯德吸管将沉淀溶解。</li>
		<li>当溶液部分变为均一时，将其转移至冰上搅拌的锥形瓶中。</li>
		<li>确定锥形瓶中的溶液体积。</li>
		<li>每1 mL溶液中加入10 mg硫酸链霉素（加入前，将硫酸链霉素溶于2 mL缓冲液A中）。 
		注意：此步骤的目的是去除 DNA 和核糖体。</li>
		<li>在室温下搅拌溶液10-20分钟。</li>
		<li>将溶液分装至50 mL离心管中，离心 4 &#176;C 20,700 × g 条件下离心 30 分钟。</li>
		<li>收集上清液，弃去沉淀。</li>
		<li>在冰上准备一个带有搅拌器的无菌250 mL锥形瓶。</li>
		<li>使用滤器过滤上清液 0.22 &#181;m 将注射器滤器中的溶液转移至洁净的锥形瓶中。</li>
		<li>确定溶液体积，每1 mL溶液称取0.3 g硫酸铵。</li>
		<li>逐渐将硫酸铵加入搅拌的溶液中。 
		注意：此步骤用于沉淀蛋白质。当硫酸铵与蛋白质结合后，溶液会变得浑浊模糊，呈现白色。</li>
		<li>室温下搅拌30分钟。</li>
		<li>将溶液分装至50 mL离心管中，离心 4 &#176;C 20,700 g 条件下离心 30 分钟。&#160;</li>
		<li>小心弃去上清液，保留沉淀。</li>
		<li>用20 mL缓冲液A重悬沉淀。</li>
		<li>将所有溶液合并至一个试管中，然后测定该溶液的紫外吸收光谱。 
		注意：如果光谱显示出聚集的特征（在300 nm波长以上有吸收），则继续下一步。如果没有，则跳过下一步，直接进入步骤2.1.34。 
		注意：由紫外光谱计算得到的聚集指数（A.I.）为 OD&#955;=350 nm/（OD&#955;=280 nm - OD&#955;=350 nm) &#215;100.41</li>
		<li>使用截留分子量为100 kDa的超滤离心管，在3,590 × g离心力下离心 4 &#176;C 持续15分钟。收集滤过液。</li>
		<li>透析该溶液于 4 &#176;C 过夜透析，使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋，置于缓冲液A中。</li>
		<li>再进行一轮透析，持续时间至少为4小时。</li>
		<li>将透析后的样品上样至1 mL MonoQ阴离子交换柱。使用30 mM Tris盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液（pH 7.5）作为洗涤缓冲液，使用含500 mM NaCl的30 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）作为洗脱缓冲液。</li>
		<li>将样品注入色谱柱，然后用20个柱体积（CVs）的0%洗脱缓冲液和100%洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的蛋白质。</li>
		<li>用30%洗脱缓冲液洗涤7个柱体积。</li>
		<li>洗脱 &#945;使用洗脱缓冲液，流速为1.5 mL/min，进行30个柱体积（CVs）的线性梯度洗脱，梯度范围从30%升至100%。 
		注意： &#945;-Syn 在电导率为 20–24 mS/cm 时于 46–66 个柱体积（CV）处洗脱，相当于洗脱缓冲液的 38–50%。</li>
		<li>收集主洗脱峰的组分。验证其存在 &#945;-通过15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样并运行样品，随后用考马斯亮蓝或Fast SeeBand染色液染色。预期出现一条15 kDa的条带。</li>
		<li>合并相关组分，并使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋在缓冲液A中透析过夜 4 &#176;C.</li>
		<li>制备蛋白样品的分装 aliquot，并将其储存于 -20 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cy3标记的 &#945;-突触核蛋白
	<ol>
		<li>还原半胱氨酸残基中的巯基 &#945;-通过加入DTT至终浓度2 mM，在室温下孵育1小时，制备Syn A56C突变体。</li>
		<li>使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋进行两轮透析以去除DTT。第一轮用30 mM Tris-HCl pH 8.0和2 mM EDTA缓冲液透析；第二轮用50 mM HEPES pH 7.2和2 mM EDTA缓冲液透析。</li>
		<li>通过向蛋白质样品中加入盐酸三(2-羧乙基)膦（TCEP），使其终浓度达到，以还原半胱氨酸残基 50 &#181;M 室温下持续30分钟。 
		注意：TCEP 是一种非巯基还原剂，因此可在不与染料发生反应的情况下保持巯基处于还原状态。我们添加了 0.5 &#181;L 从1 M TCEP储备液中</li>
		<li>计算最终反应体积为 1 mL 所需的蛋白量。 
		注：以下是我们所用计算方法的一个示例： 
		&#8203;20 &#181;M 最终蛋白浓度 &#215; 1 mL 最终体积 = 56 &#181;M 初始蛋白浓度 &#215; V 待添加的蛋白 </li>
		<li>计算1 mL最终反应体积所需的染料量。单个半胱氨酸的染料标记应使用过量染料进行，染料与蛋白质的摩尔比至少为3:1。 
