Name: 果蝇卵母细胞的核迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 学习使用活细胞成像技术观察果蝇卵母细胞核迁移的方法。该方案可将解剖后的卵室维持存活12小时，利用转盘共聚焦显微镜捕捉三维延时影像，为研究细胞迁移机制和发育生物学提供重要技术支持。

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我们非常感谢 Jean-Antoine Lepesant 和 Nicolas Tissot，他们最初开发了该实验方案，并与我们分享了图3的部分图形元素。我们感谢 Fanny Roland-Gosselin 拍摄了图4的照片。我们还感谢实验室其他成员提供的有益讨论，这些讨论有助于改进本技术，同时感谢 Nathaniel Henneman 对本文稿提出的修改意见。我们谨此致谢 Jacques Monod 研究所的 ImagoSeine 核心设施，该设施是法国生物成像网络（France-BioImaging，项目编号 ANR-10-INBS-04）的成员。Maëlys Loh 的研究得到了法国科研部（MESRI）博士奖学金的资助。Antoine Guichet 和 Fred Bernard 的研究得到了法国癌症研究基金会（ARC，项目编号 PJA20181208148）、抗击癌症企业协会（Association des Entreprises contre le Cancer，项目编号 Gefluc 2020 #221366）以及巴黎大学 IdEx“新兴项目”基金（ANR-18-IDEX-0001）的资助。

1. 成像介质的制备
<ol>
	<li>在使用当天配制新鲜培养基。用移液器吸取 200 µL Schneider 培养基（含 L-谷氨酰胺和 0.40 g/L NaHCO3，并添加 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素）。</li>
	<li>加入 30 µL 胰岛素（10 mg/mL）。</li>
	<li>加入 4 µL 热灭活胎牛血清。</li>
</ol>
2. 观察室制备
<ol>
	<li>用移液器吸头蘸取少量硅脂，均匀涂抹在穿孔载玻片底部小孔的周围（图 4D）。</li>
	<li>放置一片尺寸为 24 × 50 mm、厚度为 0.13–0.16 mm 的盖玻片。</li>
	<li>用移液器吸头的宽端按压盖玻片，使硅脂展平，从而密封盖玻片，并在载玻片内形成一圈硅脂环（图 4F,G）。</li>
</ol>
3. 卵巢解剖
<ol>
	<li>将所需表型的雌蝇置于 CO2 垫上进行麻醉。</li>
	<li>将雌蝇转移至解剖孔中，加入 150 µL 成像介质（图 4H）。</li>
	<li>用镊子夹住雌蝇胸部，并用另一把镊子夹捏背部腹部的体壁，将其打开。</li>
	<li>分离并取出一对卵巢，打开体壁后卵巢应清晰可见。</li>
	<li>仔细去除子宫、输卵管和肌鞘（图 4I）。</li>
	<li>在成像腔内滴加 10–15 µL 成像介质，并将一个卵巢转移至其中（图 4J,K）。</li>
</ol>
4. 卵室分离
<ol>
	<li>分离卵巢管时，用解剖针夹住卵巢的后端（朝向较晚发育阶段的一端），再用另一根解剖针轻轻牵拉生殖囊，逐步将卵巢管分离。</li>
	<li>去除卵室上残留的肌鞘；一根解剖针固定肌鞘，另一根通过较大的卵室（第9阶段或更晚阶段）牵拉卵巢管。</li>
	<li>让去鞘的卵巢管自然沉降并与盖玻片接触。</li>
	<li>借助镊子将晚期阶段的卵室及其他剩余卵巢组织从微室中移除。使用解剖针将各卵巢管彼此分开，以利于成像（图4L）。</li>
</ol>
5. 观察室封闭
<ol>
	<li>裁剪一小块透性膜（10 × 10 mm）（图 4M，N）。</li>
	<li>小心地将膜覆盖在成像培养基表面，以排除任何气泡（图 4O）。</li>
	<li>在膜的轮廓周围、孔的边缘处涂上一层薄薄的卤代烃油，将培养室密封（图 4P，Q）。</li>
</ol>
6. 成像
<ol>
	<li>使用40倍物镜（HCX PL Apo，1.25NA，油浸）将成像装置放置在倒置显微镜的载物片 holder 上。</li>
	<li>定位并保存不同6期卵母细胞的位置，这些卵母细胞的细胞核已准备迁移。</li>
	<li>设置488 nm和561 nm激光器。在实测输出激光功率为150 mW的条件下，分别使用30%的激光功率，曝光时间分别为300 ms和500 ms。</li>
	<li>设置实验。以15分钟为时间间隔，进行持续12小时的时间序列成像，每个时间点采集以细胞核为中心、共41个层面、层间间距为1 µm的图像。 
	​注意：根据上述曝光时间，该设置下每个位置的图像采集耗时约45秒。由于更换位置存在延迟，建议在此条件下最多设置12个位置。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>使用 Fiji 软件中的 Orthogonal view 插件处理视频，并手动追踪细胞核。</li>
</ol>
<img alt="用于昆虫解剖和成像的显微镜设置及样本制备，包括设备使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：微室安装步骤图示。（A,B,C）所需工具的准备：解剖用培养皿、镊子、针具、成像介质、硅脂、透性膜以及铝制载片。（D）使用移液枪头尖端将硅脂涂抹于铝制载片背面。（E）将玻璃盖玻片粘附在硅脂上，形成微室的底部。（F,G）使用移液枪头较宽的一端对盖玻片施加压力，以在微室内形成密封连接。（H,I）在成像介质中解剖果蝇卵巢。（J）向微室内滴加一滴成像介质。（K,L）在微室内使用针具分离卵管。（M,N,O）将透性膜裁剪为 10 × 10 mm 的正方形，并覆盖在微室内的液滴上。（P,Q）使用卤代烃油密封微室。样本现已准备好进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li>
<li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891(2009).</li>
<li>Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+and+round+gets+you+somewhere%3A+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li>
<li>Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+%27+n+Villa%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li>
<li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li>
<li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).</li>
<li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Oogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

