无需梯度测定器或分馏系统的多聚体分析
2021年6月1日
该协议描述了如何在不使用自动梯度制作器或梯度分级分离系统的情况下生成多聚体谱。
该协议描述了如何生成多聚体图谱，该图谱揭示了有关细胞内核糖体活性的分子细节。该技术允许用户获得多聚体谱提供的有价值的信息，而多聚体谱无法访问自动梯度分级分离系统。在准备渐变时花点时间，并将渐变存储在一个位置，当它们进入线性渐变时，它们不会被压缩机或其他机械操作破坏。
首先，在蔗糖梯度缓冲液中制备7%和47%蔗糖的储备溶液。过滤器通过0.22微米过滤器对蔗糖储备溶液进行灭菌。通过分配并混合 7% 和 47% 的储备溶液，制备 14 毫升 17、27% 和 37% 蔗糖溶液。
将六个聚丙烯离心管放入全视图试管架中。确保管子之间有足够的空间，以便一个管子的动作不会干扰其他管子。将带有钝头的 9 英寸、22 号针头连接到 3 毫升注射器上，并进行测试填充和分配，以确保注射器可以在设置梯度之前容纳蔗糖溶液而不会滴落。
在每个离心管的底部加入两毫升7%蔗糖。然后，通过将针尖定位在管底附近，在 7% 溶液下方加入两毫升 17% 蔗糖。小心而缓慢地分配溶液。
用27%，37%和47%蔗糖溶液各两毫升重复该过程，确保每层都可以通过标记密度分离的线与另一层区分开来。将梯度在四摄氏度下储存过夜，使它们沉淀成连续的、增加百分比的蔗糖。在酵母，酿酒酵母细胞的生长和收获之后，将细胞重悬于冷冻的700微升多聚体提取缓冲液中。
加入100单位的RNA酶抑制剂。然后，加入 400 微升预冷玻璃珠，大小约为 425 至 600 微米。将混合物转移到装有玻璃珠的1.5毫升离心管中，并通过在打珠器中剧烈搅拌五分钟来破坏酵母细胞。
破碎细胞后，通过离心澄清裂解物。使用基于荧光的RNA检测系统，通过测量260纳米处的吸光度来确定澄清裂解物中RNA的浓度。确保RNA浓度为每微升0.5至1微克。
如果RNA浓度太低，请减少用于重悬细胞的提取缓冲液的体积。小心地将裂解物加载到梯度的顶部。将移液器吸头靠在聚丙烯管顶部的内壁上。
倾斜试管，将裂解物缓慢分配到梯度的顶部，滴在壁上。轻轻地将试管放入水平吊篮转子的预冷桶中，然后离心梯度。离心后，小心地从摆动桶转子上取下离心管，并将它们放入管架中。
标记96孔板以储存馏分并在冰上预冷。从梯度顶部开始收集 100 或 200 微升馏分，小心地将移液器吸头插入梯度顶部，并收集馏分直到整个梯度被等分。用分光光度计测量每个级分在254纳米处的吸光度，将7%和47%蔗糖溶液作为空白。
通过绘制分数数与吸光度的关系来创建多聚体谱图。显示了来自酿酒酵母的三种代表性多体谱。每个核糖体亚基和多聚体峰的嵴在每个轮廓上都很明显。
此处显示了自动密度分馏系统的代表性轮廓。该曲线由连续的吸光度曲线产生，因为蔗糖梯度被追逐溶液自下而上，通过检测器流通池并分馏收集。此处显示了手动分馏 200 和 100 μL 样品生成的多聚体谱图。
在此过程中要记住的最重要的事情是不要破坏梯度。注意不要通过过快分配溶液来引入气泡或破坏梯度。按照此过程，可以从梯度中提取RNA，以进行进一步分析，以确定与活性核糖体相关的mRNA
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概述
本协议描述了如何生成多核糖体谱，揭示细胞内核糖体活动的分子细节。该技术允许用户在没有自动梯度分离系统的情况下获得有价值的信息。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 多核糖体谱分析对于理解核糖体活动至关重要。
- 它提供了关于翻译和基因表达的见解。
- 自动化系统并不总是对研究人员都可用。
- 本协议为梯度制备提供了一种替代方法。
研究目的
- 提供生成多核糖体谱的详细方法。
- 促进各种研究环境中的核糖体活动分析。
- 使没有自动化系统的研究人员能够执行此分析。
使用的方法
- 蔗糖梯度溶液的制备。
- 蔗糖母液的过滤。
- 不同蔗糖浓度的逐步混合。
- 保持梯度稳定的小心存储。
主要结果
- 成功生成线性蔗糖梯度。
- 能够在没有自动化系统的情况下分析核糖体活动。
- 提供了一种可靠的多核糖体谱分析方法。
- 对翻译的分子机制的洞察。
结论
- 本协议是研究人员的宝贵资源。
- 它使多核糖体谱分析技术的获取更加民主化。
- 进一步的研究可以在这种方法的基础上进行各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Polysome profiling enables mechanistic de-risking of target validation by revealing translational activity of specific mRNAs, supporting predictive confidence in early discovery. This protocol provides a cost-effective, reproducible method for generating ribosome profiles using standard laboratory equipment, expanding access to translational biomarker analysis in resource-constrained settings. It supports workflow positioning from hypothesis testing to lead identification by enabling quantitative assessment of ribosomal engagement without reliance on expensive fractionation systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying mRNAs actively engaged with ribosomes under experimental conditions.
- Operational Value: Enable functional target validation through direct measurement of translational output in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Support portfolio triage by correlating polysome shifts with pathway modulation and target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline translational profiles.
- Reproducibility: Generate consistent sucrose gradients without specialized equipment, ensuring reliable fractionation for comparative analysis.
- Quantitative Output: Measure absorbance at 254 nm to produce quantifiable polysome profiles enabling hit validation and dose-response assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Adapt the protocol to various cell types to study translational dysregulation in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Link target modulation to changes in ribosome profiling, reducing ambiguity in mechanism of action.
- Translational Continuity: Support biomarker alignment by extracting RNA from fractions to identify mRNAs associated with active ribosomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling ribosome profiling as a functional readout prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing which transcripts are translationally active, clarifying pathway involvement beyond transcriptional changes.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible gradient generation, allowing reliable comparison of compound effects on translational output.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (absorbance at 254 nm) that allow teams to compare ribosomal engagement across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling extraction of polysome-associated RNA for further analysis of translationally regulated biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for ribosomal activity analysis across projects, reducing dependency on centralized core facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct measurement of translational activity, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of gradient preparation using accessible laboratory equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement at the translational level.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on polysome profiling data, reducing late-stage biological risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in gradient preparation and careful handling to avoid disruption of sucrose layers.
- Needs access to swinging bucket rotor, spectrophotometer, and bead-beater for lysate preparation.
- Demands cross-team standardization in fraction collection and absorbance measurement protocols.
- Requires adaptation considerations when applying to mammalian or plant cell types due to differences in lysis and polysome stability.
- Practical limitation: Manual fractionation is lower throughput than automated systems, suited for validation rather than high-volume screening.
