Name: 放线菌素D处理SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 53 s
Description: 学习使用流式细胞术检测SiHa宫颈癌细胞经放线菌素D处理后的凋亡生物标志物。该方法可快速识别早期和晚期凋亡细胞，为癌症治疗研究提供可靠的实验方案。

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本研究得到了国家研究基金会（NRF）和南非医学研究理事会（SAMRC）的经费支持。我们感谢国家卫生实验室服务局（NHLS）资助购买了Guava Muse细胞分析仪。本出版物中的所有图片均使用Biorender.com制作。

注意：本方案描述了使用台式流式细胞仪对经放线菌素D处理的SiHa细胞进行细胞制备、细胞计数、细胞染色及分析的步骤，相关检测试剂盒为商业化产品（图2）。
<img alt="细胞检测流程图：细胞准备、计数、染色；流式细胞术分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过流式细胞术检测生化凋亡生物标志物的工作流程。 细胞培养及处理方法如方案第 1.1 步所述。（1）细胞培养，（2）计数，（3）用荧光试剂染色，（4）通过台式流式细胞仪进行分析。数据进一步设门并进行统计学分析。缩写：7-AAD = 7-氨基放线菌素 D；PBS = 磷酸盐缓冲液；PE = 藻红蛋白；TMRE = 四甲基罗丹明乙酯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
1. 流式细胞术的细胞培养与处理准备
注意：处理细胞培养物时，应遵循无菌操作技术。
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2的湿润化CO2环境中培养细胞。传代细胞用于实验前，确保母瓶中的细胞融合度约为70%。</li>
	<li>从培养瓶中移除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并加入500 µL胰蛋白酶以使细胞脱落。当细胞开始变圆并从培养瓶表面脱离时，用力轻敲培养瓶底部以促进细胞脱落。随后加入约5 mL含10%胎牛血清的新鲜培养基以中和胰蛋白酶，然后进行细胞计数。</li>
	<li>在6孔细胞培养板中，每孔加入3 mL培养基，以15,000 个细胞/mL的密度接种细胞。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养，使细胞充分贴壁。</li>
	<li>实验组细胞用100 ng/mL放线菌素D处理，对照组分别用新鲜培养基和二甲基亚砜（DMSO）处理，处理时间为24小时。收集用过的培养基至15 mL离心管中，并用1×PBS洗涤细胞。随后将PBS洗涤液也加入离心管中，再向培养孔中加入500 µL胰蛋白酶。接着加入5 mL新鲜培养基以中和胰蛋白酶。 
	​注意：(1) 胰蛋白酶作用时间过长或中和不完全可能消化细胞并破坏细胞膜，从而影响实验结果；此外，还可能改变细胞膜的不对称性，进而影响磷脂酰丝氨酸的可及性。(2) 已脱落并漂浮至培养基表面的细胞，可通过将废弃培养基在300 × g离心5分钟，收集沉淀后重悬于新鲜培养基中，用于后续分析。</li>
</ol>
2. 使用活力检测对细胞进行计数
<ol>
	<li>用移液器将 450 µL 碘化丙啶加入微量离心管中。向该微量离心管中加入 50 µL 细胞悬液。室温孵育 5 分钟。通过流式细胞术对细胞进行计数（参见第 4 节）。</li>
	<li>在进行凋亡检测前，用细胞培养基将所有样品稀释至浓度为 1 × 106 个细胞/mL。</li>
</ol>
3. 流式细胞术染色细胞
注意：本实验步骤无需无菌条件。
<ol>
	<li>使用 Annexin V 检测磷脂酰丝氨酸外翻
	<ol>
		<li>将 100 µL 细胞悬液加入微量离心管中。加入 100 µL 荧光标记 Annexin V 与 7-AAD 试剂按 1:1 混合的溶液。室温避光孵育 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体膜电位去极化分析
	<ol>
		<li>将 100 µL 细胞悬液在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 1 mL 1× PBS 重悬细胞，向每个样品中加入 100 µL TMRE 染色液，并通过轻柔吹打混匀悬液。</li>
		<li>将细胞在 37 °C、加湿的 CO2 环境中孵育 20 分钟。用洁净的铝箔包裹样品以避光。 
		注意：线粒体膜电位是一种对细胞环境微小变化敏感的功能性标志物。因此，为保证可重复性，所有样品应在相同条件下（温度、pH 值以及开始孵育至荧光检测之间的时间间隔）进行孵育和检测。此外，请注意样品若未充分避光，会导致荧光染料发生光漂白，从而造成荧光信号假性降低。</li>
