Name: 多模相变化波菲林液滴的合成和特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习多模相变化波菲林液滴的合成与表征方法，通过冷却和旋转将微气泡冷凝为液滴，无需加压。该技术在神经科学、生物物理学和材料科学领域具有重要应用价值。

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作者感谢 Brandon Helfield 博士在构建气体交换器方面提供的帮助，以及 Miffy Hok Yan Cheng 博士在技术问题上的讨论。作者感谢以下资助来源：安大略省研究生奖学金、加拿大卫生研究院、特里·福克斯研究所和玛格丽特公主癌症基金会。

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作者无任何利益冲突需要披露。

将所有脂质组分加入后（步骤 1.2 和 1.4.5，图 1A），加入氯仿和甲醇溶液（如果存在如 DSPA 等磷脂酸类脂质，则还需加入水），以确保 Pyro-脂质与非 Pyro-脂质组分充分均质化（步骤 1.5， 图 1B）。为防止形成脂质组成不均一的脂质体，将溶解的脂质进行干燥，并在小瓶内壁上形成一层均匀的薄膜（图 1C）。该成膜过程（步骤 1.6）还可增加干燥脂膜的表面积，从而有利于后续水化步骤的进行（步骤 2.1 至 2.4）。干燥（步骤 1.6，图 1C）和真空处理（步骤 1.8，图 1D）的目的是确保氯仿和甲醇完全蒸发，因为这些化学物质可能干扰微泡的形成。尽管该方案可按比例缩小至制备低至 1 mL 的脂质溶液，但使用较大体积有助于减少不同小瓶之间的差异。虽然未使用时可能存在 Pyro-SPC 降解的风险，但脂质溶液的储存条件（步骤 2.9 至 2.10）旨在降低该风险。使用气体交换器进行脱气的步骤（步骤 2.9.2，图 1F 和 图 2）旨在尽可能去除氧气，以防止氧化反应的发生。不建议在大气气体仍溶解于溶液中时储存含卟啉-脂质的脂质溶液（图 1E）。
在步骤2.10中，脂质溶液置于带有加压顶空的血清瓶中，类似于临床批准的超声造影剂全氟丁烷脂质微球的销售形式（见图1F）。内部研究表明，若瓶盖为橡胶塞等软质材料，在存在Pyro-脂质的情况下，无法通过机械震荡生成稳定的微泡。因此，将脂质溶液转移至带有非橡胶酚醛盖的样品瓶中（步骤4.1至4.4，图3A和3B）。当十氟丁烷气体通入样品瓶（步骤4.1至4.4）时，密度更高的十氟丁烷应能置换样品瓶顶空中的大气。目前尚不清楚Pyro-脂质为何无法在使用橡胶塞时形成微泡。在不含Pyro-脂质的情况下，可直接在带橡胶塞的血清瓶中制备稳定的微泡4,7。因此，建议对不含Pyro-脂质的配方使用气体交换装置对血清瓶进行脱气和重新加压，然后直接震荡血清瓶本身4,5,6,7（参见&#34;其他方案与数据&#34;）。能够在血清瓶中直接进行机械震荡的优势在于，可通过将血清瓶倒置实现顶空加压和微泡尺寸筛选8。在本方案中，0% Pyro-脂质配方也被转移至样品瓶（步骤4.1至4.4），以保持与含Pyro-脂质配方操作的一致性。此外，较长的酰基链脂质由于具有更强的范德华相互作用，可形成更稳定的液滴19。脂质壳的组成选择基于市售可得的材料，所有脂质类型均采用18碳酰基链长度。所有配方中均加入了DSPE-PEG5K（步骤1.1），因为聚乙二醇链的存在可通过排斥性空间位阻防止结构融合19。在脂质水化过程中，水浴超声仪的温度设定为70 °C（步骤2.1），该温度足以完全分散18碳酰基链长度的脂质膜18。对于更长的酰基链，需要更高的温度。
较高的焦卟啉脂质（Pyro-lipid）载量会增加光学吸收和荧光组分的浓度，这在某些需要最大化卟啉载量的应用中可能是有利的。然而，随着焦卟啉脂质含量的增加，可观察到的液滴浓度降低，而液滴直径增大（图4 和 Table 1）。这表明在光学荧光和吸收性能与液滴浓度及直径之间存在权衡。对于需要优先考虑小直径以通过微小渗漏血管实现 in vivo 聚集，或需要注射高浓度液滴的研究人员而言，增加焦卟啉脂质载量可能并不值得，因其会导致液滴直径增大或液滴浓度下降。如果高液滴浓度和/或小液滴直径至关重要，则应考虑使用尺寸相似的其他伴随诊断试剂而非焦卟啉脂质。尽管含1%焦卟啉脂质的液滴未导致浓度降低或尺寸增大，但1%的载量可能过低，难以从组织背景荧光中可靠地检测。然而，卟啉基团的结构灵活性提供了多种功能化选择，可实现更适合低浓度应用的其他定量手段。例如，焦卟啉脂质可螯合铜-64用于正电子发射断层成像和γ计数20，或螯合钯用于质谱法进行痕量金属定量，或螯合锰用于磁共振成像14。
尽管某些实验可能仅需少量液滴溶液，但填充1.85 mL样品瓶需要1 mL脂质溶液。Goertz等人证明，操作方式、顶空压力、液气比甚至瓶体形状的改变均会影响微泡的数量分布17。振荡和尺寸筛选过程中瓶体的温度也会影响粒径分布。因此，对于经终端用户优化的方法，在制备液滴时必须尽可能保持操作的一致性。未开启的液滴可冷冻（-20 °C）并在后续使用时解冻，但这会影响粒径分布。
将脂质溶液激活为微泡的震荡过程并不能产生形态均一的微泡群体（步骤 4.6）；相反，样品中包含微泡、多层囊泡、脂质体和胶束18,21,22。尽管微泡的尺寸分布在微米和纳米范围内，其他结构的尺寸大多小于 800 nm23。所使用的粒径检测技术无法区分这些不同结构，因此震荡后的微泡样品（步骤 4.6，图 3C）和冷凝后的液滴样品（步骤 4.14，图 3F）必须被视为混合物。超声不敏感的组装结构（多层囊泡、脂质体和胶束）在冷凝后可能得以保留，且由于其不具备可相变的核心，尺寸不会发生变化。由于库尔特计数器无法区分这些不同的超分子组装体，因此对冷凝后群体尺寸变化的解读应基于以下假设：部分纳米级结构不可转化，并会贡献于该尺寸区域所观测到的群体信号。此外，这些结构也会影响样品的光谱和荧光特征14。胶束、脂质体/囊泡和液滴的荧光与吸收特征均相似，包括其荧光猝灭程度14。因此，必须注意到图 3C 至 3F、图 4、图 5 中 PBS 稀释的样品以及图 6 中 PBS 稀释的样品均含有多种组装体的混合物。
