Name: 使用扫描电子显微镜可视化膜褶皱形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学习使用扫描电子显微镜可视化RAW 264.7巨噬细胞的膜褶皱形成和巨胞饮活性。该技术可定量分析膜结构变化，有助于发现调控巨胞饮过程的新信号通路，为研究相关疾病机制提供高分辨率成像工具。

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作者感谢奥古斯塔大学的 Libby Perry 在扫描电镜样品制备方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院 [R01HL139562（G.C.）和 K99HL146954（B.S.）] 和美国心脏协会 [17POST33661254（B.S.）] 资助。

注意：以下是一个通用方案，用于通过扫描电镜（SEM）显微技术定量分析RAW 264.7巨噬细胞中的细胞膜皱褶形成。不同细胞类型可能需要进行条件优化。
1. 细胞系与细胞培养
<ol>
	<li>在含有10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养RAW 264.7巨噬细胞，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中。每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，使用无菌PBS洗涤培养板两次。</li>
	<li>加入1,000 µL 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C湿化培养箱中孵育3–5分钟以使细胞脱落。</li>
	<li>在光学显微镜下观察培养板，确认细胞已解离。加入含10% FBS的10 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞悬液收集至50 mL锥形管中，于室温下以400 × g离心5分钟。用完全细胞培养基轻柔重悬细胞，并使用台盼蓝（0.4%）染色法测定细胞数量和活率。 
	注意：本实验建议的最低细胞活率为&#62;90%。</li>
	<li>使用经高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。以1 × 106 个细胞/mL的密度将细胞接种于盖玻片上，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>处理前，每孔更换为500 µL新鲜完全培养基。用溶剂对照（DMSO或其他用于溶解EIPA的溶剂）或巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利（EIPA，25 µM21）预处理巨噬细胞30分钟。</li>
	<li>用溶剂对照及巨胞饮刺激剂处理细胞，以促进细胞膜皱褶形成：佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA，1 µM，30分钟21）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，100 ng/mL，30分钟3）。 
	注意：也可使用其他抑制剂[如拉盾菌素A（1 µM，30分钟）或细胞松弛素D（1 µM，30分钟）]和刺激剂[如表皮生长因子（EGF，100 ng/mL，10分钟）或血小板源性生长因子（PDGF，100 ng/mL，15分钟）]来表征巨噬细胞及其他细胞类型中的巨胞饮作用16,27,28,29。在使用生理学刺激剂处理前，细胞可能需要进行过夜血清饥饿处理。需注意的是，不同细胞类型中有效刺激巨胞饮作用的最佳浓度和孵育时间需另行确定。</li>
</ol>
2. 扫描电镜固定
<ol>
	<li>处理后，吸去孔板中的培养基，并用预冷的 PBS 洗涤盖玻片两次。</li>
	<li>在室温下用固定液（含 4% 多聚甲醛和 2% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液）固定细胞 30 分钟，随后于 4 °C 在固定液中过夜孵育。</li>
	<li>轻柔洗涤并依次将盖玻片与以下试剂各 500 µL 孵育，操作过程中避免破坏细胞单层。
	<ol>
		<li>用 0.1 M 二甲胂酸钠溶液洗涤一次，孵育 15 分钟。</li>
		<li>用去离子水（dH2O）洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 25% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 50% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 75% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 80% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 95% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 100% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。 
		注意：更换试剂时应迅速操作，以防止细胞干燥。盖玻片可在 4 °C 的 100% 乙醇中保存数天。如需长期保存，应补充适量 100% 乙醇，并用封口膜覆盖孔板以防止样品干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.&#160;临界点干燥
<ol>
	<li>将盖玻片放入临界点干燥仪中，并用100%乙醇覆盖。按下电源按钮并打开CO2气罐。</li>
	<li>按下冷却按钮约30秒，直至温度降至0 °C。按下填充按钮，直到观察窗中出现气泡。</li>
	<li>按下 purge 按钮，直至排气口处的乙醇气味消失。再次按下冷却按钮，直至温度降至0 °C。</li>
	<li>重新按下填充和 purge 按钮以关闭它们，并关闭CO2气罐。重新按下冷却按钮以关闭冷却功能，然后按下加热按钮。</li>
	<li>将温度设定为42 °C，压力设定为1,200 psi。待温度和压力稳定后，按下放气按钮，使压力缓慢下降。</li>
	<li>当腔室压力降至150 psi时，按下通气按钮，并等待压力降至0 psi。关闭临界点干燥仪，取出盖玻片。</li>
	<li>使用碳导电胶带将盖玻片固定在扫描电镜用铝制样品台上，并在溅射镀膜仪中采用金/钯进行溅射镀膜处理。</li>
	<li>打开电源按钮，等待真空度达到30 mTorr。通过关闭气体开关并将微调气体阀门逆时针旋转，冲洗腔室以去除湿气和空气。</li>
	<li>当真空度上升至200 mTorr时，关闭气体开关，等待真空度再次降至30 mTorr。重复此步骤3次。</li>
	<li>按下定时器按钮，并调节电压旋钮，使仪表读数为10 mA。从腔室中取出已镀膜的盖玻片。 
	注：请遵循制造商的说明对样品进行临界点干燥和溅射镀膜。</li>
</ol>
4. 成像与定量分析
<ol>
	<li>将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的样品室中。关闭舱门，然后按下 Evac 按钮。</li>
	<li>打开扫描电镜操作软件。将加速电压设为 15 kV，工作距离设为 10 mm。</li>
	<li>按下 Coordinates 按钮，移动控制器，直到细胞出现在观察屏幕中央。将放大倍数设为 3,500×，然后点击“Photo”按钮拍摄样品图像。 
	注意：使用更高倍数的放大（8,500× 至 16,000×）可更清晰地显示细胞质膜的细节。</li>
	<li>在盖玻片上至少选取10个随机位置拍摄图像，确保每个显微视野中包含多个细胞。将图像保存为 .tif 文件。</li>
	<li>从图像中识别膜皱褶，定义为细胞质膜上突出的、毯状折叠结构，其尺寸大于 500 nm（图1）。统计每个细胞的膜皱褶数量。 
	注意：C形皱褶被识别为弯曲的膜突起，其侧端未发生融合[（图1（M-CSF处理）和 图2B）]。在完全闭合前的闭合环状膜皱褶被识别为巨胞饮杯（图2C）。</li>
	<li>将膜皱褶数量归一化为所评估显微视野中细胞的总数。对每组样品重复此分析。</li>
</ol>