		<li>孵育结束后，向每个样品中加入 5 μL 7-AAD 染色液并混匀。室温避光孵育 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用 Caspase 底物 DEVD 检测活化的终末 Caspase-3 和 -7 
	注意：以下溶液需在进行该检测前预先配制。
	<ol>
		<li>将与 DNA 结合肽偶联的 DEVD 用 DMSO 按 1:8 比例稀释于无菌 1× PBS 中，配制成 Caspase 检测试剂工作液。将该溶液置于冰上或 2–8 °C 保存，避光。 
		注意：每个样品需要使用 5 µL 此溶液。</li>
		<li>将 2 µL 7-AAD 储存液加入 148 µL 1× PBS 中，配制成 7-AAD 工作液。将该溶液置于冰上或 2–8 °C 保存，避光。 
		注意：每个样品需要使用 150 µL 此溶液。</li>
		<li>取 50 µL 细胞悬液在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用 50 µL 1× PBS 重悬细胞，随后加入 5 µL Caspase 检测试剂工作液，充分混匀。</li>
		<li>松开管盖，在 37 °C、加湿的 CO2 环境中避光孵育 30 分钟。向每个样品中加入 150 µL 7-AAD 工作液并混匀。室温避光孵育 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双链 DNA 断裂及总 DNA 损伤的检测
	<ol>
		<li>取 50 µL 细胞悬液在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 500 µL 1× PBS 重悬细胞，加入 500 µL 基于甲醛的固定缓冲液并混匀。将样品置于冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于微量离心管中的 90 µL 1× PBS 中，向管中加入 10 µL 抗体溶液。室温避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入 100 µL 1× PBS，在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 200 µL 1× PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在流式细胞仪上运行样品。
<ol>
	<li>通过运行仪器的系统检查试剂盒，验证流式细胞仪的分析性能。在所有检查项目完成并合格之前，不得进行样本检测。</li>
	<li>在仪器预设的检测程序目录中浏览，找到所需的检测项目，然后选择运行检测。
	<ol>
		<li>在将样本加载到流式细胞仪之前，通过轻柔地反复吹打混匀样本。 
		注意：充分混匀可确保细胞保持悬浮状态，避免细胞计数偏低。</li>
		<li>首先将阴性对照样本加载到流式细胞仪上，然后选择运行（调整设置），使仪器开始吸取样本，并实时显示检测到的事件预览。有关仪器名称和详细信息，请参见材料表。</li>
		<li>利用实时预览，调整荧光和细胞大小的阈值，并在细胞群周围绘制一个矩形门控区域。拖动阈值标记以排除细胞碎片。选择下一步（设置健康谱型）继续操作。 
		注意：了解细胞大小至关重要。拖动滑块并观察检测事件在实时预览图中的变化，以准确设定阈值。若在此阶段未排除细胞碎片，则在后续的数据分析中将无法去除。</li>
		<li>点击并拖动象限标记以分离细胞群，使仪器能够实时绘制检测到的事件。利用这些图示指导最终用户正确放置象限标记。选择下一步（验证样本）继续，仪器将显示设置摘要。检查设置后，选择下一步（验证设置），将这些设置应用于实验中的所有样本。 
		注意：仪器提供2分钟的细胞实时预览，用于调整仪器设置。若超过此时间限制，仪器将释放样本，必须重复步骤4.2.2–4.2.4。移除样本，充分混匀后重新加载并继续操作。</li>
		<li>通过在细胞群周围绘制区域来圈定目标细胞群。利用实时预览图中x轴和y轴上的滑块，调整荧光和细胞大小的阈值。将这些设置应用于实验中的所有样本。</li>
		<li>通过轻柔反复吹打混匀第一个样本，将其加载到流式细胞仪上，然后选择下一步。为样本命名，再选择运行，使系统开始检测该样本。 
		注意：仪器一次只能运行一个样本。</li>
		<li>所有样本检测完成后，为实验命名并保存。可选择保存当前实验的设置，以便将来调用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 采集后分析
<ol>
	<li>如有需要，可在采集后对门控或象限标记进行微调。</li>
	<li>通过系统的文件浏览器找到需要调整的实验，并打开该实验。</li>
	<li>点击图谱的缩略预览图以将其放大。点击细胞门控的左上角或右下角以调整门的尺寸。如需调整象限标记，点击垂直线与水平线的交点，即可整体移动标记位置；如需调整任一条线的角度，请点击该线并拖动其控制手柄。</li>