在尺寸筛选后、凝聚前（步骤4.9），可通过离心微泡样品，根据浮力差异分离出具有浮力的微泡与无浮力的聚集体，从而去除非气泡状聚集体，具体方法如Feshitan等所述。21 分离程度可通过调节离心力和持续时间来控制。然而，对经尺寸分离后样品进行的微泡冷凝实验表明，采用尺寸分离方法筛选出的较大前体微泡群体可产生更大的液滴（见 &#34;其他方案与数据&#34; 步骤S5用于纺丝后气泡和液滴的尺寸测定）。由于本方案生成的液滴尺寸远小于微泡，其预期应用之一是作为可通过被动渗出并在靶部位积聚的递送平台4,8，希望获得尽可能小的液滴群体。因此，本方案使用了经震荡后的微泡样品，且未通过离心进行尺寸分离，即使这意味着最终溶液中可能含有对超声不敏感的胶束、脂质体和囊泡。这确实意味着生物分布的定量分析将包含所有注射结构的信号，并不仅限于液滴。然而，由于这些尺寸相似的结构最可能通过主要由尺寸决定的被动机制积累，因此预计不会影响利用该平台所能得出的主要推论 体内尽管所有这些方面都应根据该平台可能应用的具体情境分别予以考虑。可通过设置含超声与不含超声的实验组进行对照测试，以确认任何生物分布的变化均由超声敏感性液滴引起，因为溶液中仅全氟碳核心聚集体对超声产生响应。
振荡后，将小瓶静置15分钟，观察到瓶内出现分层现象（图3C 与 3D 对比）。通过浮力进行尺寸筛选是一种简单的方法，可从活化的微泡溶液中去除较大的结构或气泡8,17。&#160;在本实验中，经过尺寸筛选后，直径大于5 µm的颗粒大部分被去除（图4）。通过调节尺寸筛选的时间，可调控尺寸筛选的程度17。Sheeran 等人已证明，若不进行尺寸筛选，所产生的微泡可能导致血管阻塞8。
全氟碳化合物的优点在于其生物学惰性7。尽管十氟丁烷的沸点为 -1.7 °C，高于体温，但在暴露于 37 °C 时，液滴并不会立即汽化（图 7B）。由于这些液滴在 37 °C 下处于亚稳态，因此需要额外的声学能量才能使其汽化为微泡7,9。Poproski 等人已通过加压方式实现了卟啉液滴的冷凝22。当使用密度较低的全氟碳化合物时，这是一种可行甚至必要的方法，但高压过程可能破坏部分气泡。八氟丙烷（C3F8）的沸点为 -36.7 °C，因此液滴冷凝需要同时进行冷却和加压。然而，较轻的全氟碳化合物会导致液滴稳定性降低。十二氟戊烷（C5F12）的沸点为 28 °C，可形成更稳定的液滴。但其在室温下为液态，需要更强的声学能量才能实现汽化。因此，超声造影剂中所含气体的选择，除了考虑制备参数外，还应结合其预期生物学应用的具体条件进行权衡。在本实验方案中，用于冷凝的异丙醇浴温度设定为 -15 至 -17 °C（步骤 4.7.1 和步骤 4.13），而其他方案则使用了 -10 °C 5,6。即使采用相同的十氟丁烷核心，冷凝温度也可能因辅料组成、总脂质浓度以及脂质壳组成的不同而有所变化。若使用其他配方，可能需要进行优化，以确保液滴充分冷凝的同时避免溶液冻结。
由于这些液滴比其微泡前体更小且更稳定7，因此能够更有效地利用被动蓄积机制渗出至特定目标组织，例如某些肿瘤类型的增强渗透性和滞留效应4,24。结合荧光、光学吸收以及声学检测方法14，可利用单一制剂对摄取量进行定量分析。此外，该平台还可用于研究液滴的声致相变是否能够使递送的试剂比例超过被动递送水平16。为了在注射后定量分析试剂在目标组织和器官中的生物分布，应向动物体内注射已知剂量的Pyro-脂质液滴，根据对照组设置决定是否施加超声，动物应在预设的时间点被处死，并取出器官称重。随后将器官组织匀浆、过滤，并用表面活性剂（去垢剂）稀释以实现去细胞化处理，最后通过荧光或紫外-可见光光谱法对Pyro信号进行定量，计算各器官单位质量所含注射剂量的百分比。在步骤5.4.5（图5）和步骤5.5.5（图6）中，使用了Triton X-100表面活性剂（去垢剂）来破坏样品，因其在410 nm处无荧光，且其吸收波长与Pyro的吸收波长无重叠。
未使用紫外-可见光吸收对微泡进行表征。由于紫外-可见分光光度计的激光源与检测器处于平行位置，任何较大的气泡都可能将光线散射出检测器范围，导致其表现出更高的光学吸收性14。与紫外-可见分光光度计不同，荧光分光光度计的检测器应与激光源呈垂直排列，以防止光源对检测器造成干扰。本研究使用紫外-可见光谱法测定完整和破坏后的液滴样品的吸光度（步骤5.4，图5）。选择300至800 nm作为吸光度检测波长范围，因为焦脱镁叶绿酸脂（pyro-lipid）的两个主要吸收带——Soret带（340至500 nm）和Q带（640至730 nm）——均位于该范围内14。当焦脱镁叶绿酸脂组装成液滴（或其他超分子结构）时，其Q带吸收峰从671 nm红移至700 nm（图5）。当该超分子结构被Triton等表面活性剂破坏时，吸收峰又回移至671 nm14,15。根据这一峰位移动，可判断焦脱镁叶绿酸脂处于组装状态还是解离状态。两个吸收峰的比值可用于估算超分子组装体随时间的降解程度。
