Name: 用于工程神经样组织的小鼠皮质星形胶质细胞的3D生物打印 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习使用小鼠皮质星形胶质细胞进行3D生物打印以构建工程神经样组织的方法。该技术有助于研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能及其在神经系统疾病中的作用机制。

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本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP）资助，资助编号为 2018/23039-3 和 2018/12605-8；科学技术发展国家理事会（CNPq），资助编号为 465656/2014-5 和 309679/2018-4；以及高等教育人员改进协调机构（CAPES），财务代码 001。

所有涉及动物的实验均遵循国际实验动物使用指南（http://www.iclas.org），并经圣保罗联邦大学研究伦理委员会批准（CEUA 2019/ 9292090519）。
1. 小鼠脑组织解剖
<ol>
	<li>将 10 mL 冷的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）转移至一个 100 mm 培养皿中，并将 1 mL 转移至一个 1.5 mL 微量离心管中。每只动物准备一个微量离心管。 
	注意：培养皿和微量离心管均需置于冰上保存。</li>
	<li>使用 DMEM/F12 培养基配制星形胶质细胞培养液，添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% 谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素（P/S）。使用 0.2 µm 滤器过滤培养基以实现灭菌。</li>
	<li>使用锋利的手术剪通过断头法处死出生后第 1 天的 C57Bl/6 小鼠幼崽。用镊子拉开皮肤，暴露颅骨。确保手术剪和镊子均已用 70% 乙醇灭菌。</li>
	<li>使用锋利的弯头剪刀沿矢状面从枕骨大孔向头顶方向剪开颅骨。 
	注意：务必避免损伤脑组织。</li>
	<li>使用先前经 70% 乙醇灭菌的刮铲，将脑组织从颅腔中取出，并放入含有 10&#160;mL 冷 HBSS 的培养皿中。</li>
	<li>将盛有脑组织的培养皿置于体视显微镜下，使用两把钝头镊子去除脑表面的脑膜（图 1）。</li>
	<li>用刮铲轻轻将大脑皮层从脑的其他部分沿中线卷离，从而分离皮层组织。</li>
	<li>收集两侧皮层组织，并立即转移至含有 1 mL 冷 HBSS 的同一微量离心管中。</li>
</ol>
2. 星形胶质细胞的分离与培养
<ol>
	<li>在超净工作台中，使用弯头显微剪将皮层组织剪成小块，用1 mL HBSS上下吹打3次进行洗涤。静置组织使其自然沉降。吸除HBSS，加入新鲜HBSS，重复该洗涤过程两次。</li>
	<li>吸除HBSS，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育5分钟。 
	注意：此阶段仅需胰蛋白酶消化即可。</li>
	<li>通过轻柔吹打15次对组织进行机械性解离。 
	注意：组织完全解离的标志是细胞悬液浊度增加，且悬液中无明显的大块组织残留。</li>
	<li>将溶液转移至15 mL锥形离心管中，加入等体积胎牛血清（FBS）以中和胰蛋白酶活性，并使用孔径为0.4 µm的细胞滤网过滤溶液，以去除未解离的组织碎片。</li>
	<li>用1 mL星形胶质细胞培养基冲洗滤网，收集滤过液，于200 × g、25 °C条件下离心5分钟。离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL星形胶质细胞培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至T25培养瓶中，补加培养基至总体积为3.5 mL，并将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>确保细胞在24小时后已贴壁。随后更换培养基，并每隔3天更换一次。</li>
	<li>培养7天后，用2 mL 1× PBS洗涤细胞，以去除小胶质细胞和少突胶质细胞。</li>
	<li>将PBS替换为星形胶质细胞培养基，将培养瓶置于摇床中，180 rpm振荡过夜。 
	&#8203;注意：星形胶质细胞在培养约10–12天后可形成融合的单层细胞。</li>
</ol>
3. 明胶甲基丙烯酰基（GelMA）的合成
<ol>
	<li>称取10 g猪皮来源的明胶，加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，在加热板上以240 rpm转速、50 °C温度搅拌至完全溶解。</li>
	<li>在通风橱内，加入2 mL甲基丙烯酸酐（MA）以实现较低程度的功能化修饰，并将明胶乳液在240 rpm转速、50 °C温度下持续搅拌2小时。 