	<li>按需调整标记（如步骤 4.1.3–4.1.4 所述），然后通过点击对勾图标，勾选所有样本，再选择确认，将这些设置应用到实验中的所有样本。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>每个实验重复三次，并进行方差分析（ANOVA） 事后 采用Bonferroni检验评估处理样本与对照组之间的显著性差异。 
	注：所选统计检验方法取决于研究者及所分析的变量。</li>
</ol>

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本研究通过流式细胞术（FC）分析放线菌素D处理的SiHa细胞，发现显著的早期和晚期凋亡生物标志物。细胞制备、计数和染色的次优条件会导致结果不准确，因此进行流式细胞术时必须严格遵循制造商的说明书。
通过早期和晚期生物标志物的鉴定来研究细胞凋亡，符合NCCD关于细胞凋亡研究的指南1。经放线菌素D处理的SiHa细胞培养物显示出早期和晚期凋亡阶段的阳性生物标志物。Annexin V/PI检测和线粒体通透性检测结果表明，放线菌素D分别诱导了磷脂酰丝氨酸外翻（PS-flip）模式以及线粒体膜电位的消散。一旦凋亡细胞因线粒体功能紊乱达到不可逆阶段，终末半胱天冬酶（caspase）即被激活3,7。本研究中观察到终末caspase 3和caspase 7的激活，提示处于凋亡晚期。此外，终末caspase的激活可导致核小体间DNA切割和广泛的DNA片段化，这一现象经典地表现为凝胶电泳中观察到的梯状条带模式28,38。
通过ATM和H2A.X流式细胞术DNA损伤检测，显示出DNA双链断裂及总DNA损伤。这些结果证实了实验培养物中经典的下游半胱天冬酶（caspase）诱导的凋亡性核损伤（核碎裂和核溶解）。利用多种流式细胞术生物标志物，因而能够检测到凋亡过程中的序贯多阶段事件，并准确、可重复地鉴定出处于早期和晚期凋亡阶段的细胞群体。这些发现与放线菌素D在人类癌症治疗中已知的促凋亡特性一致37,39,40,41，进一步支持将放线菌素D作为研究凋亡的流式细胞术细胞培养实验中的阳性对照。 
本研究中细胞群体的设门依据阴性培养基和溶剂对照，以区分凋亡细胞与健康细胞。 alternatively，也可使用阳性与阴性对照细胞群体的混合样本来定义活细胞和凋亡细胞群体，从而设定细胞群体的设门范围7,9。一旦确定并设门区分了病变与健康细胞状态，该模板设置即可应用于所有后续的实验组和对照组培养样本。
严格遵守流式细胞术（FC）操作规程对于避免假性结果至关重要。在优化实验方案过程中，观察到以下问题：（1）细胞浓度过低，（2）细胞浓度过高，（3）细胞成团，（4）染色时间过长，以及（5）样本处理不当。通过严格遵循优化后的实验方案要求，可预防上述问题。这突显了分析前和分析阶段步骤在获得准确数据中的关键作用。在细胞制备过程中，胰酶消化、移液、离心和稀释操作必须谨慎进行。过度胰酶消化和剧烈移液可能分别导致细胞的化学性和机械性损伤。长时间或高速离心可能导致细胞破裂及细胞碎片增多。为最大限度减少细胞事件的错误采集，需维持最佳细胞浓度。因此，原代细胞悬液应进行适当稀释以达到最佳细胞浓度。
此外，在处理样本时，应注意防止细胞聚集和细胞碎片的产生，确保细胞在分析过程中保持悬浮状态。为防止细胞聚集而进行的样本处理有助于实现单层细胞的层流，避免仪器毛细管路发生机械堵塞，并减少异常增大的细胞大小指数。另一个需要注意的问题是保护培养物免受光照，以避免荧光探针在检测过程中发生光氧化和荧光淬灭，从而防止出现假阴性结果。在细胞染色及后续处理步骤中，必须注意尽量减少光照暴露。此外，过长的免疫染色时间可能导致非特异性蛋白染色，从而产生假阳性结果。因此，严格遵循制造商推荐的孵育染色时间至关重要。
总之，流式细胞术（FC）能够准确检测细胞培养中的细胞凋亡，并区分早期和晚期凋亡的生物标志物。此外，技术的进步已推动了台式流式细胞仪的制造，使非专业科研人员也能研究细胞健康状态及复杂的细胞内信号通路。

细胞凋亡被归类为第1型程序性细胞死亡1，可维持细胞增殖与细胞死亡之间的平衡2。细胞凋亡在人类发育、损伤后修复以及癌症等疾病预防过程中至关重要3。内在和外在的细胞凋亡信号通路4会引发一系列生化和形态学上的细胞内变化2,5,6。通过显微镜可识别细胞凋亡的形态学特征，而生化改变则可通过包括流式细胞术（FC）在内的生化检测方法进行分析7。
在过去二十年中，利用流式细胞术分析来鉴定细胞凋亡并理解相关细胞内机制的研究迅速发展8。流式细胞术（FC）是一种科学方法，用于分析在液体中流经单通道或多通道激光的细胞（图1）9,10,11。流式细胞仪的流体系统通过流体动力学聚焦将液体中的细胞排列成单列。当细胞通过激光时，会散射或发射光信号。散射光可沿前向（前向散射）或侧向（侧向散射）方向传播，分别提供有关细胞大小以及细胞颗粒度或内部结构的信息。