<ol><li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipids+in+endocytosis%2C+phagocytosis%2C+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li>
<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis%3A+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286(2018).</li>
<li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8(2015).</li>
<li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+and+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).</li>
<li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).</li>
<li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li>
<li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879(2014).</li>
<li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+phagocytes%3A+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).</li>
<li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277(2015).</li>
<li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li>
<li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121(2020).</li>
<li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li>
<li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li>
<li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li>
<li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+by+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li>
<li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li>
<li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156(2019).</li>
<li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li>
<li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B4-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537(2018).</li>
<li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways%3A+is+it+specific+enough+to+be+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li>
<li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li>
<li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li>
<li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li>
<li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300(2015).</li>
<li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360(2010).</li>
<li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li>
<li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li>
<li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+%28PLD2%29%2C+Grb2+and+Rac2+association%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling%22%5BJournal%5D)">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本扫描电镜成像方案提供了一种用于观察和量化细胞表面膜皱褶形成、环形突起及巨胞饮杯的工具 体外尽管本实验方案主要关注巨噬细胞，但已有研究表明，膜皱褶的形成也发生在其他多种细胞类型中，包括树突状细胞、成纤维细胞、神经元和癌细胞。11,12,14,21,30因此，可能需要优化细胞培养条件，或使用不同的刺激物或处理条件，以便在其他细胞类型中观察到膜皱褶。 
尽管样品制备过程允许一定程度的灵活性，但脱水和临界点干燥步骤必须严格遵循操作流程，以保持细胞表面结构的完整性。此外，水或其他溶剂（如乙醇）的存在会破坏扫描电镜成像所必需的真空环境，因此必须以受控方式彻底去除，以维持样品形态的完整14。
<p ...

