单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

单分子FRET技术能够捕捉发生在纳米尺度上的动态过程，这一尺度恰好适用于核糖体蛋白质生物合成过程。核糖体通过变构方式协调多种因子和组分发挥作用，其本身具有内在的非均一性。单分子方法能够追踪每一个核糖体的活动，而不受这种非均一性平均效应的限制。

该方法将揭示抗生素如何抑制核糖体功能，从而为耐药性细菌感染开发新药物。首先通过将起始EFTU、NOG和PAG混合物按1:2:2的比例在37摄氏度下混合反应2分钟，制备PRE复合物。孵育后，使用1.1摩尔蔗糖垫在100,000 × g条件下超速离心过夜，纯化PRE复合物。通过将起始EFTU、WG和PHE混合物按1:2:2的比例在37摄氏度下混合反应10分钟，制备POST复合物。

孵育后，使用1.1摩尔蔗糖垫在100,000 × g条件下超速离心过夜，以纯化POST。清洗含有六对直径为1毫米孔洞的显微镜载玻片以及1.5号显微镜盖玻片。将洁净的载玻片和盖玻片在300摄氏度下烘烤3小时，然后用氨基硅烷对盖玻片进行包被。在洁净的超净工作台中，将一张盖玻片平放在表面。

在盖玻片的上边缘小心滴加60微升PEG溶液，然后将另一张盖玻片覆盖其上，利用毛细作用使溶液在两张盖玻片之间均匀展开，确保不产生气泡。对另外两对盖玻片重复上述步骤。将这些盖玻片置于装有水的空枪头盒中，在避光条件下孵育3小时。

三小时后，将盖玻片分开，依次用三个坩埚中的水冲洗，并用干燥的氮气流吹扫。将尖锐的移液器头穿过载玻片上的孔，直至紧密贴合。刮去尖端部分，使其与玻璃表面完全齐平，然后裁剪带有通道图案的双面胶带。

将盖玻片平的一面粘贴到玻璃载片上。将涂覆面朝内的镀膜盖玻片粘贴到双面胶带上，并按压使其与样品室形成紧密密封。打开计算机和显微镜开关。

启动激光控制界面并打开激光器。按下激光控制盒上的启用按钮，使激光器预热。打开相机，然后启动显微镜配套软件程序。

关闭上部快门并打开光源。通过将10微升5%吐温-20加入1毫升TAM10缓冲液中，配制含吐温的TAM10溶液。准备脱氧溶液：在小型微量离心管中称取3毫克葡萄糖氧化酶，并加入45微升过氧化氢酶。

轻轻涡旋混匀试管以溶解固体。在微量离心机中以20,000 × g离心一分钟，取上清液。根据文稿中的说明，配制30%葡萄糖溶液、200毫摩尔的Trolox溶液以及0.5毫克/毫升的链霉亲和素溶液。

向物镜上添加一滴成像油。将样品腔室置于物镜上。向腔室内加入10 µL链霉亲和素溶液，静置一分钟。

用含 Tween 缓冲液的 TAM10 洗涤样品室，每次使用 30 微升，并用折叠的滤纸收集流出液。洗涤后等待一分钟。用含 Tween 缓冲液的 TAM10 将核糖体复合物 PRE 或 POST 稀释至 10–15 纳摩尔浓度。

将20微升核糖体样品加入通道中，静置两分钟。使用50微升TAM10缓冲液，以及各0.5微升的脱氧葡萄糖和Trolox溶液配制成成像缓冲液。充分混匀。

用 30 毫升成像缓冲液冲洗样品室。设置相机以开始采集图像。打开上方快门，关闭光源。

启动相机采集，并将图像分开展示为三个窗口，分别代表两个独立相机和叠加图像。在“采集”菜单下，选择“捕获时间序列”，然后点击“自动捕获”。设置适当的文件名、文件路径以及循环次数，然后点击“立即运行”。

图像采集完成后关闭弹出窗口，然后打开已获取的 ND 文件。点击 ROI，选择简单 ROI 编辑器，并选择圆形选项。在图像上选定 ROI 区域，完成后点击完成。

单击测量，时间测量，以图表或电子表格形式显示数据。打开导出选项卡以设置导出参数，然后单击导出以保存强度值。最后，使用合适的应用程序打开已导出的文件。

L27标记残基到A位或P位tRNA的距离分别为61或52埃，对应的FRET效率为0.47和0.65。从供体和受体通道获取荧光强度，并以时间序列形式绘图。供体漂白后，两条曲线均趋近于基线，因为受体上无法直接发生激发。

受体漂白后，供体荧光强度增加，因为更少的反应途径消耗了激发能。单个核糖体表现出不同的波动，这是由于tRNA的摆动运动导致其与L27之间的距离发生变化。其他方法如嘌呤霉素实验、实验、阻滞测序实验和质谱分析可与单分子FRET方法相互补充，揭示更多关于蛋白质合成的细节。

单分子FRET具有广泛的应用，因为许多生物过程发生在纳米尺度和毫秒时间范围内。通过在适当位置标记合适的染料，可以揭示更多动态过程。