此外，荧光试剂（如荧光染料或带有荧光标记的抗体）可检测特定的细胞表面或细胞内结构及分子。当激光激发荧光标记物时，会发射出特定波长的光。检测器——通常为光电倍增管——对细胞样本散射和发射的光进行定量。检测器产生一个与光散射和荧光发射成正比的可量化电流。该电信号通过计算软件转换为数字信号，从而根据细胞大小、细胞颗粒度以及荧光标记分子的相对荧光强度来鉴定细胞亚群9,12,13。
<img alt="流式细胞术流程示意图，展示细胞标记、激光检测和数据分析过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：传统流式细胞术技术操作与工作流程示意图。细胞经荧光试剂染色后由激光探测。所产生的荧光信号被检测并转化为电子输出，随后由计算机软件和统计程序进行数字化处理与分析。缩写：FSC = 前向散射；SSC = 侧向散射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig1v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
流式细胞术（FC）被广泛应用于科研和健康诊断领域。在细胞死亡生物学（necrobiology）中，FC 的两个主要目标是阐明细胞死亡的分子与功能特性，以及区分不同类型的细胞死亡方式14,15,16,17,18。FC 的应用包括细胞计数、细胞群体分选、免疫表型分析、生物标志物检测（例如，凋亡生物标志物）、毒性研究以及蛋白质工程12。此外，FC 常用于临床诊断，辅助血液系统恶性肿瘤患者的诊断与病情监测。随着仪器设备、荧光染料检测技术和检测系统的发展，FC 的应用正不断拓展，已涵盖成像流式细胞术、质谱流式细胞术和光谱流式细胞术，进一步扩大了其在科研领域的应用范围12。
通过流式细胞术对细胞凋亡进行分析，相较于评估细胞健康状况的传统技术具有诸多优势。流式细胞术（FC）能够快速、可重复地分析异质样品中的大量单个细胞，从而评估细胞凋亡3,5。流式细胞术可在单细胞水平上提供有关细胞表型的定量信息，并避免整体分析，因此在检测细胞凋亡时，其灵敏度优于蛋白质印迹（Western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、荧光测定法和分光光度法等技术8,19。此外，与蛋白质印迹和ELISA繁琐且重复性差的手动操作步骤相比，流式细胞术的操作相对简便，具有明显优势。因此，流式细胞术具备可重复、准确和高通量的分析能力，在癌症研究中具有重要应用价值20。
流式细胞术还可同时分析健康细胞和异常凋亡细胞群体的细胞周期参数21。由于细胞凋亡是一个动态过程，不同检测方法可能产生不同的结果，且结果依赖于细胞收获的时间点22。对细胞表型多个参数进行同步定量评估，可高精度地检测出微小的亚群，例如，频率低至0.01%的稀有细胞亚群也可被检出23。多参数流式细胞术分析尤为有用，因为细胞凋亡的进程伴随着从早期到晚期的一系列生化变化，细胞处于凋亡连续过程中的不同阶段。例如，在凋亡细胞的流式细胞术分析中，采用Annexin V与碘化丙啶双重染色，可将细胞区分为早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和死亡细胞24。在多个阶段准确检测凋亡可避免误分类和假阴性结果。因此，通过流式细胞术进行多参数分析，提高了检测细胞表型的整体特异性，并避免了对微小细胞群的错误分类。此外，流式细胞术的细胞分选功能还可实现高纯度细胞群体的分离，用于后续分析7。
流式细胞术（FC）的缺点包括需使用悬浮细胞，在组织分析中可能具有挑战性，因为将组织解离为单个细胞可能会改变细胞功能19。此外，FC仪器设置、数据分析和检测报告缺乏标准化，可能导致结果差异19，因此有必要对FC操作人员进行充分培训，以正确执行实验，并准确分析和报告数据。例如，FC区分真正的凋亡碎片与凋亡细胞核的能力依赖于：i）恰当的采集参数设置；ii）使用校准微球以识别二倍体DNA峰；以及iii）特异性的阴性与阳性细胞对照3。此外，多参数分析受限于检测器数量，且在使用多种荧光试剂时需进行最佳补偿，以避免非特异性结果和荧光信号溢出25。随着仪器和荧光染料技术的进步，目前可实现多达30个参数的检测12。
凋亡性细胞死亡的鉴定并不总是简单的7，应考虑使用敏感且特异的生物标志物。细胞死亡命名委员会（NCCD）建议采用多种检测方法来研究和定量凋亡过程26。推荐通过显微镜分析经典的凋亡特征26，以确认凋亡并避免假阳性结果7。贯穿早期和晚期凋亡事件的四个关键生化特征包括：（1）细胞膜不对称性的丧失；（2）线粒体膜电位（ΔΨm）的消散；（3）caspase的激活；以及（4）DNA损伤26。
在早期凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸会外翻至细胞膜外层27，可通过藻红蛋白荧光标记的Annexin V进行检测27,28,29。此外，结合使用荧光DNA结合染料7-氨基放线菌素D（7-AAD）进行双重染色，可区分活细胞、晚期凋亡细胞和死亡细胞。因此，早期凋亡细胞对Annexin V呈阳性、对7-AAD呈阴性，而晚期凋亡细胞则对两种染料均呈阳性24。