	警告：MA危险性说明：H302 + H332（吞咽或吸入有害），H311（皮肤接触有毒），H314（造成严重皮肤灼伤和眼损伤），H315（引起皮肤刺激），H317（可能引起过敏性皮肤反应），H318（造成严重眼损伤），H331（吸入有毒），H332（吸入有害），H335（可能引起呼吸道刺激）。操作指南：P261（避免吸入粉尘/烟/气体/烟雾/蒸气/喷雾），P305 + P351 + P338 + P310（若进入眼睛：用清水小心冲洗数分钟。如佩戴隐形眼镜且易于取出，请取出隐形眼镜并继续冲洗。立即呼叫中毒中心或就医），P301 + P312 + P330（若误吞：如有不适，立即呼叫中毒中心或就医。漱口）。 
	注意：应极其缓慢地逐滴加入MA。</li>
	<li>将明胶-MA溶液加入100 mL预热至50 °C的PBS中，使终体积达到200 mL，并在240 rpm转速、50 °C温度下继续搅拌10分钟。</li>
	<li>截取约20 cm的透析膜（截留分子量12–14 kDa），浸泡于去离子水中直至变软。 
	注意：用去离子水充满透析膜，以确保无孔洞或缺陷。</li>
	<li>使用漏斗将明胶-MA溶液转移至透析膜中。 
	注意：封闭两端时应预留足够内部空间，以容纳溶液膨胀。</li>
	<li>将装有明胶-MA溶液的透析膜置于盛有2 L蒸馏水的容器中进行透析，在40 °C、500 rpm转速下持续搅拌5天。 
	注意：覆盖容器以防止水分蒸发。</li>
	<li>每日更换蒸馏水两次，每次更换时将透析膜翻转倒置以促进均匀透析。</li>
	<li>第五天时，向透析后的明胶-MA溶液中加入200 mL预热至40 °C的超纯水，并在40 °C下搅拌15分钟。</li>
	<li>将明胶-MA溶液分装至50 mL锥形管中，每管不超过25 mL，于-80 °C冷冻2天。 
	&#8203;注意：将离心管水平放置，以利于后续冻干。</li>
	<li>将冷冻溶液冻干3–5天，并将所得冻干明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）置于防潮条件下保存。</li>
</ol>
4. 生物墨水制备
注意：为了获得 1 mL 的生物墨水，建议制备至少 3 mL 的生物材料溶液，因为在过滤过程中可能会有损失。
<ol>
	<li>纤维蛋白原溶液的制备
	<ol>
		<li>用去离子水配制生理盐水（NaCl 0.9%），并将10 mg牛血浆纤维蛋白原溶解于1 mL生理盐水中，得到浓度为10 mg/mL的溶液。 
		注意：由于纤维蛋白原会吸附到玻璃表面，因此请勿使用玻璃烧瓶配制纤维蛋白原溶液。</li>
		<li>在37 °C下持续搅拌，直至纤维蛋白原完全溶解。 
		注意：溶解纤维蛋白原时，可使用置于37 °C恒温烘箱内的旋转仪。也可在37 °C加热板上以磁力搅拌（180 rpm）溶解纤维蛋白原。在此条件下，10 mg/mL纤维蛋白原约需40分钟完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>明胶/GelMA 溶液的制备
	<ol>
		<li>称取 0.12 g 明胶，加入 1.9 mL 预热的 PBS（40 °C），配制成终浓度为 4%（w/v）的明胶溶液。涡旋振荡以促进溶解。</li>
		<li>将乳液保持在40 °C直至完全溶解。</li>
		<li>称取0.06 g冻干GelMA，转移至明胶溶液中，使GelMA终浓度为2%（w/v）。涡旋振荡以促进溶解。</li>
		<li>将溶液保持在 40 °C 直至完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水的制备
	<ol>
		<li>移取0.9 mL的10 mg/mL纤维蛋白原溶液，加入明胶/GelMA溶液中，使纤维蛋白原的终浓度为3 mg/mL。</li>
		<li>称取0.015 g光引发剂（PI），转移至明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液中，使PI终浓度为0.5%（w/v）。通过上下翻转离心管混合溶液，并保持&#160;在40 °C避光条件下孵育，以避免PI降解。 
		注意：生物墨水在 4 °C 下储存时间最长不得超过 24 小时。</li>
		<li>在层流条件下，使用 0.2 µm 滤器将溶液过滤至无菌的 15 mL 离心管中。 
		注意：生物材料溶液应保持在 37–40 °C 以利于过滤。</li>
		<li>将980 µL的生物材料溶液转移至15 mL锥形管中。</li>
		<li>将层粘连蛋白用生理盐水稀释，配制成100 µg/mL的储存液。</li>
		<li>移取20 µL层粘连蛋白，加入含有生物墨水的离心管中，使层粘连蛋白的终浓度为2 µg/mL。</li>
		<li>轻轻吹打混匀，避免产生气泡。若仍有气泡存在，将锥形管在200 x g 2 分钟。将生物墨水置于 37 °C 环境中保存，直至与细胞混合。</li>
		<li>用0.05%胰蛋白酶消化原代星形胶质细胞5分钟。 
		注意：使用第1至第3代的星形胶质细胞。</li>
		<li>用FBS以1:1的比例中和胰蛋白酶活性，将细胞转移至15 mL锥形管中。在200 x g 5 分钟。</li>
		<li>计数细胞并转移 1 x 106 将细胞转移至另一离心管中。以200 x g离心 g 5 分钟。</li>