其他方案描述了如何制备和培养果蝇卵室 离体 用于活体成像实验12,13该方案的创新之处在于使用由中空铝制载玻片、盖玻片和O形圈构建的成像室2/CO2 可渗透膜。该装置的主要优势在于限制Z轴方向的移动，同时不对样品施加压力。因此，卵母细胞仍可自由移动，这也是为何首先使用40倍物镜，其次沿40 µm范围采集z轴层扫图像，而第6期卵母细胞的高度约为20 µm。
尽管该实验方案相对简单，但每一步骤对检测都至关重要。微室的制备、通透性膜的处理以及腔室的密封，均需确保气体交换的进行，并防止成像介质及样品干燥。损伤卵室会危及样品存活，因此精细且准确的解剖技术至关重要。此外，必须彻底去除肌肉鞘，因为残留的组织碎片会导致卵室发生不期望的移动。
铝除了对样品安全外，还因其强度高、耐用性强以及易于清洁而被选用。目前尚未在这些条件下研究其他材料。尽管随着3D打印机的发展使用...

多年来， 果蝇 卵母细胞已成为研究核迁移的模型系统。 果蝇 卵母细胞在一种称为卵室的多细胞结构中发育。卵室包含16个生殖细胞（15个滋养细胞和1个卵母细胞），其外围由一层上皮性的滤泡体细胞包裹。卵室的发育已被划分为14个阶段。图1A），在此期间卵母细胞将生长并积累胚胎早期发育所必需的储备物质。在发育过程中，随着微管的重排以及母源决定因子的不对称运输，卵母细胞沿前后轴和背腹轴建立极性。这些轴线将决定由该卵母细胞受精后所形成胚胎及成体的后续极性轴。1在卵子发生过程中，细胞核在卵母细胞内呈现不对称定位。在第6阶段，细胞核位于细胞中央。当卵母细胞接收到由后部滤泡细胞发出但尚未明确的信号后，在第7阶段，细胞核向卵母细胞前侧与外侧质膜交界处迁移。图1B)2,3这种不对称位置对于诱导背腹轴的确定是必需的。
<img alt="果蝇卵子发生、荧光显微镜、卵室各阶段、细胞核标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：Drosophila melanogaster 卵室。（A）来自转基因果蝇的固定卵巢管，该果蝇表达标记核膜的 Fs(2)Ket-GFP 和标记质膜的 ubi-PH-RFP。卵巢管由处于不同发育阶段的卵室组成。成熟方向沿前后轴进行，前端（左侧）为生殖干细胞所在的生殖囊（germarium），后端（右侧）为较晚的发育阶段。（B）活体卵室在卵子发生第6阶段通过转盘共聚焦显微镜获得的Z轴投影图像（左），其中卵母细胞的细胞核位于中央。在第7阶段，细胞核将迁移至不对称位置（右），紧贴前部质膜（位于卵母细胞与滋养细胞之间）以及侧部质膜（位于卵母细胞与滤泡细胞之间）。该位置将诱导卵室背侧的确定，从而建立背腹轴。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
几十年来，研究人员通过免疫染色固定组织的方式研究这一核迁移过程。该方法已明确证实，该过程依赖于密集的微管网络。4,5最近，我们开发了一种实验方案，提供了与卵母细胞数小时活体成像相容的条件，从而能够对这一过程进行动态研究。6.
因此，我们首次能够描述细胞核在迁移过程中具有优先且特征性的轨迹：一条沿着卵母细胞的前部质膜（APM），另一条沿着卵母细胞的侧部质膜（LPM）图2这些最新结果强调了在研究核迁移等动态过程时，活体成像方案的重要性。
<img alt="显示卵母细胞、滋养细胞和滤泡细胞的卵子发生过程示意图，展示前后轴。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：细胞核不同迁移路径的示意图。 在卵子发生第6阶段，卵母细胞是一个具有中央细胞核的大细胞。在此阶段，前后极性轴已建立，卵母细胞的后侧/侧部质膜与滤泡细胞接触，而前部质膜（黄色）则与滋养细胞接触2。我们先前报道过，细胞核可沿前部质膜（APM）、侧部质膜（LPM）迁移，或穿过细胞质迁移（STAD，即直接迁移至前背侧皮层）6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