内源性凋亡信号可导致线粒体膜电位（ΔΨm）的消散。ΔΨm 的破坏会引起早期促凋亡蛋白从线粒体膜间隙释放到细胞质中27,29,30。ΔΨm 的变化可通过双染法进行评估，即使用带正电荷的脂溶性染料四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和 7-AAD 进行染色。当膜电位较高时，TMRE 染料会积聚在线粒体内膜中。去极化的线粒体则表现出荧光强度降低。具有极化线粒体（完整线粒体膜）的活细胞对 TMRE 呈阳性染色，对 7-AAD 呈阴性染色；而具有去极化线粒体的死亡细胞对 TMRE 呈阴性染色，对 7-AAD 呈阳性染色31。
半胱天冬酶（caspase）是一类细胞内蛋白酶，激活后可介导并执行细胞凋亡26,27。终末效应半胱天冬酶（3、6、7）介导晚期凋亡过程29,32,33。半胱天冬酶-3和-7的活性可通过荧光标记的底物进行检测，该底物被切割后可结合DNA并发出荧光信号。此外，通过7-AAD染色可评估细胞膜完整性的任何损伤。凋亡细胞对DNA结合染料呈阳性染色，但对7-AAD呈阴性染色。晚期凋亡细胞和死亡细胞则对两种染料均呈阳性染色34。
晚期凋亡的特征是DNA损伤27,29,35，可通过检测磷酸化的毛细血管扩张性共济失调突变激酶（ATM）和组蛋白H2A.X来评估。双链DNA断裂（DSBs）可导致H2A.X的磷酸化。使用荧光标记的ATM和H2A.X抗体可检测DNA损伤。若ATM和H2A.X均未检测到，则表明无DNA损伤；而若两种荧光信号均被检测到，则表明DNA中存在双链断裂36。
放线菌素D是一种强效的细胞凋亡诱导剂，通过与DNA结合来阻断转录和翻译过程，从而发挥作用37。本研究旨在通过分析细胞凋亡早期和晚期的生物标志物，评估放线菌素D在SiHa细胞系中诱导的生化凋亡过程。研究检测了四种细胞凋亡的生化标志物，用以表征凋亡级联反应中的相继事件，包括细胞膜不对称性的丧失、线粒体膜电位的变化、终末caspase的活化以及DNA损伤。

<table><tbody><tr><td>6 孔板</td><td>Lasec</td><td>P1PLA044C-000006</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P10-040500</td><td></td></tr><tr><td>Guava Muse 细胞分析仪</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管/Eppendorf</td><td>Merck</td><td>EP0030122208-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Muse Annexin V 检测试剂盒</td><td>Merck</td><td>MCH100105</td><td></td></tr><tr><td>Muse Caspase-3/7 检测试剂盒</td><td>Merck</td><td>MCH100108</td><td></td></tr><tr><td>Muse 细胞计数与活力检测试剂盒</td><td>Merck</td><td>MCH600103</td><td></td></tr><tr><td>Muse DNA 损伤检测试剂盒</td><td>Merck</td><td>MCH200107</td><td></td></tr><tr><td>Muse 线粒体膜电位检测试剂盒</td><td>Merck</td><td>MCH100110</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>70013065</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>SiHa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1550</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6231</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Pan Biotech</td><td>P10-040500</td><td></td></tr></tbody></table>

放线菌素d处理的siha宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