对于荧光测量（步骤 5.5，图 6），选择 410 nm 的激发波长，因为该波长对应于未组装 Pyro-lipid14 的 Soret 带峰值。发射波长范围选定为 600 至 800 nm，因为完整组装体在 PBS 中以及在 Triton 中解聚的 Pyro-lipid 的荧光峰均位于此范围内。完整样品（PBS 中 704 nm）与解聚样品（Triton 中 674 nm）之间出现的荧光红移和增强（图 6）是由于结构诱导的荧光淬灭所致。在组装状态下，Pyro-lipid 分子紧密堆积，导致生成的光子被邻近的 Pyro-lipid 分子吸收。这一点在完整与解聚状态下的淬灭效率对比中表现明显。因此，必须将样品稀释于表面活性剂（如 1% Triton X-100）中，以解除淬灭效应，从而最大化生物分布定量时的信号强度14。
为简化操作，使用同一线性阵列超声换能器进行液滴汽化与成像（步骤 6.5 和 6.7，图7）。该超声换能器（材料表）能够达到汽化液滴所需的足够峰值负压8。将自来水中的去离子水注入水箱时，会产生溶解于水中的气体（步骤 6.1）。为尽量减少水中溶解气体对液滴汽化和成像的干扰，将水在水箱中静置 24 小时，使水中气体与大气达到平衡（步骤 6.1）。或者，也可使用足够大且可密封的容器连接足够强的真空泵对去离子水进行脱气处理。超声图像显示，液滴成功发生了冷凝，在低压力下无法观察到液滴或表现为无回声（图7B）。只有在较高输出压力下，液滴才汽化为可观察到的、具有回声特性的微泡（图7D、7F、7H）。尽管冷凝后的液滴样品中含有胶束以及脂质体/囊泡，但这些结构均无回声特性，只有液滴可汽化为具有回声的微泡。通过向模体中灌注 PBS 对照液以获取基线图像（图7A、7C、7E、7G）。随着 PBS 中压力升高，并未产生任何对比信号。这表明仅靠换能器产生的高压不足以在水性介质中引发自发性空化，因此所有其他产生的对比信号均可归因于所使用的超声造影剂。若输出压力过高，生成的微泡可能被破坏。通过逐步增加压力并观察所产生的对比信号，可确定最佳压力值8。类似地，可通过在特定时间间隔汽化液滴并观察随时间变化的对比信号强度，来测定液滴的循环半衰期7。
综上所述，采用冷凝法制备了具有不同Pyro-lipid含量的多模态相变液滴。粒径分析显示，Pyro-lipid载量与微泡/液滴浓度之间存在权衡关系。表征结果显示，完整态与破裂态在吸收光谱和荧光特性方面均存在差异。超声成像表明，这些液滴在37 °C时无回声信号，但在足够高的压力下可被汽化为具有回声信号的微泡。表征结果还表明，Pyro-lipid液滴有望替代伴随诊断试剂，用于液滴生物分布或蓄积试验。后续研究将探讨溶液中汽化阈值、溶液稳定性以及在裸鼠体内的in vivo循环时间。

超声成像是一种利用声波的非侵入性、非电离型医学成像技术。尽管超声扫描仪具有更高的便携性并能提供实时图像，但超声成像可能存在对比度低的问题，使得超声医师难以可靠地区分回声特性相似的病理特征。为克服这一局限，可向机体注射微泡以提高血管对比度。微泡是一种微米级的充气型对比剂，对声波具有高度回声性，可显著增强血管对比度1,2。微泡的外壳和气体核心可根据不同应用需求进行设计，例如用于成像、溶栓、细胞膜通透性增强或短暂性血管开放2。
微泡的一个缺点是其血液循环半衰期较短。例如，临床上可用的全氟丁烷脂质微球的半衰期仅为1.3分钟3。对于长时间的成像过程，需要多次注射微泡。微泡的另一个缺点是其直径较大。尽管全氟丁烷脂质微球的直径约为1至3 µm，足够小以在血管系统中循环，但它们仍过大，无法外渗并被动积聚到目标组织（如肿瘤）中4。克服这些局限性的一种策略是将气核微泡压缩为更小的液核液滴5,6。虽然液滴在其液态下不具备回声特性，但当暴露于足够高峰值负压的超声波时，可被汽化为微泡，从而恢复其产生对比的能力。这种方法使得液滴能够利用小尺寸液核更优越的药代动力学特性&#160;，同时在受到超声辐照时仍能提供对比效果，且不改变其化学组成4,7。
全氟丁烷是一种理想的全氟碳化合物，可在气态与液态之间发生相变5,6,7。全氟丁烷仅需降低温度即可使微泡冷凝成液滴，而密度较低的全氟碳化合物则需要额外加压5。这种温和的方法可在冷凝过程中最大限度地减少微泡的破坏7,8,9。由于液滴核心呈液态，因此无回声性，在超声下不可见。然而，当施加足够的声能或热能时，液态核心可再次汽化为气态，形成具有回声性的微泡8。这种汽化过程使得微泡的生成时间和空间位置得以控制。
虽然液滴适用于被动富集， 原位 汽化，或提高细胞通透性4液滴（及其碎片）无法被成像或定量 离体因此，可量化的伴随诊断试剂，例如荧光4,10,11，磁性&#160;颗粒12，光吸收剂13，被用作模拟物以评估液滴向目标组织的递送情况。例如，Helfield 等人采用荧光纳米微珠共注射方法，对小鼠器官的组织学图像进行定量分析&#160;因为无法通过荧光检测到液滴4伴随诊断试剂的缺点在于，可追踪组分可能根据其自身的药代动力学特征独立于液滴发挥作用。
幸运的是，微泡和液滴的外壳可以进行定制。例如，Huynh 等人展示了具有卟啉-脂质外壳的超声造影剂，从而制备出多模态微泡14。卟啉是一类具有芳香族大环结构的有机化合物14,15。它们具有光吸收性、荧光性，并可与多种金属螯合，用于放射治疗、基于放射性核素的成像或基于痕量金属的定量分析14。一种典型的卟啉是焦脱镁叶绿酸（pyropheophorbide, Pyro）。通过将 Pyro 与脂质偶联，并将 Pyro-脂质整合到微泡或液滴中，可实现通过多种模式对其进行成像和追踪：声学、荧光以及吸收光谱14。这种多模态造影剂可用于追踪和定量其富集情况。由于可定量组分已直接偶联在外壳上，因此可无需额外的伴随诊断试剂，从而实现更精确的递送定量16。