卵母细胞核迁移是一个持续约3小时的现象6，迄今为止，触发实际迁移起始的事件尚不清楚。用于研究该机制的蛋白质突变体也可能延迟迁移的起始。这些未知因素促使我们进行长时间（10–12小时）的图像采集。因此，确保卵母细胞保持存活至关重要。随着卵室的发育，其沿前后轴从球形逐渐伸长为椭圆形。这种伸长由滤泡细胞的旋转驱动，该过程发生在第1至第8发育阶段，且旋转方向垂直于前后轴7。此外，卵室周围包裹着一层具有脉动特性的管状肌肉鞘，其生理功能是持续推动发育中的滤泡向输卵管方向移动8。为了限制解剖后卵室因振荡而产生的运动，我们设计了一个高度为150 µm的观察微室（图3A）。该高度略高于第10和第11阶段滤泡的尺寸，能够在显著限制样本垂直移动的同时，保留卵室的旋转能力，从而最大限度减少滤泡发育过程中的缺陷。随后，我们利用转盘共聚焦显微镜，通过多点时间序列成像对解剖后的卵室进行长达12小时的活体成像。本文中，我们描述了研究第6至第7发育阶段卵母细胞核迁移的实验方案。
<img alt="载玻片腔室示意图，标注尺寸；用于显微观察的装置，包含盖玻片和油。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：观察腔室的示意图。（A）（俯视图）铝制载玻片的精确尺寸，以及位于载玻片中央孔洞的高度（A'）和周长（A''）。（B）（底视图）盖玻片封闭孔洞，并用硅脂密封固定在载玻片上。（C）（俯视图）解剖后的卵管在成像培养基中发育，其表面覆盖一层透气膜，卤代烃油用于稳定该膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
为了追踪卵母细胞中细胞核的迁移并精确评估其运动轨迹，需要同时标记核膜和质膜。为此，选择了两种具有高信噪比且在活体成像过程中信号不衰减的转基因标记物。为标记质膜，采用了一种 P[ubi-PH-RFP] 推荐使用编码人磷脂酶C∂1（PLC∂1）Pleckstrin同源（PH）结构域与RFP融合的质粒。该PH结构域可结合卵母细胞质膜上分布的磷脂酰肌醇二磷酸PI(4,5)P2。9细胞核膜， P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP 一种蛋白捕获品系，其中GFP被插入编码该蛋白的基因内部 果蝇 ß-importin 呈现均匀且强烈的信号10将年轻的果蝇（1-2日龄）置于含有干酵母的新鲜培养瓶中，饲喂24-48小时，然后再进行卵巢解剖。
在该活体成像实验中，使用一块厚度为1 mm的铝片，该铝片对样品无反应性，并被切割成显微镜载玻片的尺寸。铝片中央有一个直径为16 mm的孔，该孔被扩孔至深度0.85 mm。此扩孔区域中心还设有一个直径6 mm、深度150 µm的附加孔（图3A）。在铝制腔室底部，用硅脂（对样品惰性）将盖玻片粘附固定（图3B）。将样品置于充满培养基的孔中后，用一层允许O2/CO2交换的膜覆盖培养基，并在周围加入卤代烃油（图3C）。
解剖时建议使用尖端尺寸为 0.05 x 0.02 mm 的不锈钢镊子，以及直径为 0.20 mm 的针头用于分离卵巢管图4B, C）。使用配备相机的转盘共聚焦倒置显微镜CSU-X1对迁移的细胞核进行成像。通过每15分钟一次的时间序列在多视野下采集图像， 24 °C15 分钟的时间间隔可以在限制荧光蛋白光漂白和样品光毒性的同时，实现多位置图像采集。此外，更短的时间间隔并不能显著增加核运动轨迹追踪的信息量。视频数据经过处理和分析 通过 Fiji 软件11.