采用台式流式细胞仪检测放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中的凋亡生物标志物。在实验组和对照组细胞培养物中，分别检测了凋亡早期标志物（Annexin V和线粒体膜电位）以及晚期标志物（caspase 3和7，以及DNA损伤）。细胞在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育24小时。随后用胰蛋白酶消化使细胞脱落，并通过流式细胞术细胞计数法进行计数。进一步通过Annexin V检测、线粒体跨膜电化学电位检测、caspase 3/7检测以及DNA损伤检测对细胞凋亡情况进行分析。本文概述了细胞凋亡及传统流式细胞术的基本原理，详细阐述了SiHa细胞处理与分析的流式细胞术实验方案。结果部分展示了阳性、阴性以及次优条件下的实验数据，并讨论了利用该分析平台进行细胞凋亡流式细胞术分析时的数据解读要点及注意事项。流式细胞术分析可准确测定细胞凋亡的早期和晚期生物标志物。

细胞计数和活力（图3）结果显示，样品中95.2%的细胞为活细胞，4.8%为死细胞。原始样品中的总细胞浓度为6.20 × 106 cells/mL。
Annexin V 与细胞死亡检测（图4）显示，与对照组相比，经100 ng/mL放线菌素D处理的SiHa细胞中凋亡细胞显著增加（p &lt; 0.0001）。由于Annexin V染色在细胞早期凋亡阶段会增强，该结果提示100 ng/mL放线菌素D可诱导SiHa细胞发生凋亡。
线粒体电化学跨膜电位检测（图5）结果显示，在放线菌素D组、培养基对照组和溶剂对照组之间，细胞健康状态（活细胞、去极化细胞以及活细胞、去极化细胞和死细胞）均显著下降（p &lt; 0.0001）。这些数据表明，100 ng/mL 放线菌素D可诱导SiHa细胞中线粒体的去极化。
半胱天冬酶3/7检测（图6）结果显示，与对照组相比，经100 ng/mL放线菌素D处理的SiHa细胞中半胱天冬酶3和7显著激活（p &lt; 0.0001）。这些结果表明，100 ng/mL放线菌素D可诱导SiHa细胞发生凋亡。
DNA损伤检测实验（图7）显示，100 ng/mL 放线菌素D可显著诱导SiHa细胞中的DNA损伤标志物ATM和H2A.X（p &lt; 0.0001）。该结果提示，经放线菌素D处理的SiHa细胞中DNA损伤明显增加。
次优实验的结果（图8）表明了在所有检测中需考虑的分析因素。细胞浓度会影响数据的准确性。在图8A中，细胞计数过低，无法接受。散点图四个象限中的设门细胞群体信号强度均较低。制造商优化后的检测方案要求最终样本体积中的细胞浓度为300–700个细胞/µL。此例说明了遵循制造商规定的正确样本浓度的重要性。
此外，高细胞浓度也会导致错误的结果（图8B）。对照培养和实验培养的活细胞率分别为99.95%和100%。两项检测的流速均超过了制造商推荐的最佳浓度范围（100–500个细胞/μL），因此需要使用1×检测缓冲液进行稀释，以避免分析结果不准确。
在实验培养物制备过程中应避免细胞聚团，因为细胞聚团会导致细胞大小指数升高，从而产生假性结果，这一点在Annexin V检测中已有体现。图8C展示了两个并存的问题：细胞浓度过高（超出试剂制造商的建议）以及细胞聚团，其证据是SiHa培养基对照组中的细胞大小指数超过4。细胞浓度过高表现为细胞呈片层状排列，在培养基中形成明亮的红色细胞平面，显示出异常升高的凋亡细胞群体。
长时间染色可能导致蛋白质非特异性结合，从而产生假阳性结果，这一点已在Annexin V检测中得到证实。图8D显示了由于染色时间过长，对照组和实验组培养物出现相似的结果。
样本处理不当、贴壁细胞胰酶消化时间过长、洗涤步骤中剧烈吹打以及高速且长时间的离心操作均会导致细胞裂解并产生大量细胞碎片。在图8E中，通过caspase 3/7检测法分析的培养物显示出细胞碎片增加，表现为较小的细胞大小指数（细胞大小指数＜2.2）。因此，在准备用于数据采集的样本时应格外小心。
<img alt="细胞活力分析；散点图和数据表；活/死细胞评估；活力为95.23%。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：细胞计数与活力检测。 该群体分布图可将碎片与活细胞、死细胞区分开。二维点图经设门处理，可区分活细胞与死细胞群体。信息面板提供有关细胞数量、总活细胞百分比以及样本中活细胞总数的定量数据。这些数据可用于在所有样本中标准化细胞数量，以便进行后续的细胞凋亡分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞凋亡分析；放线菌素D处理；膜联蛋白V检测；图表；细胞活力；流式细胞术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：膜联蛋白V检测。 所有样本均采用相同的设门参数，各亚群的统计分析显示，经放线菌素D处理的细胞中凋亡显著增加。所有检测均独立重复三次，每次实验设三个复孔。数据以均值±标准差表示，*p &lt; 0.05* 被认为具有统计学显著性。**** *p &lt; 0.0001*。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力分析；散点图和柱状图显示放线菌素D对细胞群体的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：线粒体跨膜电化学势能检测。 