		注：以下是我们所用计算方法的一个示例： 
		&#8203;60 &#181;M 最终染料浓度 &#215; 1 mL 最终体积 = 370 &#181;M 初始染料浓度 &#215; V 染料添加 </li>
		<li>根据透析液计算所需缓冲液的量，以将总体反应体积调整至 1 mL。 
		&#8203;注：计算示例：1 mL - (V 计算得出&#160;从步骤 2.2.4 开始 + V 计算得出的&#160;来自步骤 2.2.5）</li>
		<li>在搅拌器上方放置带有磁铁的反应小瓶。</li>
		<li>首先，加入计算量的蛋白质和缓冲液。随后，加入计算量的染料（sulfo-Cy3 maleimide）。</li>
		<li>将反应置于室温避光条件下持续3-5小时。</li>
		<li>加入2 mM DTT终止反应，并继续孵育1小时。</li>
		<li>使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋，用缓冲液A进行三轮透析，以去除溶液中过量的游离染料。</li>
		<li>将样品上样至凝胶过滤柱，以进一步分离标记产物 &#945;-游离染料中的Syn。</li>
		<li>测定纯化标记物的浓度 &#945;通过测量染料的吸光度来测定合成量（磺化Cy3的吸收系数为162,000 M⁻¹cm⁻¹）-1厘米-1在 &#955;=548 nm</li>
		<li>如有需要，浓缩纯化的标记产物 &#945;使用真空浓缩仪（例如 SpeedVac）浓缩 Syn 溶液。然后使用截留分子量为 3.5 kDa 的透析袋，在缓冲液 A 中进行一轮透析，并再次测定标记蛋白的浓度。</li>
		<li>制备标记蛋白样品的等份试样，并于 -20 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测量
<ol>
	<li>smPIFE 实验装置 
	注意：使用以下基于共聚焦显微镜的装置或类似装置。
	<ol>
		<li>使用脉冲激光光源（本实验中为波长 λ = 532 nm 的皮秒脉冲激光器，脉宽约为 100 ps FWHM），在合适的重复频率下工作（本实验中为 20 MHz），并将激光信号连接至时间相关单光子计数（TCSPC）卡的 SYNC 端口，作为 sulfo-Cy3（sCy3）的激发光源。</li>
		<li>使用在 532 nm 处具有高反射率的二向色镜，以分离激发光和散射光与荧光信号。</li>
		<li>在准直后的发射光束经透镜聚焦后、再由另一透镜重新准直前，在发射光焦点处放置一个直径为 100 µm 的针孔。</li>
		<li>使用带通滤光片（本实验中为 585/40 nm）进一步滤除其他光源对 sCy3 荧光的干扰。</li>
		<li>使用探测器（本实验中为单光子雪崩二极管或混合型光电倍增管）检测荧光信号，并通过一个 4 路复用器（本实验中）将信号路由至 TCSPC 模块（本实验中为 Becker &amp;#38; Hickl SPC-150）。 
		注意：本实验中，数据采集通过 VistaVision 软件（ISSTM）以时间标记-时间分辨（TTTR）文件格式进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>smPIFE 样品制备
	<ol>
		<li>在低蛋白结合管中，用测量缓冲液配制 25 pM 的 sCy3 标记 α-突触核蛋白（α-Syn）溶液：缓冲液成分为 10 mM 醋酸钠、10 mM 磷酸二氢钠、10 mM 甘氨酸（pH 8.0）、20 mM NaCl、10 mM 半胱胺和 1 mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（TROLOX）。 
		&#8203;注意：若在 SDS 囊泡存在条件下测量 α-Syn，需同时加入适量 SDS。</li>
		<li>用 100 µL 浓度为 1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）溶液冲洗 18 孔显微镜盖玻片载玻片，持续 1 分钟，随后移除 BSA 溶液。</li>
		<li>向盖玻片载玻片的一个孔中加入 100 µL 上述 25 pM sCy3 标记的 α-Syn 样品溶液。</li>
		<li>使用上述装置对样品进行 smPIFE 测量，具体步骤如下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>smPIFE 数据采集
	<ol>
		<li>使用高数值孔径的水浸物镜（本实验中为 Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2），并在物镜顶部滴加一滴超纯水。</li>
		<li>将盖玻片载玻片固定于载物台腔室中，并安装至显微镜载物台上。</li>
		<li>向上移动物镜，直至物镜顶部的水滴在盖玻片底部铺展开。</li>
		<li>打开激光快门，同时向上移动物镜，并通过 CMOS 相机观察样品散射光形成的图案。观察艾里环图案：第一个环对应水-玻璃界面的焦点，第二个环对应玻璃-样品溶液界面的焦点。</li>
		<li>再将物镜高度上调 75 µm，使激光焦点深入溶液内部，以最大限度减少盖玻片玻璃表面的自发荧光。</li>
		<li>调节物镜处的激光功率至约 100 µW。</li>
		<li>开始对探测到的光子进行预设时间长度的数据采集（本实验中为 2 小时）。 