<table><tbody><tr><td>CO2麻醉垫</td><td>Dutscher</td><td>789060</td><td>麻醉果蝇</td></tr><tr><td>盖玻片（24×50 mm）</td><td>Knittel Glass</td><td>VD12450Y100A</td><td>观察室制备</td></tr><tr><td>杜蒙特#5镊子</td><td>Carl Roth</td><td>K342.1</td><td>解剖</td></tr><tr><td>不锈钢针</td><td>Entosphinx</td><td>20</td><td>解剖</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7524</td><td>成像介质</td></tr><tr><td>牛胰岛素溶液</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10516 - 5ml</td><td>成像介质</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P0781</td><td>成像介质</td></tr><tr><td>通透性膜</td><td>Leica</td><td>11521746</td><td>观察室制备</td></tr><tr><td> Schneider培养基</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-91500</td><td>成像介质</td></tr><tr><td>硅脂</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>335148</td><td>观察室制备</td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>CSU-X1</td><td>细胞核迁移观察</td></tr><tr><td>Voltalef 10S油</td><td>VWR</td><td>24627 - 188</td><td>观察室制备</td></tr></tbody></table>

drosophila 卵母细胞中的核迁移

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

活细胞成像对于理解调控细胞器运动、细胞骨架重排或细胞内极性模式的细胞与分子机制尤为重要。在研究卵母细胞核定位时，活体成像技术对于捕捉该过程的动态事件至关重要。Drosophila 卵室是一种多细胞结构，因其体积较大且拥有丰富的遗传工具，是研究这一现象的理想模型系统。在 Drosophila 中期卵子发生过程中，细胞核会从卵母细胞中央位置迁移至偏心位置，这一过程由微管产生的力所介导。细胞核的迁移与定位对于决定胚胎及后续成体果蝇的极性轴具有必要性。该迁移过程的一个特征是其在三维（3D）空间中进行，因此必须采用活体成像技术。为了研究调控细胞核迁移的机制，我们建立了一种培养离体卵室并利用转盘共聚焦显微镜进行长达12小时时间序列活体成像的实验方案。总体而言，我们的培养条件能够长时间维持 Drosophila 卵室的存活，从而可在大量样本中实现对三维空间内细胞核迁移完成过程的可视化观察。