所有样本均采用相同的设门参数，各亚群的统计分析显示，经放线菌素D处理的细胞中线粒体膜电位发生显著变化。所有检测均独立重复三次，每次实验设三个复孔。数据以均值±标准差表示，*p &lt; 0.05 被认为具有统计学意义。**** p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；caspase-3/7 表达图谱；细胞凋亡与存活率柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图 6：Caspase 3/7 检测实验。所有样本均采用相同的设门参数，各亚群的统计学分析显示，经放线菌素 D 处理的细胞中 caspase 3/7 活性显著升高。所有实验均独立重复三次，每次实验均设三个重复孔。数据以均值 ± 标准差表示，*p &lt; 0.05 被认为具有统计学显著性。**** p &lt; 0.0001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA损伤分析；点状图与柱状图；流式细胞术；放线菌素D，对照组比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：DNA损伤检测。所有样本均采用相同的设门参数，各亚群的统计分析显示，经放线菌素D处理的细胞中双链DNA损伤和总DNA损伤显著增加。所有检测均进行了三次独立实验，每次实验设三个重复。数据以均值±标准差表示，* p &lt; 0.05；*** p &lt; 0.001；**** p &lt; 0.0001，其中 p &lt; 0.05 被认为具有统计学显著性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图示；细胞凋亡分析、细胞浓度变化、细胞聚集、染色效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 8"> 
图 8：次优实验条件导致结果不佳。 （A）细胞浓度过低，（B）细胞浓度过高，（C）细胞聚集和成团现象，表现为细胞大小指数升高，（D）细胞样本染色时间过长，表现为两个样本中阳性染色增强，以及（E）样本处理不当，表现为细胞碎片增多（细胞大小指数 &lt; 2.2）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62663/62663fig8v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

细胞凋亡可通过流式细胞术分析早期和晚期凋亡生物标志物来表征。本研究使用台式流式细胞仪，检测经放线菌素D处理后宫颈癌细胞系SiHa的凋亡相关生物标志物。

放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

使用台式流式细胞仪检测放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中的凋亡生物标志物。早期生物标志物（Annexin V...

流式细胞术是一种强大的技术，可对单个细胞进行多参数分析。通过分析数百万个细胞，该技术能够准确、快速地识别早期和晚期凋亡的生物标志物。多种细胞分子可被染色并同时检测。特别是，台式流式细胞仪使得非流式细胞术专业人员也能进行分析和解读。演示该实验步骤的是维生素D癌症研究组的研究生Esther Zhou。首先，在37摄氏度、5% CO2的加湿环境中培养细胞。实验传代细胞前，确保亲本培养瓶中的细胞培养密度约为70%融合。移除培养瓶中的培养基，并用1× PBS洗涤细胞。然后加入1毫升胰蛋白酶以使细胞脱落。当细胞开始脱落时，在计数细胞前，加入约五毫升含10%胎牛血清的新鲜培养基以中和胰蛋白酶。将细胞以每毫升15,000个细胞的密度接种于六孔细胞培养板中，每孔加入三毫升细胞培养基。将培养板置于37摄氏度、5%CO2条件下过夜培养，以使细胞贴附于孔底。第二天，向实验组培养物中加入浓度为100纳克/毫升的放线菌素D，向培养基对照组和溶剂对照组中分别加入新鲜培养基和DMSO，处理24小时。移除孔中的培养基，并将废弃培养基收集至15毫升离心管中。用1×PBS洗涤细胞。加入 500 µL 胰蛋白酶以解离细胞。轻柔地吹打 1 毫升培养基 2 至 3 次，使仍贴附在孔底部的剩余细胞通过机械作用脱落。将孔中的溶液转移至 15 毫升离心管中，然后加入 5 毫升新鲜培养基以中和胰蛋白酶。取450微升含有DNA结合染料的试剂加入微量离心管中。向该微量离心管中加入50微升细胞悬液。室温孵育5分钟。通过流式细胞术对细胞进行计数。在进行凋亡检测之前，用细胞培养基将所有样品稀释至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。为利用Annexin V检测磷脂酰丝氨酸的外翻，取100 µL细胞悬液加入微量离心管中。向其中加入 100 µL 荧光标记的膜联蛋白 V 与 7-AAD 试剂按 1:1 混合的溶液。