		<li>轻轻敲击锥形管底部，弃去上清液，保留少量液体（约200 µL）以重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将1 mL明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液转移至含有细胞的离心管中，轻轻吹打混匀，获得终浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL的均匀混合物。6 cells/mL</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 交联剂溶液的制备
<ol>
	<li>凝血酶的重悬
	<ol>
		<li>在15 mL锥形管中，用含0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的无菌去离子水配制100 U/mL的凝血酶储备液。将储备液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。 
		注意：由于凝血酶会吸附于玻璃表面，因此请勿使用玻璃容器配制储备液或储存分装液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝血酶-CaCl2溶液的配制
	<ol>
		<li>用移液器吸取100 µL凝血酶储备液，转移至含有8.9&#160;mL无菌去离子水的50 mL锥形管中，得到终浓度为1 U/mL的凝血酶溶液。</li>
		<li>用去离子水配制10%（w/v）的CaCl2溶液，并使用0.2 µm滤器进行除菌过滤。</li>
		<li>取1.1 mL 10% CaCl2溶液加入含凝血酶的锥形管中，使CaCl2与凝血酶的终体积比为1:9。 
		&#8203;注意：应根据实验所需用量现配交联剂溶液，避免储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用挤出式生物打印机打印含星形胶质细胞的生物墨水
<ol>
	<li>神经组织的设计
	<ol>
		<li>使用G代码：在X轴和Y轴上构建一个6 × 6 mm（方形）的网格，每条生物打印线之间间距为1 mm，在Z轴上设置6层（每层之间间隔0.2 mm）；设定挤出量（E）为0.01 mm，并在Z轴每一新层增加0.001 mm；打印速度（F）设定为400 mm/min（补充信息）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物打印机的设置
	<ol>
		<li>用紫外光照射设备15分钟，然后用70%乙醇擦拭表面。</li>
		<li>使用电源开关打开生物打印机。通过USB线将设备连接至计算机。打开控制软件，连接至生物打印机并加载设计文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物打印用注射器的准备
	<ol>
		<li>使用1,000 µL移液器将含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水转移至5 mL塑料注射器中。 
		注意：转移过程应缓慢，以避免气泡产生。</li>
		<li>在注射器上连接一支无菌的22 G钝头针。 
		注意：将注射器置于4 °C环境中静置2分钟。</li>
		<li>将注射器连接至生物打印机的打印头，并手动挤出生物墨水以排除残留气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物打印 
	注意：生物打印操作在超净工作台外进行。
	<ol>
		<li>将一个35 mm培养皿放置在生物打印机载物台上，并将针头定位在距离培养皿表面0.1 mm的位置，以确保针头可自由移动。 
		注意：每次生物打印使用一个独立的35 mm培养皿。</li>
		<li>按下打印按钮。</li>
		<li>生物打印完成后，确保注射器移离培养皿。随后盖上培养皿，准备进行交联处理。 
		&#8203;注意：单个结构的生物打印过程约需1分钟10秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物打印结构的交联与培养
	<ol>
		<li>将培养皿置于强度为2 mW/cm2的紫外光下，上下各照射60秒，共两次，以实现GelMA的交联。</li>
		<li>在超净工作台内，使用无菌刮铲将生物打印结构转移至24孔板中。</li>
		<li>加入500 µL凝血酶/CaCl2溶液，静置30分钟以完成纤维蛋白交联。</li>
		<li>移除交联溶液，用2 mL 1× PBS洗涤结构一次，随后更换为1 mL星形胶质细胞培养基，置于37 °C、5% CO2条件下培养。每隔3天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 星形胶质细胞活力的评估
<ol>
	<li>生物打印星形胶质细胞的活性检测
	<ol>
		<li>使用刮铲将生物打印的构建物转移至35 mm培养皿中。</li>
		<li>用1 mL的1×PBS洗涤构建物。</li>
		<li>在构建物上加入100 µL的活/死细胞染色试剂，于37 °C孵育30分钟，并避光保存。</li>
		<li>移除活/死细胞染色试剂，并用1 mL的1×PBS洗涤构建物。</li>
		<li>使用刮铲将样品转移至共聚焦培养皿中，利用共聚焦显微镜在488 nm和570 nm激发光下观察构建物内的细胞以获取图像。 
		注：建议使用10倍物镜对构建物内细胞进行整体观察。</li>