巨胞饮作用是一种内吞过程，通过称为膜皱褶的动态且由肌动蛋白驱动的质膜突起，大量摄取细胞外液体及其内容物1。许多此类膜皱褶会形成杯状结构，闭合并重新融合至细胞，随后从质膜分离，形成体积较大、异质性的胞内内体，即巨胞饮体1。尽管在多种细胞类型中，巨胞饮作用可由生长因子（如巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和表皮生长因子（EGF））诱导，但在天然免疫细胞中还观察到另一种独特的、依赖钙离子的过程，称为组成型巨胞饮作用2,3,4,5,6,7,8。
细胞通过巨胞饮作用内化胞外物质的能力已被证明在多种生理过程中发挥重要作用，从营养物质摄取到病原体捕获及抗原呈递均涉及此过程9,10,11。然而，由于该过程具有非选择性和可诱导性，它也与多种病理状态相关。事实上，先前的研究表明，巨胞饮作用在阿尔茨海默病、帕金森病、癌症、肾结石以及动脉粥样硬化中均具有重要作用12,13,14,15,16。此外，某些细菌和病毒已被发现可利用巨胞饮作用侵入宿主细胞并引发感染17,18。有趣的是，巨胞饮作用的激活也可被用于在多种疾病状态下实现治疗剂的靶向递送19,20。
既往研究通过定量分析在存在或不存在大胞饮作用抑制剂的情况下，被细胞内化的荧光标记液相示踪剂，利用流式细胞术和共聚焦成像来探索大胞饮作用21,22。目前可用的抑制大胞饮作用的药理学工具十分有限，主要包括：1）肌动蛋白聚合抑制剂（如细胞松弛素D和拉盾菌素），2）PI3K阻断剂（LY-294002和渥曼腺素），以及3）钠氢交换体（NHE）抑制剂（阿米洛利和EIPA）5,14,15,23,24,25。然而，由于这些抑制剂具有与内吞作用无关的其他效应，因此难以特异性地确定大胞饮作用在溶质摄取及疾病发生机制中的贡献，尤其是在体内（in vivo）条件下21。
扫描电子显微镜（SEM）是一种利用聚焦电子束产生细胞超高分辨率图像的电子显微镜26在巨胞饮研究中，扫描电镜成像被视为可视化细胞质膜地形学和形态学特征、量化膜皱褶形成及其向巨胞饮体内部化进展的金标准技术。此外，将扫描电镜与溶质摄取的定量分析相结合，在有或无巨胞饮抑制剂的条件下，可提供一种可靠策略以检测巨胞饮介导的溶质内化过程。 体外本文提供了一套详细的方案，用于制备扫描电镜（SEM）样品、观察细胞表面、定量分析皱褶形成，并检测其向杯状结构闭合及巨胞饮泡内化的过程。

<table><tbody><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>2% 戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>281692</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利</td><td>Sigma Life Science</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 流式细胞仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳胶粘附标签</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825-09</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24孔透明平底TC处理多孔细胞培养板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>FitC-葡聚糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Hummer Model 6.2 溅射镀膜仪</td><td>Anatech USA</td><td>58565</td><td></td></tr><tr><td>JSM-IT500HR 扫描电子显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯</td><td>Millipore Sigma</td><td>524400</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 巨噬细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>重组人M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Samdri-790 临界点干燥仪</td><td>Tousimis Research Corporation</td><td>8778B</td><td></td></tr><tr><td>SEM 铝制样品台</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>德克萨斯红-葡聚糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780 共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用扫描电子显微镜观察膜皱褶的形成

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

膜皱褶是含有新聚合肌动蛋白丝网状结构的可运动性细胞膜突起的形成过程。膜皱褶可自发产生，也可由生长因子、炎性细胞因子和佛波酯诱导形成。部分膜突起可重新排列为环形膜皱褶，其远端边缘融合，形成杯状结构，随后闭合并从细胞膜分离，在细胞质中形成称为巨胞饮体的大型异质性空泡。在此过程中，皱褶结构包裹细胞外液及溶质，并将其内化至巨胞饮体内。高分辨率扫描电子显微镜（SEM）是一种常用的成像技术，用于观察和定量细胞表面的膜皱褶形成、环形突起以及闭合的巨胞饮杯状结构。以下方案描述了细胞培养条件及诱导膜皱褶形成的刺激方法 体外 以及如何固定、脱水并利用扫描电镜（SEM）对细胞进行成像制样。本文还描述了膜皱褶的定量分析、数据归一化方法，以及膜皱褶形成的刺激剂和抑制剂。该方法有助于解答关于大胞饮作用在生理与病理过程中的作用的关键问题，探索调控膜皱褶形成的新靶点，并鉴定尚未明确的生理刺激因子以及新型的大胞饮作用药理学抑制剂。

