单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成
July 6th, 2021
单分子荧光能量转移是一种跟踪核糖体蛋白合成过程中tRNA动力学的方法。通过跟踪单个核糖体，确定不生菌种群，从而揭示机制。该方法可用于跟踪生物构象变化，以揭示许多其他复杂生物系统中的动态函数关系。单分子方法可以观察到非速率限制步骤和人口较少的关键中间体，由于平均效果，传统组合方法无法访问这些中间体。
单分子FRET可以捕获纳米距离内发生的动力学，这是核糖体蛋白生物合成过程的正确尺度。核糖体通过协调多种因素和组件来发挥作用，这在本质上是不健康的。单分子方法可以跟踪每个核糖体，而不受这种不温不图的平均效应的限制。
这种方法将揭示抗生素如何抑制核糖体功能，以开发新的药物对耐药细菌感染。首先，通过将启动的 EFTU、NOG 和 PAG 混合在 37 摄氏度下以 1 比 2 比 2 的比例混合两分钟来准备 PRE。孵化后，用1.1摩尔蔗糖垫超浓缩在10万次G.准备后，混合启动EFTU，WG和PHE混合在37摄氏度的1比2到2的比例10分钟。
孵化后，用1.1摩尔蔗糖垫超浓缩隔夜以10万倍G.清洁显微镜玻璃滑梯，其中包含6对直径为1毫米的孔和1.5号显微镜玻璃盖唇。在300摄氏度下烘烤干净的滑梯和盖片三个小时，然后用氨基沙林覆盖覆盖。在干净的层压罩中，将一个盖片平放在表面上。
小心地将 60 微升 PEG 溶液放在顶部边缘，然后在顶部放置另一个盖片，让毛细电效应将溶液分散到它们之间，确保不会形成气泡。重复这些步骤，再重复两对盖片。将这些盖片存放在装满水的空尖端盒中，并在黑暗中孵育三个小时。
三小时后，将盖片分开，连续用水冲洗三根熔炉，用干氮流清洗。将锋利的移液器尖穿过玻璃滑梯上的孔，直到它们紧密地安装。刮掉锋利的末端，直到它们与玻璃表面完全平整，然后用通道图案切割双面胶带。
将玻璃滑梯粘在平侧的玻璃滑梯上。将涂层的盖唇粘在双面胶带上，然后按压，使样品室密封紧密，确保涂层侧朝内。打开计算机和显微镜开关。
启动激光控制界面并打开激光。按下激光控制盒上的启用按钮，为激光预热。打开摄像机，然后启动显微镜相关软件程序。
单击上部快门并单击灯。将 10 微升 5%Tween-20 添加到 1 毫升 TAM10 缓冲器中，为 Tween 缓冲器准备 TAM10。在一个小微中心管中称重三毫克葡萄糖氧化酶，并加入45微升的卡塔拉酶，准备脱氧溶液。
旋涡管轻轻溶解固体。在微中心以 20，000 倍 G 旋转一分钟，并服用超高纳特。根据文本手稿中的说明，准备 30%葡萄糖溶液、200 毫摩尔特罗洛克斯溶液和每毫升 0.5 毫克链球菌素溶液。
在草皮目标中加入一滴成像油。将样品室放在目标上。在房间中装满10微升链球菌素溶液，等待一分钟。
用 30 微升 TAM10 用 Tween 缓冲器清洗房间，用折叠的滤纸收集直通溶液。洗完后等一分钟。用 Tween 缓冲器将核糖体复合物 PRE 或 POST 稀释到 10-15 纳米摩尔浓度与 TAM10。
将核糖体样品的20微升加载到通道中，等待两分钟。使用 TAM10 缓冲器的 50 微升和脱氧葡萄糖和特罗洛克斯溶液的 0.5 微升进行成像缓冲。混合好。
用 30 毫升的成像缓冲器冲洗腔室。设置相机以获取图像。单击上百叶窗并关闭灯。
启动相机采集，将图像传播到三个窗口，代表两个单独的摄像机和覆盖物。在获取菜单下，选择捕获时间拉时，然后自动单击捕获。设置适当的文件名称、文件路径和循环数，然后单击当前运行。
图像采集完成后关闭弹出窗口，然后打开已收购的 ND 文件。单击投资回报率，简单的ROI编辑器，并选择选项圈。选择图像上的 ROI，并在完成后单击完成。
单击测量、时间测量以显示数据作为图或电子表格。打开出口标签设置出口参数，然后单击出口以节省强度。最后，打开已使用适当应用程序导出的文件。
从 L27 标记残留物到 A 站点或 P 站点 tRNA 的距离分别为 61 或 52 安斯特伦，对应的 FRET 效率为 0.47 和 0.65。捐赠者和接受者渠道的荧光强度被检索和绘制为时间延误。供体漂白后，两个痕迹都接近基线，因为接受者不能直接产生兴奋。
接受者漂白后，供体强度增加，因为较少的反应通路消散了激发能量。由于 tRNA 的摆动运动，单个核糖体表现出不同的波动，这导致了 L27 的距离波动。其他方法，如普洛霉素检测，检测，脚趾印测定和质量规格是免费的单分子FRET方法，并揭示有关蛋白质合成的更多细节。
单分子FRET具有广泛的应用，因为许多生物过程发生在纳米范围内，在毫秒的时间尺度。通过在适当的位置标记适当的染料，可以揭示许多其他动态。
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概述
单分子荧光能量转移（FRET）被用来跟踪核糖体蛋白质合成过程中的tRNA动力学。这种方法允许观察单个核糖体，揭示非均匀的种群，并提供关于生物构象变化的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 生物物理学
背景
- 单分子FRET捕捉纳米尺度距离的动力学。
- 核糖体蛋白质生物合成涉及多个因子和组分的协调。
- 核糖体的非均匀性可能会在常规方法中掩盖平均效应。
- 这种技术可以帮助理解抗生素与核糖体的相互作用。
研究目的
- 跟踪核糖体动力学，不受平均效应的限制。
- 揭示核糖体功能和抗生素抑制的机制。
- 开发针对耐药细菌感染的新药物。
使用的方法
- 使用起始EFTU、NOG和PAG准备PRE复合物。
- 使用超速离心纯化PRE。
- 使用起始EFTU、WG和PHE准备POST复合物。
- 单分子FRET用于跟踪核糖体动力学。
主要结果
- 单分子FRET有效地跟踪单个核糖体。
- 揭示蛋白质合成过程中核糖体的非均匀种群。
- 提供了关于核糖体过程中动态-功能关系的见解。
- 展示了理解抗生素机制的潜力。
结论
- 单分子方法对于观察非限速步骤至关重要。
- 这种方法可以揭示生物系统中低占比的关键中间体。