		<li>确保样品放置平整。如有必要，可在样品上覆盖盖玻片以提高平整度。 
		注：成像过程中，应确保共聚焦培养皿密封良好，防止样品干燥。</li>
		<li>使用计算软件统计活细胞（绿色）和死细胞（红色）的数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维星形胶质细胞培养的活性检测
	<ol>
		<li>将0.5 × 106个星形胶质细胞（传代1–3代）接种于35 mm共聚焦培养皿中，加入星形胶质细胞培养基，并在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>当细胞达到完全融合时，移除培养基，并用1 mL的1×PBS洗涤。</li>
		<li>加入200 µL的活/死细胞染色试剂，将培养皿置于37 °C孵育30分钟，并避光处理。</li>
		<li>移除活/死细胞染色试剂，并用1 mL的1×PBS洗涤细胞。</li>
		<li>将培养皿置于配备数字相机的共聚焦显微镜下，使用488 nm和570 nm激发光进行图像采集。</li>
		<li>使用计算软件统计活细胞（绿色）和死细胞（红色）的数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 星形胶质细胞的免疫染色
<ol>
	<li>三维生物打印星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色 
	注意：若需检测其他细胞标志物，请相应更换一抗。
	<ol>
		<li>从孔中移除培养基，并用 1 mL 的 3× PBS 清洗结构。</li>
		<li>向孔中加入含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS，直至完全覆盖结构，在 4 °C 下孵育 2 小时。</li>
		<li>移除 PFA，并用 1 mL 的 3× PBS 清洗结构。 
		注意：若将样品在 4 °C 的 PBS 中保存，此步骤可暂停数月。确保培养板密封，防止 PBS 蒸发。</li>
		<li>用 0.1 mol/L 甘氨酸处理样品 5 分钟。</li>
		<li>用 1 mL 的 1× PBS 洗涤 5 分钟。</li>
		<li>在 25 °C 下，使用含 0.1% Triton X-100 和 10% FBS 的 PBS 对样品进行透化处理，持续 1 小时，并置于摇床上振荡。</li>
		<li>在 4 °C 下，用鸡抗 GFAP 抗体（一抗稀释比例为 1:500）孵育结构过夜。</li>
		<li>吸除一抗，用 1 mL PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次。 
		注意：一抗在 4 °C 保存时可重复使用多次。</li>
		<li>在 25 °C 下，于避光条件下，在摇床上用 Alexa Fluor 488 标记的抗鸡二抗（二抗稀释比例为 1:500）和 1 µg/mL DAPI 孵育样品 1 小时。 
		注意：样品需避光保存。</li>
		<li>用 1 mL PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>将结构转移至 35 mm 共聚焦培养皿中。 
		注意：确保培养皿密封良好，防止样品干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维星形胶质细胞培养的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
	<ol>
		<li>在 35 mm 共聚焦培养皿中接种 0.5 × 106 个星形胶质细胞（传代 1–3 代），加入星形胶质细胞培养基，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育。</li>
		<li>当细胞达到完全汇合时，移除培养基，并用 1 mL 的 1× PBS 清洗细胞。</li>
		<li>重复步骤 8.1.2–8.1.10。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>星形胶质细胞细胞骨架染色
	<ol>
		<li>重复步骤 8.1.1–8.1.6。</li>
		<li>在结构上加入 200 µL 含 50 µg/mL 荧光标记鬼笔环肽的 PBS 溶液和 1 µg/mL DAPI。</li>
		<li>在 25 °C 下避光孵育 1 小时，同时置于摇床上振荡。</li>
		<li>用 1 mL PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次，然后用刮匙将结构转移至共聚焦培养皿中。 
		&#8203;注意：确保培养皿密封良好，防止样品干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 共聚焦成像
<ol>
	<li>将培养皿置于配备数字相机的共聚焦显微镜下进行成像（激发波长分别为 359、488 和 570 nm）。</li>
	<li>使用 10 倍物镜进行整体观察，使用 40 或 63 倍物镜获取细胞的放大图像。 
	注意：确保样品放置平整。如有必要，可在样品上覆盖盖玻片以提高平整度。</li>
</ol>