本文概述了一种制备多模态相变卟啉液滴的实验方案。由于超声造影剂可作为将药物递送至特定组织（如肿瘤）的平台，2,4，将其检测范围扩展到超声之外可能有助于量化递送效率。这些液滴的目的是提供可追踪的超声造影剂，能够被动富集 体内, 原位 汽化与声学，以及定量分析生物分布或累积的潜力 离体 无需依赖次级传感器即可实现器官定位。文中还概述了表征方法，以展示卟啉液滴作为生物分布传感器的潜力。同时讨论了壳层中吡咯脂质负载量（摩尔比0%至50%）的影响。

<table><tbody><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]（铵盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880220</td><td>又称 &quot;DSPE-PEG5K&quot;</td></tr><tr><td>1-十八烷酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>855775</td><td>又称 &quot;DSPC&quot;</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝制密封盖，可撕型</td><td>VWR</td><td>16171-840</td><td>标准铝，13 mm 外径</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>任何品牌</td><td></td><td>能够&amp;nbsp; 超声处理并加热至70 &amp;deg;C,</td></tr><tr><td>Bio-Stor 螺口瓶</td><td>国家科学</td><td>BS20NABP</td><td>塑料，2 mL 带裙边，带O型圈</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃透明血清瓶</td><td>VWR</td><td>16171-285</td><td>3 mL，内口直径 7 mm，外口直径 13 mm</td></tr><tr><td>带酚醛树脂螺旋盖的硼硅酸盐玻璃样品瓶</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>1.85 mL，短型，外径 12 mm，高度 35 mm，8-425 盖帽规格</td></tr><tr><td>带螺口盖的硼硅酸盐玻璃小瓶</td><td>任何品牌</td><td></td><td>尺寸将取决于所需的体积</td></tr><tr><td>氯仿&amp;nbsp;</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>库尔特计数器电解质稀释液</td><td>任何品牌</td><td></td><td>与库尔特计数器兼容</td></tr><tr><td>十氟丁烷（C4F10）</td><td>FluoroMed</td><td>355-25-9</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰（二氧化碳）</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>动态光散射（DLS）粒径分析仪</td><td>任何品牌</td><td></td><td>具备温度控制功能</td></tr><tr><td>E-Z Crimper，13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225302</td><td>13 mm 标准铝制封口膜</td></tr><tr><td>E-Z Decapper，13 mm</td><td>Wheaton</td><td>W225352</td><td>13 mm 标准铝制封口膜</td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>任何品牌</td><td></td><td>可检测400至600 nm激发光及300至800 nm发射光，检测器位于激光源垂直方向</td></tr><tr><td>荧光分光光度计兼容比色皿</td><td>任何品牌</td><td></td><td>可容纳至少 2 mL，适用于 300 至 800 nm，四面透光&amp;nbsp; 光学窗口&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气体交换器</td><td>自制</td><td></td><td>参见补充信息 - &quot;其他方案与数据&quot; 有关组装说明。</td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>任何品牌</td><td></td><td>尺寸将取决于所需的体积</td></tr><tr><td>GLWR 定制孔径管 10 μm</td><td>贝克曼库尔特</td><td>B42812</td><td>10 &amp;micro;m孔径，适用于Beckman Coulter MultiSizer 4e</td></tr><tr><td>甘油</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带盖绝缘泡沫塑料容器</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻干式橡胶塞</td><td>VWR</td><td>71000-060</td><td>内径7 mm，外径13 mm，双翼，氯化丁基橡胶塞</td></tr><tr><td>膜片式真空泵</td><td>赛多利斯斯泰迪姆</td><td>16694-1-60-06</td><td>可调节压力</td></tr><tr><td>金属镊子</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 21 MHz 线阵超声探头</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>21 MHz，支持B模式和非线性成像。