		&#8203;注意：大部分采集信号的计数率（单位为每秒计数，cps）应与仅测量缓冲液时获得的信号率相近；以毫秒为时间窗口的数据应显示极少的光子爆发事件，大多数时间窗口的平均计数率应接近典型探测器背景水平（本实验中 &lt;1,000 cps）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. smPIFE 爆发分析
<ol>
	<li>原始数据转换 
	注意：数据通常存储在二进制文件中，其格式由制造TCSPC卡的公司预先定义（在本例中为.spc文件）。
	<ol>
		<li>将原始数据文件转换为光子-HDF5通用文件格式42使用软件套件 phconvert （https://github.com/Photon-HDF5/phconvert）。&#160;调用原始数据文件作为输入，并使用相应代码将其转换为原始数据 .hdf5 文件。&#160;phconvert 套件（该 将 ns-ALEX Becker-Hickl 文件转换为 Photon-HDF5.ipynb Jupyter notebook（在我们的案例中）。 
		注意：转换为 .hdf5 文件包括以下步骤：(1) 确定原始数据中的相关光子流（即相关探测器 ID 的已记录光子的光子流）；(2) 确定相关光子的纳秒时间（光子检测时间相对于激发同步时间）；以及 (3) 添加元数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用爆发搜索与选择 荧光共振能量转移猝发43 
	注意：所有单分子蛋白质诱导荧光增强测量的光子-HDF5原始数据文件，以及总结原始数据分析的代码，均存储于Zenodo平台（https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698）。以下所有步骤均在Jupyter笔记本中详细说明并展示，该笔记本亦可通过Zenodo存储库链接获取。
	<ol>
		<li>打开 Jupyter Notebooks（在本例中，位于 Anaconda 框架内）。</li>
		<li>打开笔记本 smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM 新缓冲液（最终记录）.ipynb （可在 Zenodo 链接中找到）。</li>
		<li>装载 FRETbursts.</li>
		<li>加载光子HDF5数据文件。</li>
		<li>背景速率评估：利用光子间隔时间的直方图，计算每30秒数据采集期间的背景速率。&#160;在光子HDF5数据文件中。 
		注意：以下步骤描述了使用滑动窗口算法进行爆发搜索的过程。44,45,46.</li>
		<li>移动一个包含 m=20 个连续光子的时间窗口，每次移动一个光子。</li>
		<li>仅当瞬时光子速率满足条件时，才采集光子数据。<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/62655/62655eq01.jpg" />该期间的背景速率至少比数据采集期间的背景速率高出 F=11 倍。 
		注意：通过每次滑动窗口一个光子（步骤 4.2.6）并符合光子速率标准（步骤 4.2.7）所收集到的所有连续光子，构成一个爆发。</li>
		<li>计算以下爆发特征： 
		爆发大小：一次爆发中的光子数量。 
		爆发持续时间：指一次爆发中最后一个光子与第一个光子探测时刻之间的时间差。 
		爆发亮度：一次爆发中瞬时光子速率的最大值。 
		爆发间隔：连续爆发之间的时间间隔。 
		注意：以下几点描述了进一步的爆发选择程序。</li>
		<li>绘制爆发亮度值（即爆发中最高瞬时光子速率）的直方图，事件轴采用对数刻度。</li>
		<li>将爆发亮度阈值定义为直方图开始呈现衰减模式的最小爆发亮度值。</li>
		<li>选择亮度值高于爆发亮度阈值的爆发。 
		注意：后续步骤描述的是猝发平均荧光寿命。</li>
		<li>以对数尺度绘制光子计数轴，绘制所有选定爆发中所有光子的光子纳米时间直方图。</li>
		<li>将纳米时间阈值定义为光子纳米时间直方图开始呈现衰减模式的最小纳米时间值。</li>
		<li>仅选择纳米时间大于纳米时间阈值的光子。</li>
		<li>计算所有选定光子纳秒时间的代数平均值。</li>
		<li>从光子纳秒时间代数平均值中减去纳秒时间阈值。所得结果即为爆发事件的平均光子纳秒时间，该值与平均荧光寿命成正比。</li>
		<li>绘制所有爆发平均荧光寿命的直方图。可能会出现中心分布的荧光寿命亚群。平均值较低的亚群代表空间位阻较小的sCy3分子种类，而平均值较高的亚群则代表空间位阻较大的sCy3分子种类。 
		注意：后续步骤将基于爆发重现分析，描述爆发间的缓慢动力学。47</li>
		<li>绘制爆发间隔时间的直方图，间隔时间轴采用对数刻度。 
		注意：将会出现爆发间隔时间的两个亚群： 
		一个主要亚群，其分离时间为秒级，代表源自不同连续测量分子的连续爆发。 
		一个分离时间约为...的次要亚群&#60;100 毫秒，代表源自同一分子的连续爆发，反复穿过共聚焦体积。</li>
		<li>选择保存所有间隔时间小于最大分离时间的连续爆发对，该最大分离时间定义了同一分子亚群。&#60;100 毫秒（在本例中）。</li>
		<li>绘制所有在特定分离时间阈值以下重现的爆发对中，第一次与第二次爆发的平均荧光寿命的直方图或散点图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突。