本文描述了所展示技术的实验结果。图1 中的代表性扫描电镜（SEM）图像显示，经PMA和M-CSF处理后，RAW 264.7巨噬细胞出现膜皱褶形成。图像首先以3,500倍放大倍数采集，用于定量分析，随后在更高放大倍数（8,500倍至16,000倍）下成像，以更清晰地展示质膜结构细节。在用巨胞饮抑制剂EIPA预处理巨噬细胞后，膜皱褶的形成受到抑制（图1）。与巨胞饮相关的质膜活动可分为五个连续步骤：1）膜皱褶启动，2）环化，3）杯状结构形成，4）杯状结构闭合，以及5）通过巨胞饮体的形成将胞外液体及其相关溶质内化。图2 展示了经M-CSF刺激后这些形态上可区分的质膜活动的代表性图像。片状大皱褶（图2A）、环化呈C形的皱褶（图2B）以及巨胞饮杯结构（图2C）均在6,000倍至7,000倍放大倍...

大胞饮作用是一种高度保守的内吞过程，由富含F-actin的片状膜突起（也称为膜皱褶）的形成为起始。大胞饮作用对溶质内吞速率的增加已发现与多种病理状态相关。本实验方案介绍了一种定量检测膜皱褶形成的方法。 体外 使用扫描电子显微镜。

膜皱褶是含有新聚合肌动蛋白丝网状结构的可运动质膜突起的形成过程。膜皱褶可能……

本扫描电镜成像方案提供了一种用于在体外可视化并量化细胞表面膜皱褶形成、环状突起以及巨胞饮杯状结构的工具。扫描电镜可提供细胞表面的高分辨率图像，可用于观察巨胞饮过程中的膜活动。该技术可用于发现调控巨胞饮作用的新信号通路，并鉴定微胞饮作用的新型激动剂和抑制剂。使用经高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。然后以每毫升10的6次方个细胞的密度将RAW 264.7巨噬细胞接种到盖玻片上，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养过夜。次日，将每孔中的培养基更换为500微升新鲜完全培养基，随后用溶剂对照物（如DMSO）或大胞饮抑制剂（如EIPA）对巨噬细胞预处理30分钟。接下来，为了促进细胞膜皱褶的形成，使用大胞饮作用刺激剂处理细胞30分钟，例如1微摩尔的PMA溶液或每毫升100纳克的巨噬细胞集落刺激因子。为进行扫描电子显微镜观察而固定细胞时，吸出孔板中的培养基，用预冷的PBS洗涤盖玻片两次，随后在室温下将盖玻片置于固定液中孵育30分钟，接着在4摄氏度下过夜孵育。次日，在不扰动细胞单层的前提下，轻轻洗涤盖玻片，然后将其在500微升0.1摩尔的二甲胂酸钠溶液中孵育15分钟。用500微升蒸馏水清洗两次后，再用500微升梯度乙醇溶液清洗盖玻片两次，每次清洗孵育10分钟。进行临界点干燥时，将盖玻片放入临界点干燥仪中，并用100%乙醇覆盖。然后按下电源按钮并打开二氧化碳气罐。按下冷却按钮约30秒，直至温度降至0摄氏度。然后，按下填充按钮，直到腔室窗口中出现气泡。接着，按下吹扫按钮，直至吹扫排气口处的乙醇气味消失。然后，再次按下冷却按钮，直到温度降至零摄氏度。重新按下“满”和“排空”按钮以关闭它们。随后，关闭二氧化碳气罐。重新按压冷却底部以关闭，然后按下加热按钮。将温度设置为 42 摄氏度，压力设置为 1 200 磅每平方英寸。待压力和温度稳定后，按下排气按钮，使压力缓慢降低。当腔室压力达到150磅每平方英寸时，按下排气按钮，并等待压力降至0磅每平方英寸。关闭临界点干燥仪并取下盖玻片。接下来，使用碳导电胶带将盖玻片固定在铝制样品台（用于扫描电子显微镜）上，然后在溅射镀膜仪中使用金或钯进行溅射镀膜。打开溅射镀膜仪的电源开关。当真空度达到30毫托时，关闭气体开关，并逆时针旋转细调气体阀门，以冲洗腔室，去除湿气和空气。当真空度上升至200毫托后，再次关闭气体开关，并等待真空度降至30毫托。然后，再次冲洗腔室以去除湿气和空气，操作如前所示。冲洗腔室三次后，按下计时器按钮，并调节电压旋钮，直至仪表读数为10毫安。随后，从腔室中取出镀膜的盖玻片。为了观察和定量分析膜皱褶，将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的样品室中，关闭舱门，然后按下抽真空按钮。打开显微镜操作软件，将加速电压设置为15千伏，工作距离设置为10毫米。按下“坐标”按钮，移动控制器，直至细胞出现在观察屏幕中央。将放大倍数设置为 3,500 X，然后点击“照片”按钮对样品进行成像。图中显示的是具有代表性的扫描电子显微镜图像，展示了经 PMA 和巨噬细胞集落刺激因子处理后 RAW 264.7 巨噬细胞中膜皱褶的形成。用巨胞饮抑制剂 EIPA 对巨噬细胞进行预处理可减弱膜皱褶的形成。在皱褶形成过程中，细胞质膜会经历一系列明确的形态学阶段，包括片状膜突起、C形膜皱褶以及巨胞饮杯状结构。使用佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）和巨噬细胞集落刺激因子处理后所诱导的膜皱褶形成可通过扫描电子显微镜进行定量分析，而巨胞饮作用的形成则可通过其他成像技术加以验证，例如使用Texas red葡聚糖和FM4-64的共聚焦显微镜观察。蓝色箭头指示膜皱褶结构，黄色和绿色箭头则分别指向微胞饮体。最后，可通过流式细胞术结合荧光液体示踪剂（如FITC或Texas red葡聚糖）来确认并定量大胞饮作用。除了扫描电镜外，还可通过活细胞成像和荧光标记葡聚糖内化作用的流式细胞术分析，对大胞饮作用进行研究和定量。