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<li>Arulmoli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+scaffolds+of+salmon+fibrin%2C+hyaluronic+acid%2C+and+laminin+for+human+neural+stem+cell+and+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

3D生物打印技术作为一种生物制造新方法应运而生，可构建在结构和生理功能上均接近天然组织的精细结构22，包括大脑23类神经组织的生物制造使得 体外 原生微环境建模，作为理解与中枢神经系统疾病发生及治疗相关的细胞与分子机制的重要工具11由于胶质细胞在神经功能中的重要作用，皮层星形胶质细胞已被广泛应用于诸多研究中，例如脑发育研究24生物分子运输25，神经突起生长26以及类脑组织的生物制造14.
先前已报道了使用不同生物材料和支架技术构建星形胶质细胞三维培养的方法27,28,<sup class="xre...

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，在维持大脑稳态中发挥关键作用。除了为神经元提供持续支持外，星形胶质细胞还负责调节神经递质的摄取、维持血脑屏障的完整性，并调控神经元突触的形成1,2。星形胶质细胞在中枢神经系统炎症中也具有重要作用，当脑组织受损时，它们会启动反应性星形胶质细胞增生或反应性星形胶质化3,4，形成胶质瘢痕，以防止健康组织暴露于退行性致病因子中5。这一过程导致星形胶质细胞的基因表达、形态和功能发生改变6,7。因此，针对星形胶质细胞功能的研究有助于开发治疗神经系统疾病的新疗法。
体外模型对于研究与神经系统损伤相关的机制至关重要。尽管皮质星形胶质细胞的成功分离和二维（2D）培养已有报道8，但该模型无法提供模拟细胞天然行为的真实环境，也无法重现大脑的复杂性9。在二维条件下，机械和生化支持不足、细胞间及细胞与基质间的相互作用较弱，以及细胞扁平化导致基底-顶端极性的缺失，均会影响细胞信号传导动态和实验结果，引起细胞形态和基因表达的改变，从而影响对治疗干预的响应10。因此，开发能够提供更接近真实神经环境的替代模型至关重要，以期实现研究成果向临床应用的转化。
三维（3D）细胞培养是一种更为先进的模型，能够更高保真度地模拟器官和组织的特征，包括中枢神经系统（CNS）11。在胶质细胞培养方面，3D模型有助于维持星形胶质细胞的形态、细胞基底-顶端极性以及细胞信号传导12,13。3D生物打印技术作为一种强大工具应运而生，可通过使用细胞和生物材料以受控方式生物制造出三维活体组织，从而重现天然组织的结构与特性。该技术的应用显著提高了实验结果的可预测性，并推动了中枢神经系统相关再生医学的发展14,15,16。
本文所述方案详细介绍了皮层星形胶质细胞的分离与培养方法。该方案还详细描述了一种可重复的方法，用于将星形胶质细胞包埋在明胶/甲基丙烯酰化明胶（GelMA）/纤维蛋白原中，并添加层粘连蛋白进行生物打印。本研究采用基于挤出式的生物打印机，以每毫升1 × 106个细胞的密度打印含有皮层星形胶质细胞的生物材料。通过控制打印速度，最大限度地减少了生物打印过程中的剪切应力，星形胶质细胞在打印后表现出较高的存活率。生物打印的结构体培养一周后，星形胶质细胞能够在水凝胶内伸展、贴附并存活，维持典型的星形胶质细胞形态，并表达特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4。
该方法适用于活塞驱动的基于挤出的生物打印机，可用于打印来源于不同来源的星形胶质细胞。本文提出的3D生物打印模型适用于多种神经工程应用，例如研究星形胶质细胞在健康组织中的功能机制，以及理解神经病理学的进展和治疗方案的开发。