</td></tr><tr><td>MultiSizer 4e</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td>可测量粒径范围为 0.2&amp;micro;米到6 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 无菌一次性真空过滤装置</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>567-0010</td><td>聚醚砜（PES）膜，0.1&amp;mu;m孔径，1000 mL体积。由于Isoton II为非无菌溶液，滤器单元可多次使用</td></tr><tr><td>常规针头</td><td>BD</td><td>305176</td><td>20号，1.5英寸长度</td></tr><tr><td>氮气</td><td>任何品牌</td><td></td><td>确保有调节阀和管路来引导气流。具体装置设置将取决于品牌和来源。</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>任何品牌</td><td></td><td>称为 &quot;石蜡膜&quot; 在方案中。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>任何品牌</td><td></td><td>1X，pH 7.4</td></tr><tr><td>移液器</td><td>任何品牌</td><td></td><td>尺寸将取决于所需的体积</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>任何品牌</td><td></td><td>尺寸将取决于所需的体积</td></tr><tr><td>塑料注射器</td><td>任何品牌</td><td></td><td>1 mL、3 mL 和 30 mL，带鲁尔锁扣连接</td></tr><tr><td>聚醚砜（PES）膜滤器</td><td>任何品牌</td><td></td><td>0.2 &amp;micro;m 孔径大小</td></tr><tr><td>丙二醇</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>原卟啉-叶绿酸a共轭的1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>自制</td><td></td><td>又称 &quot;Pyro-SPC&quot;。参见 &quot;补充信息——其他实验方案与数据&quot; 用于合成。</td></tr><tr><td>温度计</td><td>任何品牌</td><td></td><td>-20 至 100 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>任何品牌</td><td></td><td>又称 &quot;2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇&quot;</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>任何品牌</td><td></td><td>1型纯度</td></tr><tr><td>紫外线&amp;ndash;可见光（紫外-可见）分光光度计</td><td>任何品牌</td><td></td><td>可检测 300 至 800 nm 范围内的吸光度，分辨率至少为 0.5 nm</td></tr><tr><td>紫外线&amp;ndash;兼容紫外-可见（UV-Vis）分光光度计的比色皿，1 cm 光程长度</td><td>任何品牌</td><td></td><td>可容纳至少 2 mL，适用于 300 至 800 nm 范围</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 超声成像平台</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>临床前超声成像系统</td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>百时美施贵宝</td><td></td><td>称为 &quot;机械搅拌器&quot; 在方案中。振荡45秒。</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

多模态相变卟啉液滴的合成与表征

Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