室温避光孵育 20 分钟。如需分析线粒体膜电位去极化，首先将 100 µL 细胞悬液在 300 × g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。用1毫升1×PBS重悬细胞。向每个样品中加入100微升TMRE染色溶液，通过轻柔反复吹打混匀悬液。用洁净的铝箔包裹样品以避光，并在37摄氏度、加湿的CO2环境中孵育20分钟。孵育结束后，向样品中加入 7-AAD 工作液并混匀。为检测活化的终末半胱天冬酶-3 和 -7，首先将 DEVE 结合的 DNA 结合肽用 DMSO 溶解，再以无菌 1× PBS 按 1:8 的比例稀释，配制为半胱天冬酶检测试剂工作液。将该溶液置于冰上或 2–8 摄氏度保存，避光。取 2 微升 7-AAD 储存液加入 148 微升 1× PBS 中，配制 7-AAD 工作液。将溶液置于冰上或 2 至 8 摄氏度避光保存。取 50 微升细胞悬液，以 300 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于50微升1×PBS中，随后加入5微升caspase检测试剂工作液，充分混匀。松开管盖，在37摄氏度、湿润的CO2环境中避光孵育30分钟。向每个样品中加入150微升7-AAD工作液并混匀。室温避光孵育五分钟。如需检测双链DNA断裂及总DNA损伤，首先将50微升细胞悬液在300 × g条件下离心五分钟，弃去上清液。用500微升1× PBS重悬细胞，加入500微升基于甲醛的固定缓冲液并混匀。将样品置于冰上孵育10分钟。在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。在微量离心管中，用90 µL 1× PBS重悬细胞。向微量离心管中加入10 µL抗体溶液，在室温下避光孵育30分钟。加入100 µL 1× PBS，于300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于200 µL 1× PBS中。上样至流式细胞仪前，通过轻轻反复吹打混匀样本。运行仪器的系统检查试剂盒以验证流式细胞仪的分析性能，在所有检查项目完成并通过之前，不得进行样本检测。首先，将阴性对照样本上样至流式细胞仪，选择“运行”、“调整设置”，使仪器开始吸取样本，并提供所检测事件的实时预览。使用实时预览功能，调整荧光和细胞大小的阈值。在细胞群周围绘制一个矩形门，拖动阈值标记以排除细胞碎片，然后选择“下一步，设置凋亡图谱”继续操作。点击并拖动象限标记，以分离不同的细胞群体，并实时绘制检测到的事件。使用这些图来指导最终用户正确放置象限标记。选择“下一步，验证设置”以继续，仪器将显示设置的摘要信息。检查设置后，选择“下一步，完成设置”，以将这些设置应用于实验中的所有样本。轻轻吹打重悬第一个样本，将其加入流式细胞仪中。点击“下一步”，然后为样本命名并选择“运行”，以启动系统对样本的检测。如有需要，可在数据采集完成后对门控或象限标记进行精细调整。通过系统的文件浏览器找到需要调整的实验并打开该实验。点击图表的缩略图预览以放大显示。要调整象限标记，请点击垂直线和水平线的交点，以整体移动标记；通过点击任意一条线并拖动其控制柄，可调整该线的角度。为了优化细胞设门，点击“设门”（Gate）选项卡并调整门的范围。根据需要调节标记，然后通过点击对号图标、选中所有样本并选择“接受”，将这些设置应用于实验中的所有样本。每个样本设三个重复，采用单因素方差分析并结合事后 Bonferroni 校正检验，以评估样本与对照组之间的显著性差异。细胞计数和活力结果显示，样品中95.2%的细胞为活细胞，4.8%为死细胞。细胞浓度为每毫升5.90 × 10⁵个细胞。Annexin V 与细胞死亡检测显示，与对照组相比，经100 纳克/毫升放线菌素D处理的SiHa细胞中凋亡细胞显著增加。线粒体电化学跨膜电位检测显示，放线菌素D组、培养基对照组和溶剂对照组之间的细胞健康状况显著下降，表明100纳克/毫升放线菌素D可诱导SiHa细胞线粒体去极化。Caspase-3和caspase-7检测显示，与对照组相比，经100纳克/毫升放线菌素D处理的SiHa细胞中终末caspase显著激活。放线菌素D显著诱导了DNA损伤标志物ATM和H2A的表达。X在SiHa细胞中，这表明DNA损伤显著增加。为提高准确性，请确保收获全部细胞群体。同时，遵循制造商推荐的细胞浓度和染色时间。避免光照可保护染色样本，防止荧光染料发生光漂白。通过流式细胞术对细胞凋亡进行的生化分析应辅以显微镜观察，以识别经典细胞凋亡的形态学特征。这些特征包括核固缩、细胞膜出芽、凋亡小体形成以及核碎裂。

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放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

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