<table><tbody><tr><td>3D 生物打印机</td><td>3D Biotechnology Solutions</td><td></td><td>基于挤出式的生物打印机</td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>Integra Miltex</td><td>6--30</td><td>用于脑组织解剖的镊子，已预先灭菌</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>无蛋白酶、无脂肪酸、基本无球蛋白</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>156340</td><td>T25 培养瓶</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>配备 Olympus FluoView 300 共聚焦系统的共聚焦 TCS SP8 显微镜</td></tr><tr><td>锥形离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651, 339652</td><td>15 mL 和 50 mL 无菌离心管</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab224589</td><td>DAPI 染色液</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12500062</td><td>DMEM/F-12 50/50，1X（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 50/50 混合液），含 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>透析管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9527</td><td>截留分子量 = 14 kDa</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-15-5</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>12657011</td><td>研究级</td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-32-5</td><td>来自牛血浆的结晶粉末状纤维蛋白原</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td>来自猪皮的明胶粉末</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-40-6</td><td>甘氨酸粉末</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>14175095</td><td>无钙、无镁、无酚红</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-85-9</td><td>L-谷氨酰胺结晶粉末</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td>层粘连蛋白 1-2 mg/mL L，溶于 50 mM Tris-HCl</td></tr><tr><td>活死细胞成像试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37601</td><td>活细胞中呈绿色荧光（激发/发射 488 nm/515 nm）；死细胞中呈红色荧光（激发/发射 570 nm/602 nm）</td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>760-93-0</td><td>用于 GelMA 制备</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Corning Incorporated</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>22G 针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1362045</td><td>无菌钝头针</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Integra Miltex</td><td>05--02</td><td>用于脑组织解剖的锋利剪刀，已预先灭菌</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>多聚甲醛粉末</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15070063</td><td>青霉素-链霉素（5,000 单位/mL 青霉素；5,000 µg/mL 链霉素）</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning Incorporated</td><td>430591, 430588</td><td>35 mm 和 100 mm 无菌培养皿</td></tr><tr><td>鬼笔环肽</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>iFluor 488 试剂</td></tr><tr><td>光引发剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106797-53-9</td><td>2-羟基-4&amp;prime;-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>10010023</td><td>PBS 1×，细胞培养级，无钙、无镁</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25988-63-0</td><td>聚-L-赖氨酸氢溴化物，分子量 30,000–70,000</td></tr><tr><td>一抗</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>鸡源多克隆抗 GFAP 抗体</td></tr><tr><td>二抗</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td>Alexa Fluor 594 标记抗鸡抗体</td></tr><tr><td>刮铲</td><td>Miltex</td><td>V973-70</td><td>24 号水泥刮铲，已预先灭菌</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Fisherbrand</td><td>3000038</td><td>用于脑组织解剖的显微镜</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>1222C84</td><td>无菌注射器</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-105</td><td>聚丙烯滤膜，用于灭菌</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002--04-4</td><td>来自牛血浆的结晶粉末状凝血酶</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>实验室级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15400054</td><td>无酚红胰蛋白酶，以 PBS 稀释至 1×</td></tr><tr><td>Versene 溶液</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>15040066</td><td>Versene 溶液（0.48 mM），配方为每升 PBS 含 0.2 g EDTA(Na4)</td></tr><tr><td>多孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td>无菌 24 孔板</td></tr></tbody></table>

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3d生物打印

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

星形胶质细胞是一类胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中发挥着至关重要的作用，包括支持神经元及其功能。这些细胞还能响应神经损伤，并保护组织免受退行性事件的侵害。体外研究星形胶质细胞的功能对于阐明这些过程所涉及的机制至关重要，并有助于开发治疗神经系统疾病的新疗法。本实验方案描述了一种通过3D生物打印含星形胶质细胞的生物墨水来构建富含星形胶质细胞的类神经组织结构的方法。本研究采用基于挤出式的3D生物打印机，并从小鼠C57Bl/6品系幼鼠的大脑皮层中提取星形胶质细胞。生物墨水由传代不超过3代的皮层星形胶质细胞与含有明胶、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和纤维蛋白原的生物材料溶液混合制备而成，同时添加层粘连蛋白，以获得最佳的生物打印性能。3D生物打印条件最大限度地减少了细胞应激，从而保证了打印过程中星形胶质细胞的高存活率，打印后立即检测显示细胞存活率为74.08% ± 1.33%。经过1周的培养后，星形胶质细胞的存活率显著提高至83.54% ± 3.00%，表明该3D结构为细胞生长提供了适宜的微环境。该生物材料组分支持细胞黏附并促进星形胶质细胞特性表达，细胞表现出特异性星形胶质细胞标志物——胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，并具有典型的星形胶质细胞形态。这一&#160;可重复的实验方案提供了一种有价值的手段，用于构建富含星形胶质细胞、模拟细胞天然微环境的3D类神经组织，适用于致力于研究星形胶质细胞功能及其在神经系统疾病机制中作用的研究人员。