迁移之前，细胞核处于动态状态，在定义为迁移前期的一段时间内围绕中心位置振荡。这些微小运动反映了推力与拉力之间的平衡，使细胞核在卵母细胞中央区域维持稳定。通过量化细胞核的运动轨迹，我们发现朝向前极质膜（APM）和侧极质膜（LPM）的轨迹比例相似。我们将轨迹性质定义为细胞核与质膜首次接触的位置6。因此，细胞核在沿质膜滑动并最终到达两个质膜交界处之前，会先接触APM或LPM（图5,影片1-2）。此外，我们发现不同的分子信号分别促进这两种轨迹。例如，位于细胞核与卵母细胞后部质膜之间的中心体聚集可促进APM方向的轨迹；相反，不对称定位于核膜上的微管相关蛋白Mushroom Body Defect（Mud）则支持沿LPM方向的运动轨迹6。此外，与野生型情况相比，中心体或Mud蛋白的缺失均会影响细胞核的迁移速度6。<...

在 果蝇卵母细胞核在卵子发生过程中会发生微管依赖性迁移。本文介绍了一种通过卵室活体成像来追踪该迁移过程的实验方案 离体我们的实验流程可使卵室存活12小时，以便利用转盘共聚焦显微镜获取多点位的三维时间序列图像。

Drosophila 卵母细胞中的核迁移

活细胞成像对于理解调控细胞器运动、细胞骨架……的细胞和分子机制尤为必要。

该技术可实现对分离的黑腹果蝇卵室中长时间的生物学过程（如卵细胞核迁移）进行活体成像观察。本方案描述了如何将分离的卵室维持存活12小时，以进行活体成像显微镜观察。首先，用移液器吸取200 µL Schneider培养基，并加入30 µL浓度为10 mg/mL的胰岛素，然后添加4 µL热灭活的胎牛血清。使用移液器吸头蘸取少量硅脂，均匀涂抹在穿孔载玻片底面的孔洞周围。放置盖玻片，用移液器吸头的宽端按压盖玻片，使硅脂展平，从而在载玻片内形成一圈硅脂环。将麻醉后的雌性果蝇转移至含有 150 µL 成像介质的解剖孔中。解剖雌性个体时，用镊子夹住胸部，并用另一把镊子轻轻夹住腹部背侧的体壁几丁质层。小心取出子宫、输卵管及肌鞘。在打开体壁后，可见一对卵巢，将其分离并取下。在卵巢上滴加 10 至 15 微升成像介质，并将一个卵巢转移至成像腔中。分离卵管时，用针固定卵巢的后端，用另一根针轻轻牵拉生殖末端，以将卵管逐一分开。用一根针固定鞘膜，用另一根针将卵小管通过较大的卵室，以去除卵室上残留的肌鞘。让去鞘的卵小管自然下沉并与盖玻片接触。用镊子将晚期卵室及其余卵巢组织从微室中移除。使用针头小心分离卵管，以方便观察。剪取一块10毫米×10毫米的小型通透膜。小心将膜覆盖在成像培养基表面，排出所有气泡。然后在膜的轮廓周围、小室周边涂上一层薄薄的卤代烃油，将小室严密密封。将成像装置置于倒置显微镜的载物台支架上，并使用40倍物镜。通过活体成像显微技术，记录了野生型卵室中卵母细胞核的迁移过程。细胞核在沿轨迹滑动到达两个质膜交界处的最终位置之前，会先抵达前端质膜或侧向质膜。质膜畸形、滤泡细胞紊乱、细胞发育迟缓以及细胞核缩小是卵室即将退化的早期征象。在成像开始后八小时之前退化的卵母细胞通常难以被检测到。然而，少数早期退化的病例是由于解剖或装片步骤中出现问题所致。损伤卵室会危及其存活，因此精细的手工解剖和微室制备至关重要。该实验步骤使我们能够观察到卵母细胞核在迁移过程中可呈现三种不同的轨迹，且这些轨迹受到卵母细胞内不同细胞器的调控。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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学习使用活细胞成像技术观察果蝇卵母细胞核迁移的方法。该方案可将解剖后的卵室维持存活12小时，利用转盘共聚焦显微镜捕捉三维延时影像，为研究细胞迁移机制和发育生物学提供重要技术支持。

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