无需梯度测定器或分馏系统的多聚体分析

该协议描述了如何生成多聚体图谱，该图谱揭示了有关细胞内核糖体活性的分子细节。该技术允许用户获得多聚体谱提供的有价值的信息，而多聚体谱无法访问自动梯度分级分离系统。在准备渐变时花点时间，并将渐变存储在一个位置，当它们进入线性渐变时，它们不会被压缩机或其他机械操作破坏。

首先，在蔗糖梯度缓冲液中制备7%和47%蔗糖的储备溶液。过滤器通过0.22微米过滤器对蔗糖储备溶液进行灭菌。通过分配并混合 7% 和 47% 的储备溶液，制备 14 毫升 17、27% 和 37% 蔗糖溶液。

将六个聚丙烯离心管放入全视图试管架中。确保管子之间有足够的空间，以便一个管子的动作不会干扰其他管子。将带有钝头的 9 英寸、22 号针头连接到 3 毫升注射器上，并进行测试填充和分配，以确保注射器可以在设置梯度之前容纳蔗糖溶液而不会滴落。

在每个离心管的底部加入两毫升7%蔗糖。然后，通过将针尖定位在管底附近，在 7% 溶液下方加入两毫升 17% 蔗糖。小心而缓慢地分配溶液。

用27%，37%和47%蔗糖溶液各两毫升重复该过程，确保每层都可以通过标记密度分离的线与另一层区分开来。将梯度在四摄氏度下储存过夜，使它们沉淀成连续的、增加百分比的蔗糖。在酵母，酿酒酵母细胞的生长和收获之后，将细胞重悬于冷冻的700微升多聚体提取缓冲液中。

加入100单位的RNA酶抑制剂。然后，加入 400 微升预冷玻璃珠，大小约为 425 至 600 微米。将混合物转移到装有玻璃珠的1.5毫升离心管中，并通过在打珠器中剧烈搅拌五分钟来破坏酵母细胞。

破碎细胞后，通过离心澄清裂解物。使用基于荧光的RNA检测系统，通过测量260纳米处的吸光度来确定澄清裂解物中RNA的浓度。确保RNA浓度为每微升0.5至1微克。

如果RNA浓度太低，请减少用于重悬细胞的提取缓冲液的体积。小心地将裂解物加载到梯度的顶部。将移液器吸头靠在聚丙烯管顶部的内壁上。

倾斜试管，将裂解物缓慢分配到梯度的顶部，滴在壁上。轻轻地将试管放入水平吊篮转子的预冷桶中，然后离心梯度。离心后，小心地从摆动桶转子上取下离心管，并将它们放入管架中。

标记96孔板以储存馏分并在冰上预冷。从梯度顶部开始收集 100 或 200 微升馏分，小心地将移液器吸头插入梯度顶部，并收集馏分直到整个梯度被等分。用分光光度计测量每个级分在254纳米处的吸光度，将7%和47%蔗糖溶液作为空白。

通过绘制分数数与吸光度的关系来创建多聚体谱图。显示了来自酿酒酵母的三种代表性多体谱。每个核糖体亚基和多聚体峰的嵴在每个轮廓上都很明显。

此处显示了自动密度分馏系统的代表性轮廓。该曲线由连续的吸光度曲线产生，因为蔗糖梯度被追逐溶液自下而上，通过检测器流通池并分馏收集。此处显示了手动分馏 200 和 100 μL 样品生成的多聚体谱图。

在此过程中要记住的最重要的事情是不要破坏梯度。注意不要通过过快分配溶液来引入气泡或破坏梯度。按照此过程，可以从梯度中提取RNA，以进行进一步分析，以确定与活性核糖体相关的mRNA