本研究旨在利用3D生物打印技术，通过逐层沉积含有原代星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水，构建类神经组织。星形胶质细胞从小鼠幼崽的大脑皮层中提取并分离（图1），随后加入生物材料混合物中，从而实现活体3D结构的生物制造。
采用 G 代码（补充文件）设计计算机辅助设计（CAD）模型，构建一个正方形（0.6 × 0.6 mm）互连框架结构，孔径为 1 mm，旨在促进营养物质和氧气的扩散。该框架由 6 层叠加组成，每层之间旋转 90°（图 2A i）。所设计的结构高度约为 5 mm（图 2A ii），便于组织操作。生物墨水的组成还支持制造不同形状的结构（图 2B）。
由明胶、GelMA...

本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

星形胶质细胞是一类胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中具有重要作用，包括对神经元的支持和功能维持。这些细胞还……

星形胶质细胞的3D生物打印代表了神经组织工程领域的一项进步，使得体外模型的生物制造成为可能，有助于理解神经系统疾病中涉及的机制。3D生物打印的主要优势在于能够构建模拟组织生化和力学特性的细胞邻接结构，从而更深入地了解健康与疾病状态下的细胞动态行为。该方案可应用于其他软组织的生物制造，因其基于由天然聚合物和细胞外基质成分组成的生物墨水进行3D生物打印。首先，用弯头显微剪刀将取自安乐死小鼠的皮质组织剪成小块。用一毫升 HBSS 通过吹打上下混悬的方式清洗组织块三次。第三次去除 HBSS 后，加入一毫升 0.05% 胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育组织五分钟。进行机械性组织解离时，轻柔地将组织-胰蛋白酶混合物上下吹打15次。接着，将解离后的混合物转移至15毫升锥形管中，并加入等体积的胎牛血清（FBS）以中和胰蛋白酶活性。随后通过0.4微米细胞滤筛过滤悬液，以去除未解离的组织碎片。用一毫升星形胶质细胞培养基洗涤滤膜。通过离心沉淀过滤后的细胞悬液。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升星形胶质细胞培养基中。将细胞悬液转移至T25培养瓶中，加入培养基至总体积为3.5毫升，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。为获得终浓度为3毫克/毫升的纤维蛋白原，取0.9毫升浓度为10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液加入明胶-甲基丙烯酰化明胶溶液中。为了获得终浓度为0.5%（重量/体积）的光引发剂，将0.015克光引发剂加入已配制的明胶-甲基丙烯酰化纤维蛋白原溶液中。涡旋混匀后，将溶液置于40摄氏度避光保存，以防止光引发剂降解。随后，将溶液经0.2微米滤器过滤至无菌的15毫升锥形管中。将980微升生物材料溶液转移至15毫升锥形管中。为获得终浓度为每毫升2微克的层粘连蛋白，向含有生物墨水的管中加入20微升稀释后的层粘连蛋白。轻轻吹打混匀，避免产生气泡，并将生物墨水溶液置于37摄氏度环境中，待与细胞混合时使用。用0.05%胰蛋白酶消化原代星形胶质细胞5分钟，然后按1:1比例加入FPS中和胰蛋白酶活性。接着将细胞转移至15毫升锥形管中，在200 × g条件下离心5分钟。细胞计数后，将1 × 10⁶个细胞转移至另一锥形管中，并按上述方法离心。仅保留管中200微升上清液，通过轻轻敲击锥形管底部重悬细胞沉淀。为获得终浓度为1×10⁶个细胞/毫升，向含有细胞的管中加入1毫升明胶-明胶甲基丙烯酰基纤维蛋白原溶液，并通过轻柔吹打混匀。使用1000微升移液器将悬浮于明胶-明胶甲基丙烯酰基纤维蛋白原生物墨水溶液中的星形胶质细胞缓慢转移至5毫升塑料注射器中，注意避免气泡产生。将无菌的22号钝头针连接到注射器上。将生物打印机暴露于紫外光下15分钟，然后用70%乙醇擦拭生物打印机，再将注射器连接至生物打印机的打印头，并手动排出生物墨水以去除残留气泡。进行生物打印时，将35毫米的培养皿放置在生物打印机载物台上，使针头与培养皿表面保持0.1毫米的距离以允许针头移动，然后按下“Print”按钮。生物打印完成后，确保注射器移离培养皿，并盖上培养皿盖。将培养皿置于紫外光下，以实现明胶甲基丙烯酰胺的交联。使用无菌刮铲将生物打印的结构转移至24孔板中。加入500微升凝血酶氯化钙溶液，静置30分钟以促进纤维蛋白交联。去除交联溶液后，用2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤构建物，随后将PBS替换为1毫升星形胶质细胞培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每三天更换一次培养基。使用刮刀将生物打印的构建物转移至35毫米的培养皿中。用1毫升PBS清洗构建物。在构建物上加入100微升的活死染色试剂，并在37摄氏度孵育30分钟，期间避光保存。去除死活染试剂后，按所示方法用 PBS 洗涤构建物。将样品转移至共聚焦培养皿中，使用 488 和 570 纳米激发光在共聚焦显微镜下观察构建物内的细胞以获取图像。3D 生物打印后，评估了生物打印支架的完整性，并观察到细胞被包埋在生物材料中，形成了结构清晰的构造。生物打印和交联过程完成后，当构建物在星形胶质细胞培养基中孵育时，大多数细胞呈现圆形形态。生物打印的支架在孵育七天后仍保持完整，尽管观察到一些圆形细胞，但许多星形胶质细胞在构建物内伸展，呈现出典型的星形胶质细胞形态并相互连接。细胞活力在生物打印后立即进行评估，结果显示，在较低速度下打印时，活细胞占总细胞数的比例高达74%，显著高于高速打印条件下的细胞活力。将生物打印的星形胶质细胞的活力与二维培养的星形胶质细胞进行归一化处理，结果表明，在第7天，生物打印的星形胶质细胞活力显著增加。生物打印刚完成后，星形胶质细胞呈现圆形形态，并通过活死染色检测验证。经过一周培养后，星形胶质细胞在支架结构内充分伸展，并表现出与二维培养完全一致的典型细胞形态。通过免疫荧光对3D生物打印的星形胶质细胞进行表征。在生物打印结构中孵育七天后，观察到具有星形形态的高度密集的星形胶质细胞。生物打印的星形胶质细胞表达了特异性星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白，表明在生物打印七天后仍保持了星形胶质细胞表型；这些结果表明，该生物墨水组分提供了生物相容性的微环境，可促进星形胶质细胞的黏附、铺展和生长。通过评估生物打印的星形胶质细胞中特定基因和细胞标志物的表达，可以提供其具有类似神经组织功能的证据，例如在特定刺激下星形胶质细胞的反应性。本方案为构建由多种细胞和生物分子组成的更复杂的类神经结构奠定了基础，从而能够模拟特定的神经发生微环境。

