利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

单分子蛋白质诱导荧光增强技术在研究蛋白质结构亚群及其构象时，可作为单分子FRET测量的补充，尤其适用于不同结构亚群反映稳定局部结构的情况。该技术的主要优势在于，能够根据染料标记位点与蛋白质表面的邻近关系，捕获特异的位点特异性结构亚群。单分子蛋白质诱导荧光增强技术可应用于任何感兴趣的生物分子体系，以探测不同的局部结构亚群。

首先，在低蛋白结合管中用测量缓冲液配制25皮摩尔的Sulfo-Cy3标记α-突触核蛋白。向18孔显微镜盖玻片的每个孔中加入100微升浓度为每毫升1毫克的BSA，孵育1分钟，随后弃去BSA。然后向盖玻片的每个孔中加入100微升25皮摩尔的Sulfo-Cy3标记α-突触核蛋白样品。

接下来进行数据采集：在高数值孔径的水浸物镜顶部滴加一滴超纯水，将盖玻片载玻片固定在显微镜载物台腔室中，然后将组件安装到显微镜载物台上方。向上移动物镜，直至物镜顶部的水滴在盖玻片载玻片底部铺展开，并打开激光快门。当物镜向上移动时，通过CCD相机观察艾里环的图案。

第一个环代表在水/玻璃界面的焦点，第二个环代表在玻璃与样品溶液界面的焦点。将物镜升高75微米，使激光焦点深入溶液中，以最小化盖玻片玻璃表面的自发荧光。调节物镜处的激光功率至约100微瓦。

开始对检测到的光子进行预设时间的采集。打开 Jupyter Notebook，然后打开示例笔记本。加载 FRETBursts 和 Photon-HDF5 数据文件。

利用光子间时间的直方图，计算每30秒数据采集期间的背景速率。以每次移动一个光子的方式，对连续20个光子滑动时间窗口，当某一时间段内的瞬时光子速率F至少为该数据采集时段背景速率的11倍时，收集该时段的光子数据。计算爆发大小（即爆发中的光子数量）、爆发持续时间（爆发中最后一个光子与第一个光子探测时间之间的时间差）、爆发亮度（爆发中瞬时光子速率的最大值）以及爆发间隔（连续两次爆发之间的时间间隔）。

以事件轴为对数尺度，绘制爆发亮度值的直方图。将爆发亮度阈值定义为直方图开始呈现衰减趋势时的最小爆发亮度值，并选择亮度值大于该爆发亮度阈值的爆发事件。对于爆发平均荧光寿命的测量，以光子计数轴为对数尺度，绘制所选爆发中所有光子的光子纳秒时间直方图。

将纳秒时间阈值定义为光子纳秒时间直方图开始呈现衰减模式的最小纳秒时间值。仅选择纳秒时间大于该阈值的光子。计算所有选定光子纳秒时间的代数平均值。

从光子纳秒时间的代数平均值中减去纳秒时间阈值。所得数值即为突发事件（burst）的平均光子纳秒时间，与平均荧光寿命成正比。绘制所有突发事件平均荧光寿命的直方图。

荧光寿命的中心分布亚群可能出现。平均值较低的亚群代表携带未受空间位阻的磺化Cy3（Sulfo-Cy3）的分子种类，而平均值较高的亚群则代表携带空间位阻较大的S-Cy3（S-Cy3）的分子种类。对于缓慢的、爆发间动力学评估，应绘制爆发间隔时间的直方图，并将间隔时间轴以对数尺度表示。

选择保存所有间隔时间小于最大分离时间的连续爆发对，该最大分离时间用于定义同一分子亚群。绘制在特定分离时间阈值内重复出现的所有爆发对中，第一和第二次爆发的平均荧光寿命的直方图或散点图。单个S-Cy3标记的α-突触核蛋白-56分子的平均荧光寿命直方图显示，第一亚群具有1.6纳秒的特征荧光寿命，代表在残基56附近蛋白表面较少的α-突触核蛋白构象状态。

第二个亚群具有3.5纳秒的特征荧光寿命，代表α-突触核蛋白构象状态，其56位残基附近具有更多的蛋白质表面。已知α-突触核蛋白分子中非淀粉样蛋白β组分区段在结合SDS囊泡时会形成螺旋发夹结构，该结构被证实为单一荧光寿命群体，其特征寿命约为3纳秒，且不存在特征寿命为1.6纳秒的亚群。连续单分子爆发事件之间分离时间的直方图显示，当分离时间快于100毫秒时，会出现重复检测的同一分子，即第一次和第二次爆发来源于同一个分子。

所有单分子爆发的平均荧光寿命直方图显示出具有较短特征寿命和较长特征寿命的亚群，这表明单个分子可能在比爆发持续时间更慢的时间尺度上，在不同的平均寿命值之间发生转变。在最多100毫秒的爆发间隔时间内，有一部分分子首次爆发时属于短寿命亚群，再次出现时则归属于长寿命亚群。而首次爆发时属于长寿命亚群、再次爆发时转入短寿命亚群的分子比例，则表明这两个亚群之间的转变发生在10至100毫秒的时间范围内。

分析实验结果时，最重要的是要将单分子荧光信号与背景信号正确分离，并对具有足够光子纳秒时间的爆发事件进行分析。单分子PIFE（smPIFE）技术的发展为研究人员在单分子水平上探索核酸与蛋白质相互作用提供了可能，这一进步为研究蛋白质内部局部结构动力学奠定了基础。