使用扫描电子显微镜可视化膜褶皱形成
May 27th, 2021
大旋毛细胞增多症是一种高度保守的内吞作用过程，由形成富含F的片状膜突起（也称为膜褶皱）而引发。大旋细胞溶质内化速率增加与各种病理疾病有关。该协议提出了一种使用扫描电子显微镜 在体外 量化膜褶皱形成的方法。
目前的SEM成像方案提供了一种工具，用于可视化和量化体外细胞表面的膜褶皱形成，圆形突起和大毛细胞杯。SEM提供细胞表面的高分辨率图像，可用于可视化大旋毛细胞膜活动。该技术可用于发现调节大旋毛细胞增多症的新信号通路，并鉴定微旋细胞增多症的新型刺激物和抑制剂。
首先使用高压灭菌镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。然后将264.7个巨噬细胞原生态以每毫升10个细胞的密度滑落到盖上，并将板在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。第二天，用500微升新鲜完全培养基替换每个孔中的培养基，然后用载体对照（如DMSO）或大旋细胞增多症抑制剂（如EIPA）预处理巨噬细胞30分钟。
接下来，为了促进膜的皱褶，用大旋多胞细胞增多刺激物（如一微摩尔PMA溶液或每毫升100纳克巨噬细胞集落刺激因子）处理细胞30分钟。为了固定细胞以进行扫描电子显微镜检查，从孔中吸出培养基并用冰冷的PBS洗涤盖玻片两次，然后将盖玻片在室温下在固定剂中孵育30分钟，然后在4摄氏度下孵育过夜。第二天，在不干扰细胞单层的情况下，轻轻洗涤，然后将盖玻片在500微升0.1-马达二甲酸钠中孵育15分钟。
用500微升蒸馏水洗涤两次后，在500微升的分级乙醇系列中洗涤盖子滑两次，每次洗涤10分钟。要进行临界点干燥，请将盖玻片放入临界点干燥器中，并用100%乙醇覆盖。然后，按电源按钮并打开二氧化碳罐。
按住冷却按钮约 30 秒钟，直到温度降至零摄氏度。然后，按下填充按钮，直到腔室窗口中出现气泡。接下来，按下吹扫按钮，直到吹扫废气中的乙醇气味消失。
然后，再次按下冷却按钮，直到温度降至零摄氏度。重新按下完全和清除按钮以将其关闭。然后，关闭二氧化碳罐。
重新按下冷却底部将其关闭，然后按加热按钮。将温度设置为42摄氏度，将压力设置为每平方英寸1， 200磅。压力和温度稳定后，按下排气按钮，使压力缓慢下降。
一旦腔室压力达到每平方英寸150磅，按下通风口底部并等待，直到压力降至每平方英寸零磅。关闭临界点干燥器并取下盖玻片。接下来，使用碳粘合剂丝锥，将盖玻片安装在铝试样支架上进行扫描电子显微镜检查，然后在溅射镀膜机中使用金或钯进行溅射镀膜。
打开溅射镀膜机的电源按钮。真空达到30毫托后，通过关闭气体开关并逆时针旋转细气阀来冲洗腔室以除去湿度和空气。一旦真空增加到200毫托，关闭气体开关，等到真空度达到30毫托。
然后，再次冲洗腔室以除去湿度和空气，如图所示。冲洗腔室三次后，推动定时器底部并调节电压旋钮，直到仪表读数为10毫安。然后，从腔室中取出涂层盖玻片。
要可视化和量化膜褶皱，请将样品盖插入扫描电子显微镜的腔室中，关闭门，然后按evac按钮。打开显微镜操作软件，将加速电压设置为15千伏，工作距离设置为10毫米。按坐标按钮并在控制器周围移动，直到单元格出现在观察屏幕的中心。
将放大倍率设置为 3， 500 X，然后单击"照片"按钮对样品进行成像。这里显示的是具有代表性的扫描电子显微镜图像，显示了用PMA和巨噬细胞集落刺激因子处理后，原始264.7巨噬细胞中膜褶皱形成。用大毛细胞增多症抑制剂EIPA预处理巨噬细胞可减弱膜褶皱的形成。
在褶皱形成过程中，质膜经历不同的形态阶段，包括片状膜突起，C形膜褶皱和大毛细胞杯。PMA和巨噬细胞集落刺激因子治疗后的膜褶皱形成可以使用扫描电子显微镜进行定量，而大核苷酸体的形成可以通过替代成像技术来确认，例如使用德克萨斯红葡聚糖和FM4-64的共聚焦显微镜。蓝色箭头表示膜破裂，而黄色和绿色箭头指向微胰岛素样体。
最后，可以使用荧光液相标记物（如FITC或德克萨斯红葡聚糖）通过流式细胞术来确认和量化大旋胞子细胞增多症。除SEM外，还可以进行荧光标记葡聚糖内化的活细胞成像和流式细胞术分析，以研究和量化大旋细胞增多症。
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概览
本协议概述了一种使用扫描电子显微镜（SEM）来可视化和量化膜褶皱形成和巨胞内吞活性的方法。它强调了巨胞内吞在各种病理条件下的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 显微镜技术
背景
- 巨胞内吞是一种保守的内吞过程。
- 它涉及由F-肌动蛋白驱动的膜褶皱形成。
- 增加的巨胞内吞与各种疾病有关。
- SEM提供高分辨率的细胞结构成像。
研究目的
- 可视化膜褶皱和巨胞内吞杯。
- 量化体外膜褶皱的形成。
- 识别调节巨胞内吞的信号通路。
使用的方法
- 在24孔板中准备无菌玻璃盖片。
- 以特定密度播种RAW 264.7巨噬细胞。
- 在加湿环境中孵育细胞。
- 使用SEM进行膜活动成像。
主要结果
- 获得了高分辨率的膜褶皱图像。
- 实现了巨胞内吞活性的量化。
- 识别了潜在的信号通路。
- 评估了抑制剂对巨胞内吞的影响。
结论
- SEM是研究巨胞内吞的有效工具。
- 该协议可以帮助发现这一过程的新调节因子。
- 理解巨胞内吞可能导致对疾病机制的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing membrane ruffle formation via SEM enables direct observation of macropinocytic activity, a key endocytic mechanism implicated in nutrient uptake, antigen presentation, and pathogen invasion. This imaging approach supports target validation by linking morphological changes to pharmacological modulation, aiding in the de-risking of early-stage hypotheses. Quantifiable surface dynamics provide a phenotypic readout for screening modulators of macropinocytosis in disease-relevant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating stimulator/inhibitor treatment with quantifiable changes in membrane ruffle formation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible imaging readout for assessing compound effects on macropinocytic activity.
