时空 在体 内 使用光纤共聚焦激光显微内镜成像眼部药物递送系统

该方案有助于筛选新剂型，以更好地理解修饰如何影响其在组织中的滞留时间，这对于设计最佳的药物递送系统至关重要。该技术具有非侵入性，并可实现实时成像，从而减少了为取样而过度使用实验动物。通过将治疗药物和成像组分简单地包载于同一纳米载体中，即可重新设计用于成像和治疗应用的药物递送系统。

这在癌症和传染病的治疗中具有重要的应用价值。本实验操作将由本实验室的高级研究员 Rasha Msallam 演示。首先，在结膜下注射前两小时，通过尾静脉向小鼠静脉注射 2.5 毫克/千克的伊文思蓝（Evans blue，EB）。用 5% 异氟烷对小鼠进行麻醉后，将小鼠转移至鼻罩，并将其维持在加热垫上以保持麻醉状态。

然后，修剪待注射眼周的胡须。将一滴0.5%盐酸丙氧麻黄碱溶液直接滴入眼部。接着，用荧光脂质体填充一支带有32号针头的10微升玻璃注射器，并确保注射器内无气泡。

使用镊子提起结膜，缓慢将脂质体注射到结膜下腔，然后缓慢拔出针头，防止反流。确保形成充满荧光脂质体的隆起小泡。在眼球上滴加1%夫西地酸滴眼液，并持续监测小鼠直至其恢复意识。

打开CLM系统。将探头连接到CLM系统。在此时选择视野范围以及采集文件的保存位置。

调节激光强度，确保荧光素 DHPE 的荧光检测处于线性范围，并在不同时间点拍摄的图像之间保持强度一致。系统预热15分钟后，使用包含每种激光对应的清洁液、冲洗液和Fluoro-4溶液的校准试剂盒，按照制造商说明对系统进行校准。简要步骤如下：首先将探头分别浸入清洁瓶中5秒，然后浸入冲洗瓶中5秒，开始校准。

将探头尖端置于空气中进行背景信号采集，以校正不同光纤探头的背景值，确保图像均匀性。随后，再次将探头尖端浸入清洗瓶中5秒，接着浸入冲洗瓶中5秒。接下来，将探头尖端浸入含有Fluoro-4 488-纳米染料的试剂瓶中5秒，以校正信号值。

将探针尖端再次浸入清洁管中5秒，随后浸入冲洗管中。保持探针尖端在冲洗管内，直至上一步骤中记录的荧光信号完全消失。然后，将探针尖端转移至含有Fluoro-4 660纳米染料的管中，以对探针中不同光纤的信号值进行归一化处理。

校准后，确保探针背景值低于100；否则，需使用棉签反复清洁探针。打开动物体温控制器及其连接的加热垫，并将温度调节至37摄氏度。

用手术巾覆盖加热垫后，将鼻罩固定在加热垫上。将小鼠置于诱导舱内，使用5%异氟烷进行麻醉，随后将小鼠转移至鼻罩处，并在加热垫上维持其麻醉状态。然后，向眼部滴加一滴0.5%盐酸丙美卡因麻醉液。

为了清洗眼表并防止镜片结晶，通过滴加数滴生理盐水保持眼睛湿润。然后，旋转并调节显微镜目镜，以0.67倍放大倍率在直接焦点下符合人体工学地观察小鼠眼睛。打开激光器，将探头像握笔一样直接放置在需要成像的眼部区域。

然后，开始记录采集过程，以观察感兴趣区域眼部的荧光信号。当所有区域均根据眼图标记并标注后，停止记录，以确定精确帧中探针的准确位置。采集文件将自动保存为视频文件，存储位置为先前选择的路径。

荧光成像显示出巩膜与角膜区域之间明显的差异。睫状膜和结膜的高度血管化导致巩膜区域被伊文思蓝染成红色。缺乏血管的角膜则呈现黑色。在为期七天的研究中观察到了角膜缘与巩膜之间的荧光对比。

荧光素染料注射的对照小鼠证实了脂质体来源荧光的特异性。在第1天和第3天，荧光强度较高。绿色荧光随时间推移反映了角膜缘和巩膜区域脂质体的减少。

注射后第一天至第三天，在颞侧角膜缘和上方角膜缘区域的荧光信号差异无统计学意义，表明中性脂质体倾向于分布于角膜缘区域，尤其是角膜周边部。在注射后第一天，颞侧和上方区域的巩膜荧光强度是角膜缘区域的六倍。至第三天和第七天，颞侧和上方区域巩膜中的脂质体显著减少，这归因于眼部的清除机制。

由于距离注射部位较远，鼻侧和下方区域检测到的荧光信号最弱。在停止记录前，必须根据眼部图谱对斑点图像进行标记。保持激光强度一致，并定义最大背景值，以便在不同实验之间进行恰当比较。

在确定先导制剂后，可在动物体内开展全面的药代动力学和生物分布研究，以考察药物的生物利用度，并验证其制剂的治疗效果。