相变液滴是一类可转化为具有回声特性的微泡的超声造影剂 原位 通过施加足够的声能，液滴的尺寸比微泡更小且更稳定。然而，传统的超声造影剂无法通过声学反馈测量以外的手段进行追踪，这使得造影剂的生物分布或蓄积量难以定量 离体 困难。研究人员可能不得不依赖荧光或光学吸收型伴随诊断颗粒来推断生物分布情况。本实验方案的目的是详细描述采用冷凝法制备多模态相变卟啉液滴的步骤。卟啉是一类具有独特吸收带的荧光分子，可共价连接至脂质并整合入液滴中，从而扩展液滴的多功能性，在保留声学特性的同时实现更可靠的生物分布。本研究制备了七种不同卟啉脂质与基础脂质含量的配方，以研究微泡和液滴的粒径分布。方案中还描述了适用于含卟啉结构的表征方法，以展示其在溶液中的分析多功能性。粒径分析显示，冷凝后液滴的平均直径比前体群体小1.72至2.38倍。吸收光谱表征显示，完整组装体的Q带峰值为700 nm，而破裂样品的吸收峰位于671 nm。荧光表征显示，含30%卟啉脂质的完整组装体呈现荧光淬灭（&gt;97%），并在破坏后实现荧光恢复。声致爆破实验表明，卟啉液滴在较低压力下无回声信号，但在足够高的压力下可转化为具有回声信号的微泡。这些表征结果表明，卟啉液滴有望消除在递送或治疗应用中依赖吸收光或荧光检测的伴随诊断策略，以量化超声造影剂体内分布的需求。 体内 或 离体.

对预冷凝、经尺寸筛选的微泡样品（n = 3）和冷凝后的液滴样品（n = 3）使用孔径为10 µm的库尔特计数器（CC）进行粒径分析。10 µm孔径的一个局限性是无法测量小于200 nm的颗粒，这可能导致平均粒径和浓度出现偏差。图4展示了各Pyro-lipid含量配方的粒径分析数据。表1列出了基于粒径分析数据的统计结果。通过比较冷凝前后平均直径的比值，结果显示0% Pyro-lipid配方的平均直径变化最小，为1.72 ± 0.02；50% Pyro-lipid配方的平均直径变化最大，为2.38 ± 0.08。1% Pyro-lipid液滴样品的浓度最高，达到(2.71 ± 0.13) × 1010 /mL，而40% Pyro-lipid液滴样品的浓度最低，为(7.36 ± 0.81) × 109 /mL。粒径分析数据显示，10% Pyro-lipid液滴样品的峰值粒径最小，为261 ± 13 nm，而50% Pyro-lipid液滴样品的峰值粒径最大，为390 ± 55 nm。总体趋势显示，随着Pyro-lipid含量的增加，样品浓度降低而平均直径增大。由于冷凝后的样品基于前体微泡样品，该趋势在两类超声造影剂中均存在。随着Pyro-lipid含量的增加，开始出现一个微泡亚群（峰值粒径约为2000 µm）。该次级峰在0% Pyro-lipid微泡样品中未出现，而在40%和50% Pyro-lipid样品中最为明显。
图5 展示了30% Pyro-脂质液滴样品的代表性吸光度测量结果。完整样品在PBS中的吸收峰为700 nm，而在Triton中破坏后的样品吸收峰则移至671 nm。这表明完整的组装结构与单独的、未组装的脂质组分具有不同的光学特性。
图6A 显示了预凝聚微泡样品的代表性荧光测量结果，而 图6B 显示了含30% Pyro-lipid的凝聚后液滴样品。在PBS中，完整样品的荧光峰位于704 nm，而破坏后的形式峰位于674 nm。将完整曲线下的面积减去破坏后曲线下的面积，再将差值除以破坏后曲线下的面积，即可得到淬灭效率，对于含30% Pyro-lipid的微泡样品和液滴样品，其淬灭效率分别为98.61%和98.07%。
为了展示液滴转化为微泡的过程，使用超声系统在37 °C的流动体模中对稀释后的液滴进行成像并诱导其发生汽化。图7展示了在不同压力下成像的30% Pyro-脂质液滴样品的代表性超声图像。在低压条件下（图7A），信号非常微弱，仅观察到因琼脂合成过程中残留的空气泡产生的背景信号。这是因为液滴本身无回声特性，不会散射超声波。当功率稍有升高时，出现了少量微泡（图7B），表现为明亮的斑点信号。随着压力进一步增加，生成的微泡数量也随之增多（图7C和7D）。该结果同时表明，在37 °C条件下，液滴不会发生自发汽化。
<img alt="密封小瓶中的化学过程阶段；用于合成实验分析的溶液瓶（A-F）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：制备30% Pyro-脂质溶液的各步骤图像。A) 脂质粉末与Pyro-SPC溶于氯仿中。B) 加入溶解溶液。C) 脂质薄膜干燥并附着于小瓶内壁。D) 用铝箔包裹脂质小瓶（外层铝箔用胶带固定以便重复使用）。E) 水合后的脂质溶液。F) 血清小瓶中的脂质溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="真空与气体歧管系统示意图，显示用于气体传输装置的阀门和隔膜泵。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：10通道气体交换歧管系统。 协议中提到的阀门已在图中标注。有关气体交换装置的组装说明，请参见补充文件“其他协议与数据”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="溶解度实验中不同浓度的小瓶，显示液体颜色变化和沉淀。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3： A) 7种配方（0% 至 50% Pyro-SPC）的脂质溶液在样品小瓶中的状态。B 至 D 图显示了制备30% Pyro-脂质液滴各步骤的图像。