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用于工程神经样组织的小鼠皮质星形胶质细胞的3D生物打印

本视频展示了一种在水凝胶微柱内生成三维星形胶质细胞支架的方法。微柱内部涂有胶原蛋白，将星形胶质细胞引入后，细胞会黏附于胶原蛋白上，并在进一步培养过程中自组装形成三维支架。...

一种在水凝胶微柱内体外生成星形胶质细胞支架的方法

该视频展示了利用悬浮于生物墨水溶液中的星形胶质细胞构建三维生物打印结构的过程。生物打印结构在交联后可促进星形胶质细胞的黏附与铺展，形成类似神经组织的结构。...

一种用于3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

深入了解大脑复杂的活动需要先进的研究工具。在此，我们展示了一种基于丝素-胶原蛋白的新型三维神经组织工程模型，其结构类似于大脑组织。该模型可用于研究神经元网络的组装、轴突导向、细胞间相互作用以及电活动。...

基于丝素蛋白-胶原的极化神经组织工程化三维模型

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。...

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

工程化肌肉组织在再生医学、疾病模型以及作为肉类的替代来源方面具有巨大潜力。本文介绍了由小鼠成肌祖细胞构建肌肉组织的方法，并采用电脉冲对其进行刺激。...

利用小鼠成肌祖细胞构建骨骼肌组织及电刺激的应用

本文及随附视频介绍了我们利用类器官单元-支架法在小鼠中生成组织工程化肠道的实验方案。...

小鼠模型中肠道的组织工程

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人类三维组织工程 体外 肿瘤检测系统

为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

学习使用小鼠皮质星形胶质细胞进行3D生物打印以构建工程神经样组织的方法。该技术有助于研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能及其在神经系统疾病中的作用机制。

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

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