- Predictive Value: Supports lead identification by identifying compounds that attenuate or enhance ruffle formation as a proxy for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative morphological data (ruffle count, cup formation) suitable for high-content analysis and hit validation.
- Reproducibility: Standardized fixation and imaging protocols enable cross-experiment comparison and assay robustness.
- Scalability: Compatible with multi-well formats, allowing parallel testing of stimulators, inhibitors, or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links macropinocytic activity to physiological and pathological processes, supporting relevance in cancer, inflammation, and infectious disease models.
- Translational Continuity: Enables correlation of SEM-derived morphological data with functional assays (e.g., dextran uptake) for mechanistic validation.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in target engagement by providing direct visual evidence of pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SEM-based visualization of membrane ruffles fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into lead identification through phenotypic screening of macropinocytic modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing the effects of growth factors, cytokines, or pharmacological agents on membrane dynamics.
- Screening: Enables assay development for quantifying ruffle formation as a functional output in compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric data (ruffle frequency, cup closure) that can be normalized and compared across conditions to assess bioactive compound effects.
- Translational Research: Connects imaging findings to functional validation via complementary techniques like flow cytometry or confocal microscopy for fluid-phase uptake.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying macropinocytosis across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of membrane dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via fixed protocols for sample preparation, imaging, and quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound treatment to observable phenotypic changes in macropinocytic activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated effects on a disease-relevant endocytic pathway.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fixation, and SEM operation for reliable imaging of membrane protrusions.
- Depends on access to SEM, critical point dryer, and sputter coater for sample preparation and imaging.
- Necessitates standardization across teams for consistent stimulation, fixation, and imaging parameters to ensure data comparability.
- Adaptation to primary cells or alternative models may require optimization of seeding density and stimulation conditions.
- Practical limitations include inability to capture dynamic processes in real time and reliance on fixed-cell endpoints.