已开展大量生物化学与生物物理研究，以探讨α-Syn的结构特征及其无序性质33,34,35,36,37,38。已有多个研究利用自由扩散的单分子FRET（smFRET）技术，探究无结合状态下α-Syn单体的分子内动力学。这些研究报道了α-Syn具有高度动态异质性，导致在典型扩散时间内通过共聚焦焦点区域时，多种不同结构态被平均化，从而呈现出单一的FRET群体39,40。然而，必须注意的是，smFRET测量反映的是3–10 nm范围内染料间距离的变化，这一尺度表征的是α-Syn这类小蛋白的整体结构变化。
<p class="jov...

在过去的二十年中，基于单分子荧光的方法已成为测量生物大分子的有力工具1,2，可用于研究不同生物分子参数的分布情况，以及这些参数在亚毫秒分辨率下不同亚群之间动态相互转换的过程3,4,5。这些技术中涉及的参数包括FRET&#160;测量中的能量转移效率6,7、荧光各向异性8,9、荧光量子产率和荧光寿命10,11，这些参数会因不同的荧光猝灭12或增强13机制而发生变化。其中一种机制被称为蛋白质诱导荧光增强（PIFE）14，其原理是当荧光团处于激发态时，其自由异构化过程受到邻近蛋白质表面造成空间位阻的影响，从而导致荧光量子产率和荧光寿命增强14,15,16,17,18,19。FRET和PIFE均被视为光谱尺或接近度传感器，因为它们所测得的参数直接关联于被标记生物分子内部的空间距离。FRET效率与一对染料之间3–10 nm范围内的距离相关20，而PIFE则监测染料与邻近蛋白质表面之间0–3 nm范围内距离变化所引起的荧光量子产率或荧光寿命的增加19。
单分子FRET已被广泛用于研究多种不同蛋白质体系的结构，包括内在无序蛋白（IDPs）21，例如α-突触核蛋白（α-Syn）22。α-Syn在结合不同生物分子或处于不同条件时可形成有序结构23,24,25,26,27,28,29,30。然而，在未结合状态下，α-Syn单体表现出高度的构象异质性，并具有快速相互转换的构象31,32。
α-Syn 的构象此前已通过多种不同技术进行了研究，这些技术有助于识别此类高度异质且动态的蛋白质系统的构象动力学33,34,35,36,37,38,39。有趣的是，在缓冲液中对 α-Syn 进行的单分子 FRET（smFRET）测量结果显示仅存在一个 FRET 群体39,40&#160;，这是由于构象在远快于 α-Syn 通过共聚焦检测区域的典型扩散时间（快至数微秒，甚至更快，相对于典型的毫秒级扩散时间）下动态相互转换并发生时间平均化的结果40,41。然而，使用具有 3–10 nm 距离灵敏度的 FRET 光谱标尺有时仅能报告像 α-Syn 这类小蛋白的整体结构变化。利用具有更短距离灵敏度的光谱邻近传感器进行单分子测量，则有可能揭示局部结构的动力学信息。本文中，我们对 α-Syn 进行了单分子 PIFE 测量，识别出具有不同荧光寿命的亚群，这些亚群对应于不同的局部结构，且它们之间的转换速度可慢至 100 ms。本研究总结了在缓冲液中以及当 α-Syn 结合于基于 SDS 的膜时，作为短程单分子光谱邻近传感器，对自由扩散的 α-Syn 分子逐个进行的时间分辨单分子 PIFE 测量结果。