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使用扫描电子显微镜可视化膜褶皱形成

本视频演示了使用扫描电子显微镜（SEM）对表现出膜皱褶的巨噬细胞进行样品制备、固定及成像的过程。关于膜形态和结构的详细信息对于理解细胞的生理状态至关重要。...

利用扫描电子显微镜定量分析膜皱褶的形成

我们描述了用于研究转染的荧光蛋白在内质网（ER）中分布与移动性的成像方法，该方法通过共聚焦成像技术对活细胞进行观察。同时，我们还从超微结构层面分析了这些蛋白表达对该亚细胞区室结构的影响。...

培养细胞中内质网亚区室的可视化

支撑脂双层和天然膜颗粒是可模拟细胞膜特性的便捷体系，可被整合到多种分析策略中。本文展示了一种制备微阵列的方法，该微阵列由涂覆有支撑脂双层的SiO2微珠、磷脂囊泡或天然膜颗粒组成。...

采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

本文介绍了用于透射电子显微镜观察的生物样品和纳米材料冷冻断裂处理的基本技术及其优化方法。该技术是揭示生物膜超微结构特征和特化结构的首选方法，同时也可用于材料科学和纳米技术产品中获取超微结构水平的尺寸与空间数据。...

生物电子显微镜中冷冻断裂/冷冻蚀刻的基本技术要素

本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。...

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。...

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

固相支撑、无蛋白质的双层磷脂膜（DLBM）可转化为复杂的动态脂质纳米管网络，可作为内质网的二维自下而上模型。...

人工脂质纳米管网络的自发生长与重组：内质网的自下而上模型

我们介绍了连续切片带的制备方法，以及将其收集在大型转移支撑材料上以用作阵列断层成像样本的流程，同时包括在扫描电子显微镜中进行自动成像的操作步骤。该方案可实现对局部稀有事件的筛选、定位与靶向成像，并支持大规模数据的采集。...

使用扫描电子显微镜进行靶向获取体积信息的阵列断层成像工作流程

Septins 是细胞骨架蛋白。它们可与脂质膜相互作用，并能够在微米尺度上感知甚至产生膜曲率。本实验方案中，我们描述了自下而上的体外（in vitro）方法，用于分析膜形变、对曲率敏感的 septin 结合行为以及 septin...

自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

无细胞重建是研究细胞骨架组装的关键工具，过去十年的研究已建立了在简化系统中研究 septin 动态的方法。本文介绍了三种互补的方法，用于在不同膜环境中观察 septin...

在膜上重建隔蛋白组装以研究其生物物理特性与功能

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

学习使用扫描电子显微镜可视化RAW 264.7巨噬细胞的膜褶皱形成和巨胞饮活性。该技术可定量分析膜结构变化，有助于发现调控巨胞饮过程的新信号通路，为研究相关疾病机制提供高分辨率成像工具。

使用扫描电子显微镜观察膜皱褶的形成

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