B) 样品小瓶中的30% Pyro-脂质溶液。C) 振荡后。D) 尺寸筛选15分钟后。E) 下层分离物转移至十氟丁烷小瓶中。F) 冷凝后。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="气泡和液滴浓度图；直径与浓度分析的柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：不同Pyro-脂质壳含量（n = 3）的尺寸筛选微泡和液滴样品的库尔特计数器（CC）粒径数据。实绿色线代表微泡，虚青色线代表液滴。A) 0% Pyro-SPC。B) 1% Pyro-SPC。C) 10% Pyro-SPC。D) 20% Pyro-SPC。E) 30% Pyro-SPC。F) 40% Pyro-SPC。G) 50% Pyro-SPC。H) 基于壳中Pyro-SPC含量，库尔特计数器测得的微泡和液滴样品的总观测浓度。所有误差线表示标准偏差。所有测量均使用10 µm孔径进行，其尺寸检测范围为200 nm至6000 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="吸收光谱图；比较Triton、PBS与Pyro液滴；在430 nm和700 nm处有吸收峰" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：用PBS和1% Triton稀释后的冷凝后30% Pyro-脂质液滴样品在300至800 nm范围内的典型紫外-可见（UV-Vis）光谱吸收测量结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光光谱图；焦磷酸盐气泡/液滴，Triton/PBS；波长，强度，比较图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：在410 nm激发下，600至750 nm范围内的代表性荧光发射。A经尺寸筛选的、预先浓缩的含30%焦磷酸脂质微泡样品，分别置于PBS和1% Triton中。 B在 PBS 和 1% Triton 中的浓缩后 30% 焦磷酸脂质滴样本 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="动态流分析示意图，PBS中的Pyro液滴，压力变化范围为0.73至4.36 MPa。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：使用临床前21 MHz线性阵列换能器在B模式下获取的37 °C琼脂流动体模的代表性超声图像（参见材料表）。 左侧一列（图A、C、E、&amp;G）显示PBS对照组。右侧一列（图B、D、F、&amp;H）显示将20 µL冷凝后的30% Pyro-脂质液滴样品稀释至50 mL、37 °C的PBS中。每一行代表自由场峰值负压，该值根据Sheeran等人的研究估算得出8。黄色三角形指示焦点深度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>方法</td>
			<td>试剂</td>
			<td>热解壳层 %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Bubbles</td>
			<td>浓度 [/mL]</td>
			<td>(2.76 ± 0.28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1.91 ± 0.22) × 10^10</td>
			<td>(1.47 ± 0.05) × 10^10</td>
			<td>(8.47 ± 0.95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0.15) × 10^9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Bubbles</td>
			<td>峰值 [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Bubbles</td>
			<td>平均值 [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Bubbles</td>
			<td>中位数 [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Droplets</td>
			<td>浓度 [/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.75 ± 0.18) × 10^10</td>
			<td>(1.72 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Droplets</td>
			<td>峰值 [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Droplets</td>
			<td>平均值 [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC</td>
			<td>Droplets</td>