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置</td><td>Merc</td><td>C7715</td><td>截留分子量：100 kDa</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>半胱胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>透析袋 - MEGA GeBaFlex-tube</td><td>Gene Bio-Application</td><td>MEGA320</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fast SeeBand 染色液</td><td>Gene Bio-Application</td><td>SB050</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap 脱盐柱 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1408</td><td></td></tr><tr><td>6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（TROLOX）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MonoQ 柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54807</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质 LoBind 管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108094</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>冲洗 &amp;micro;-slide 18</td><td>Ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>无菌涂布棒，Drigalski 刮铲</td><td>mini-plast</td><td>815-004-05-001</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>磺基-Cy3&amp;nbsp;马来酰亚胺</td><td>abcam</td><td>ab146493</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

利用光谱尺追踪单个生物大分子的多种构象及其动态过程，已彻底改变了人们对结构动力学及其在生物学中作用的理解。虽然基于FRET的测量方法可报告3-10 nm范围内的染料间距离，但其他光谱技术（如蛋白诱导荧光增强效应，PIFE）则可报告染料与蛋白质表面在更短的0-3 nm范围内的接近程度。无论选择何种方法，当用于逐个测量自由扩散的生物大分子时，均可获得实验参数的直方图，呈现出多个独立的、中心分布的亚群，每个亚群代表一种在毫秒时间内保持不变的单一构象，或代表多种在远快于毫秒的时间尺度上相互转换的构象，因而表现为一个平均化的亚群。在单分子FRET实验中，直方图所报告的参数为染料间的FRET效率；先前研究发现，在缓冲液中的α-突触核蛋白单体这类本质上无序的蛋白质，表现出单一的平均化亚群，对应于快速相互转换的多种构象。尽管这些以往的发现依赖于FRET光谱尺3-10 nm的测量范围，我们在此尝试采用单分子PIFE技术对这种蛋白质进行检验，通过逐个追踪位点特异性sCy3标记的α-突触核蛋白的荧光寿命来实现。有趣的是，使用这种测量范围更短的光谱接近性传感器，sCy3标记的α-突触核蛋白表现出多个具有显著不同平均寿命的寿命亚群，且这些亚群在10-100 ms时间尺度上相互转换。这些结果表明，尽管α-突触核蛋白在整体上可能处于无序状态，但它仍能形成稳定的局部结构。总之，本研究强调了使用不同光谱接近性传感器的优势，这些传感器能够逐个生物分子地追踪局部或全局的结构变化。