- 获得的见解可以为开发针对耐药细菌的药物提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule FRET enables direct observation of ribosome conformational dynamics at nanometer resolution, overcoming ensemble averaging that masks mechanistic heterogeneity. This capability is critical for de-risking target validation and understanding allosteric regulation in protein synthesis, directly impacting early discovery and translational research pipelines. The approach supports predictive confidence in mechanistic studies relevant to antibiotic development and resistance profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of ribosomal conformational states and allosteric transitions at the single-molecule level.
- Supports functional target validation by distinguishing mechanistically distinct ribosome subpopulations.
- Facilitates predictive confidence in pathway analysis for translation machinery targets.
Screening & Assay Development
- Provides quantitative FRET efficiency measurements for robust assay standardization.
- Enables reproducible detection of dynamic ribosome-tRNA interactions for screening readiness.
- Supports platform reuse for evaluating compound effects on ribosome function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by revealing dynamic intermediates relevant to antibiotic action.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of ribosome-targeting agents.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying functional heterogeneity in drug response.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule FRET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical mechanism-of-action studies for ribosome-targeting therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ribosome dynamics and allosteric regulation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible FRET outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved intensity and FRET efficiency data for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical antibiotic efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse ribosome and translation factor investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ribosome-targeted drug discovery.
- Operational Value: Standardizes single-molecule measurements for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement and functional heterogeneity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of translation-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence and ribosome biochemistry.
- Demands specialized instrumentation including TIRF microscopy and dual-camera detection.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable to other multi-component translation systems with appropriate labeling strategies.
- Limited by the need for precise dye placement and control of photobleaching artifacts.