			<td>中位数 [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5 </td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过库尔特计数器（CC）测得的不同Pyro-SPC含量的微泡和液滴样品的粒径数据统计（n = 3）。所有误差均表示标准偏差。
补充信息 - 脂质分子式表： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充信息 - 其他实验方案与数据： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary_Information-Other_Protocols_and_Data.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案概述了多模态相变卟啉液滴的合成与表征方法。

相变液滴是一类超声造影剂，可在施加足够强度的超声波后原位转化为具有回声特性的微泡。

本方案具有重要意义，因为它提供了从脂质膜到脂质溶液、再到微泡、最终形成液滴的完整制备流程。该技术的主要优势在于将微泡浓缩为液滴的过程极为简便，仅需冷却和涡旋，无需加压即可生成液滴。视觉演示至关重要，因为检测微泡是否成功浓缩的一个简单方法就是通过肉眼观察其半透明性的变化。本实验操作由郑刚实验室的硕士研究生Kimoon Yoo进行示范。使用去盖器去除血清瓶上的铝封盖，然后将一毫升脂质溶液沿内壁缓慢流入一个带有酚醛螺帽的1.85毫升硼硅酸盐玻璃样品瓶中，注意避免产生气泡。使用1.85毫升样品瓶，准备通过气体交换装置将十氟丁烷气体通入样品瓶的顶空部分。确保气体交换装置上的所有阀门均已关闭，并且泵已关闭。打开歧管阀，小心地将歧管上对应的针头从保护套中取出。打开压力阀A和压力阀B，将气体钢瓶阀门逆时针旋转约1/16至1/8圈，使其部分开启。打开T型手柄阀，并取下装有脂质溶液的样品瓶盖。将歧管针置于样品瓶液面与空气交界处上方，缓慢顺时针调节空气调节阀，直至空气调节表指针从静止位置略微移动，使全氟碳化物气体缓慢通入样品瓶顶空30秒，注意避免产生气泡。如有必要，调节空气调节阀。30 秒后，小心而迅速地保持样品瓶稳定，避免过度移动样品瓶。需同时关注气体钢瓶阀门、T 型手柄阀门、空气调节阀、压力阀 A、压力阀 B 和歧管阀门。小心地将针头套上保护套，然后标记样品瓶，并顺时针方向用封口蜡膜密封瓶口。将样品瓶避光保存于4°C环境中，至少10分钟，最长可保存24小时。取约100克干冰放入一个保温容器中，另取常规冰块放入另一个保温容器中。取出先前准备好的全氟丁烷血清小瓶、1.5英寸20号针头、1毫升塑料注射器、200毫升容器、金属镊子和温度计。将含有脂质溶液的样品瓶放入机械振荡器中，振荡45秒。应观察到颜色和半透明度的变化。机械振荡后，将样品瓶正立放置，避光，并开始15分钟倒计时，以冷却样品瓶并筛选微泡。当倒计时至10分钟时，用金属镊子取干冰将约200毫升异丙醇冷却至零下20摄氏度。微泡筛选15分钟后，观察样品瓶内经尺寸筛选后的分层部分。保持样品瓶正立，小心打开瓶盖，用连接在1毫升塑料注射器上的1.5英寸20号针头吸取约0.7毫升的下层液体。确保不吸出上层液体，且不要轻弹注射器以排除气泡。将另一支20号针头对准氟代丁烷血清瓶橡胶塞上的中心圆圈插入，同时保持针头靠近血清瓶顶部以进行排气，然后将含有选定尺寸微泡的针头插入血清瓶中。缓慢转移经尺寸筛选的微泡。让液体沿全氟丁烷血清瓶的内壁轻轻流下。当所有经尺寸筛选的微泡溶液完成转移后，取下连接注射器的针头，但保留排气针以释放负压。向异丙醇浴中加入少量干冰或室温异丙醇，以确保浴液温度维持在负15至负17摄氏度之间。将带有20号排气针的血清瓶插入异丙醇浴中，保持微泡液面低于异丙醇液面，而瓶口部分高于异丙醇液面，并间歇性地旋转血清瓶两分钟，以使微泡凝聚。切勿在异丙醇中持续旋转血清瓶，且避免溶液冻结。轻轻旋转约五秒钟，然后将血清小瓶从异丙醇中取出。检查是否有冰核形成，随后继续在异丙醇中旋转。如果出现结冰现象，将血清小瓶在空气中轻轻旋转，直至冰晶消失。两分钟冷凝后，将血清小瓶从异丙醇浴中取出，并移除通气针。微气泡应已凝聚成液滴，可通过透光性的变化进行判断。擦拭血清小瓶，贴上标签，并置于避光的隔热容器内的普通冰上，直至使用前。只要及时更换融化的冰，带有完整铝封的未开封液滴可保持稳定长达六小时。准备使用时，用脱盖器移除铝封。使用本方案后，通过孔径为10微米的库尔特计数器对预冷凝、经尺寸筛选的微泡以及冷凝后的液滴进行粒径测定。显示了30%焦磷酸脂质制剂的粒径数据。此处展示了基于粒径数据的统计结果。通过比较浓缩前后平均直径的比值，结果显示，随着焦磷酸脂质含量的增加，浓度降低，平均直径增大。展示了含30%焦-脂质液滴样品的典型吸收测量结果。结果显示，完整的组装结构具有不同于单独未组装脂质组分的光学特性，这体现在不同的吸收峰上。此处还展示了含30%焦-脂质的预凝聚微泡和凝聚后液滴样品的典型荧光测量结果，表明完整样品与其破坏形式之间具有不同的荧光峰。展示了在不同压力下成像的30%吡咯-脂质液滴样品的代表性超声图像。在低压条件下，仅观察到来自琼脂合成过程中残留的气泡的背景信号。在稍高的功率下，产生了少量微泡，表现为亮斑点的出现。随着压力的增加，产生的微泡数量也更多。需要注意的是，此处的冷凝温度是针对这种特定的液滴壳层配方进行优化的。不同的壳层配方可能需要不同的温度。

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多模态相变卟啉液滴的合成与表征

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