作为一种内在无序蛋白（IDP），当其未与其他生物分子结合时 &#945;-Syn 在多种构象之间表现出结构动力学，其转换发生在数微秒量级40&#160;甚至在数百纳秒的时间尺度上41。当 &#945;-当Syn穿过共聚焦光斑时，可能在构象间发生数千次转变。事实上，单分子FRET（smFRET）实验中正是观察到了这种情况39,40. 此处我们进行单分子光诱导电子转移（smPIFE）测量，以探究局部构象动力学&#160;&#945;-同义词
测量记录来自连接在半胱氨酸巯基上的磺化Cy3（sCy3）染料所发射的荧光光子 &#945;-Syn A56C 突变体。sCy3 荧光团在激发态时可能发生异构化。然而，当 sCy3 从其激发态退激并发射光子时 转 异构化过程。因此，如果空间位阻未阻碍sCy3激发态的异构化，其平均发射光子数将较少，表现为较低的荧光量子产率和...

时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。

利用光谱尺追踪单个生物大分子的多种构象及其动态变化，已彻底改变了人们对结构……的理解

单分子蛋白质诱导荧光增强技术在研究蛋白质结构亚群及其构象时，可作为单分子FRET测量的补充，尤其适用于不同结构亚群反映稳定局部结构的情况。该技术的主要优势在于，能够根据染料标记位点与蛋白质表面的邻近关系，捕获特异的位点特异性结构亚群。单分子蛋白质诱导荧光增强技术可应用于任何感兴趣的生物分子体系，以探测不同的局部结构亚群。首先，在低蛋白结合管中用测量缓冲液配制25皮摩尔的Sulfo-Cy3标记α-突触核蛋白。向18孔显微镜盖玻片的每个孔中加入100微升浓度为每毫升1毫克的BSA，孵育1分钟，随后弃去BSA。然后向盖玻片的每个孔中加入100微升25皮摩尔的Sulfo-Cy3标记α-突触核蛋白样品。接下来进行数据采集：在高数值孔径的水浸物镜顶部滴加一滴超纯水，将盖玻片载玻片固定在显微镜载物台腔室中，然后将组件安装到显微镜载物台上方。向上移动物镜，直至物镜顶部的水滴在盖玻片载玻片底部铺展开，并打开激光快门。当物镜向上移动时，通过CCD相机观察艾里环的图案。第一个环代表在水/玻璃界面的焦点，第二个环代表在玻璃与样品溶液界面的焦点。将物镜升高75微米，使激光焦点深入溶液中，以最小化盖玻片玻璃表面的自发荧光。调节物镜处的激光功率至约100微瓦。开始对检测到的光子进行预设时间的采集。打开 Jupyter Notebook，然后打开示例笔记本。加载 FRETBursts 和 Photon-HDF5 数据文件。利用光子间时间的直方图，计算每30秒数据采集期间的背景速率。以每次移动一个光子的方式，对连续20个光子滑动时间窗口，当某一时间段内的瞬时光子速率F至少为该数据采集时段背景速率的11倍时，收集该时段的光子数据。计算爆发大小（即爆发中的光子数量）、爆发持续时间（爆发中最后一个光子与第一个光子探测时间之间的时间差）、爆发亮度（爆发中瞬时光子速率的最大值）以及爆发间隔（连续两次爆发之间的时间间隔）。以事件轴为对数尺度，绘制爆发亮度值的直方图。将爆发亮度阈值定义为直方图开始呈现衰减趋势时的最小爆发亮度值，并选择亮度值大于该爆发亮度阈值的爆发事件。对于爆发平均荧光寿命的测量，以光子计数轴为对数尺度，绘制所选爆发中所有光子的光子纳秒时间直方图。将纳秒时间阈值定义为光子纳秒时间直方图开始呈现衰减模式的最小纳秒时间值。仅选择纳秒时间大于该阈值的光子。计算所有选定光子纳秒时间的代数平均值。从光子纳秒时间的代数平均值中减去纳秒时间阈值。所得数值即为突发事件（burst）的平均光子纳秒时间，与平均荧光寿命成正比。绘制所有突发事件平均荧光寿命的直方图。荧光寿命的中心分布亚群可能出现。平均值较低的亚群代表携带未受空间位阻的磺化Cy3（Sulfo-Cy3）的分子种类，而平均值较高的亚群则代表携带空间位阻较大的S-Cy3（S-Cy3）的分子种类。对于缓慢的、爆发间动力学评估，应绘制爆发间隔时间的直方图，并将间隔时间轴以对数尺度表示。选择保存所有间隔时间小于最大分离时间的连续爆发对，该最大分离时间用于定义同一分子亚群。绘制在特定分离时间阈值内重复出现的所有爆发对中，第一和第二次爆发的平均荧光寿命的直方图或散点图。单个S-Cy3标记的α-突触核蛋白-56分子的平均荧光寿命直方图显示，第一亚群具有1.6纳秒的特征荧光寿命，代表在残基56附近蛋白表面较少的α-突触核蛋白构象状态。第二个亚群具有3.5纳秒的特征荧光寿命，代表α-突触核蛋白构象状态，其56位残基附近具有更多的蛋白质表面。已知α-突触核蛋白分子中非淀粉样蛋白β组分区段在结合SDS囊泡时会形成螺旋发夹结构，该结构被证实为单一荧光寿命群体，其特征寿命约为3纳秒，且不存在特征寿命为1.6纳秒的亚群。连续单分子爆发事件之间分离时间的直方图显示，当分离时间快于100毫秒时，会出现重复检测的同一分子，即第一次和第二次爆发来源于同一个分子。所有单分子爆发的平均荧光寿命直方图显示出具有较短特征寿命和较长特征寿命的亚群，这表明单个分子可能在比爆发持续时间更慢的时间尺度上，在不同的平均寿命值之间发生转变。在最多100毫秒的爆发间隔时间内，有一部分分子首次爆发时属于短寿命亚群，再次出现时则归属于长寿命亚群。而首次爆发时属于长寿命亚群、再次爆发时转入短寿命亚群的分子比例，则表明这两个亚群之间的转变发生在10至100毫秒的时间范围内。分析实验结果时，最重要的是要将单分子荧光信号与背景信号正确分离，并对具有足够光子纳秒时间的爆发事件进行分析。单分子PIFE（smPIFE）技术的发展为研究人员在单分子水平上探索核酸与蛋白质相互作用提供了可能，这一进步为研究蛋白质内部局部结构动力学奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

