使用光纤共聚焦激光微内窥镜检查的眼部药物输送系统的时空 体内 成像

该协议有助于筛选新配方，以更好地了解修饰如何影响其组织停留时间，这对于设计最佳药物递送系统至关重要。这种技术是非侵入性的，允许实时成像，从而减少过度使用动物进行采样。药物递送系统可以重新设计用于成像和治疗应用，只需将治疗药物和成像部分包含在一个纳米载体中即可。

这在治疗癌症和传染病方面都有有用的应用。演示该程序的将是我实验室的高级研究员Rasha Msallam。首先，在结膜下注射前两小时，通过尾巴静脉注射每公斤2.5毫克的Evans blue或EB。用5%异氟醚镇静小鼠后，将小鼠转移到鼻锥中，并将镇静的小鼠保持在加热垫上。

然后，修剪眼睛附近的晶须以进行注射。将一滴0.5%盐酸马替卡因溶液直接滴在眼睛上。接下来，装入一个10微升的玻璃注射器，配有带有荧光脂质体的32号针头，并确保注射器中不存在气泡。

使用镊子，抬起结膜，缓慢地将脂质体注射到结膜下间隙，然后缓慢地抽出针头，防止回流。确保形成充满荧光脂质体的泡泡。在眼睛上滴下1%的梭酸，并监测小鼠，直到它恢复意识。

打开 CLM 系统。将探头连接到 CLM 系统。此时选择采集文件的视野和位置。

调整激光强度，确保荧光素DHPE的荧光检测在线性范围内，并保持强度一致，以便比较不同时间点拍摄的图像。在系统预热 15 分钟后，使用包含每种激光器的清洁、漂洗和氟-4 溶液的校准套件，根据制造商的说明校准系统。简而言之，通过将尖端浸入清洁小瓶中各浸泡五秒钟，然后在冲洗小瓶中开始校准。

将尖端留在空中进行背景记录，以规范化来自不同光纤探头的背景值，确保图像均匀性。同样，将尖端浸入清洁小瓶中五秒钟，然后在冲洗小瓶中浸泡。接下来，将尖端浸入含有氟-4 488纳米的小瓶中五秒钟，以使信号值正常化。

重复将吸头浸入清洁小瓶中五秒钟，然后冲洗小瓶。将尖端保持在冲洗小瓶中，直到上一步中记录的荧光信号消失。然后，将尖端转移到含有氟-4 660纳米的小瓶中，以归一化来自探头中不同光纤的信号值。

校准后，确保探头背景的值小于100。否则，请用棉签涂抹器重复清洁探头。打开带有加热垫的动物温度控制器，并将温度调节到37摄氏度。

用手术悬垂物覆盖加热垫后，将鼻锥固定在加热垫上。在诱导室中使用5%异氟醚镇静小鼠后，将小鼠转移到鼻锥并将镇静的小鼠保持在加热垫上。然后，将一滴麻醉剂0.5%盐酸马赛卡因溶液滴入眼睛。

为了清洗眼表并避免晶状体结晶，请滴几滴盐水来保持眼睛润滑。然后，旋转并调整显微镜的目镜，以0.67倍放大倍率在直接聚焦下以符合人体工程学的方式观察鼠标的眼睛。打开激光，将探头像笔一样直接放在要成像的眼睛区域上。

然后，开始记录采集以观察目标区域处眼睛中的荧光。当所有区域都根据眼图进行标记和标记时，请停止录制，以了解确切帧处的确切探头位置。采集文件将自动保存为视频文件，位于之前选择的位置。

荧光成像显示巩膜和角膜区域之间有明显的分化。上巩膜和结膜的高度血管形成导致巩膜区域用EB染成红色。缺乏脉管系统的角膜呈黑色。在为期七天的研究中观察到边缘和巩膜的对比荧光。

荧光素染料注射的对照小鼠证实了脂质体衍生荧光的特异性。第一天和第三天的荧光强度很高。随着时间的推移，绿色荧光会随着时间推移在边缘和巩膜区域的脂质体减少。

注射后第一天至第三天在颞缘和上缘区域的荧光信号差异不显著，表明中性脂质体优先于边缘区，特别是角膜边缘。对于注射后第一天的颞叶和上部区域，巩膜中的荧光比边缘高六倍。到第三天和第七天，巩膜中梢膜和上部区域的脂质体显着减少，这归因于眼部清除机制。

由于与注射部位的距离，在鼻腔和下部区域检测到的荧光量最低。在停止录制之前，根据眼图标记斑点帧非常重要。保持激光强度一致，并定义最大背景值，以便在不同实验中进行适当的比较。

在确定先导制剂之后，可以在动物中进行全面的药代动力学和生物分布研究，以研究药物的生物利用度，并验证其制剂的治疗效果。