利用时间分辨蛋白诱导的荧光增强来鉴定稳定的局部构象，一次一α-突触核蛋白单体

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。...

荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。...

单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

细胞存活能力依赖于对蛋白质错误折叠的及时且高效管理。本文介绍一种用于观察错误折叠蛋白质不同命运的方法：重折叠、降解或在包涵体中被隔离。我们展示了利用折叠传感器Ubc9ts，结合4D显微镜技术，在活细胞中监测蛋白质稳态及聚集质量控制的过程。...

活细胞中蛋白质聚集的4D成像

本文介绍了一种获取三色单分子FRET数据并利用三维系综隐马尔可夫模型进行分析的实验方案。通过该方法，科研人员可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息，包括协同效应或相关联的相互作用。...

利用三色单分子FRET研究蛋白质相互作用的相关性

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇...

体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。...

超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

中子背散射谱学提供了一种无损且无需标记的方法，用于研究蛋白质及其水合水在皮秒至纳秒时间尺度上的动力学行为。本文通过两项关于淀粉样蛋白的研究展示了该方法的工作流程：一是溶菌酶在聚集过程中时间分辨的动力学研究，二是tau蛋白在形成纤维时其水合水动力学的研究。...

高分辨率中子谱学研究蛋白质及水合水的皮秒至纳秒动力学

许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。...

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

动力蛋白超家族蛋白的功能依赖于与GTP水解相偶联的构象变化。本文描述了一种利用单分子FRET（smFRET）技术监测类动力蛋白GTP酶atlastin在不同核苷酸负载状态下构象动态变化的系统。...

单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

本文介绍了在共聚焦显微镜模式下，利用单分子时间分辨荧光各向异性研究生物大分子局部柔韧性和动力学特性的实验方案。...

单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

了解时间分辨单分子蛋白诱导荧光增强技术，用于检测α-突触核蛋白的局部稳定构象变化。该方法可揭示传统技术难以捕获的蛋白质结构亚群动态特征。

利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

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