Name: 一种优化的O9-1/水凝胶系统，用于研究神经嵴细胞中的机械信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 了解利用O9-1神经嵴细胞与聚丙烯酰胺水凝胶研究机械信号的方法。该技术揭示机械与化学信号相互作用机制，助力发育生物学与疾病研究。

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我们感谢德克萨斯大学健康科学中心原子力显微镜-UT核心设施负责人Ana-Maria Zaske博士在本项目中原子力显微镜（AFM）方面的专业支持。同时感谢美国国立卫生研究院（NIH）提供的经费支持（项目编号：K01DE026561、R03DE025873、R01DE029014、R56HL142704 和 R01HL142704，授予J. Wang）。

1. 水凝胶制备
注意：所有步骤必须在细胞培养罩内进行，使用前需用乙醇消毒并经紫外线（UV）灭菌，以维持无菌环境。工具（如镊子和移液器）必须用乙醇喷洒处理。缓冲液也必须经过无菌过滤。
<ol>
	<li>氨基硅烷涂层玻璃盖玻片的制备
	<ol>
		<li>将所需数量的玻璃盖玻片放置在一张实验室擦拭纸上。 
		注意：额外准备3–4个盖玻片，以确保有足够的备用，因为它们容易破碎。不同材质的玻璃盖玻片在细胞接种和贴附方面表现出不同的兼容性。建议在开始实验前确定最适合实验的类型（参见材料表）。</li>
		<li>使用酒精灯或本生灯，将每个盖玻片在火焰中来回通过（蛋白测定实验需30秒），以进行灭菌。将每个玻璃盖玻片放置在实验室擦拭纸上冷却。</li>
		<li>待玻璃盖玻片冷却后，将其转移至铺有Parafilm的培养皿中，以防滑动。 
		注意：如果盖玻片未充分冷却，残留热量会将Parafilm熔化并粘附在盖玻片上，导致其无法使用。</li>
		<li>分别向12 mm和25 mm的盖玻片上覆盖约200 μL和800 μL的0.1 M NaOH，并静置5分钟。随后吸除0.1 M NaOH，让盖玻片再自然干燥5分钟，以形成均匀的薄膜。</li>
		<li>盖玻片干燥后，分别向12 mm和25 mm的盖玻片上加入约80 μL和150 μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）。注意避免溶液溢出至Parafilm上。让溶液静置5分钟。</li>
		<li>尽可能吸除多余的APTS，并让残留的APTS再干燥5分钟。将盖玻片浸入无菌去离子（DI）H2O中，彻底清洗三次，每次5分钟。 
		注意：如果玻璃盖玻片未充分清洗，残留的APTS会与戊二醛发生非预期反应，产生白色沉淀，导致盖玻片无法使用。</li>
		<li>将盖玻片转移至新的培养皿中，使反应面朝上。向培养皿中加入足量的0.5%戊二醛，完全覆盖盖玻片，并静置30分钟。</li>
		<li>吸除0.5%戊二醛，并用DI H2O再清洗一次，每次3分钟。将盖玻片反应面朝上放置于实验室擦拭纸或洁净的培养皿中，完全自然干燥后备用。 
		注意：此处可暂停实验流程；盖玻片必须保存在无菌DI H2O中，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硅化盖玻片的制备
	<ol>
		<li>将与氨基硅烷涂层盖玻片相同数量的盖玻片（步骤1.1.1）放置在铺有Parafilm的培养皿中。</li>
		<li>分别向12 mm和25 mm的盖玻片一侧加入40 μL或150 μL的二氯甲基硅烷（DCMS），并静置5分钟。</li>
		<li>吸除盖玻片上残留的溶液，用无菌DI H2O清洗一次，每次1分钟，然后将反应面朝上的盖玻片放置于实验室擦拭纸上，完全自然干燥后再进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水凝胶的制备
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中混合丙烯酰胺、双丙烯酰胺和DI H2O，配制500 μL不同刚度的溶液（参见表1）。涡旋振荡30秒，使其充分混匀。</li>
		<li>迅速加入10%过硫酸铵溶液（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），再次涡旋振荡以充分混合。 
		注意：需新鲜配制10% APS溶液，并置于冰上或分装成单次使用量后冷冻保存，因其对冻融循环敏感。</li>
		<li>分别向干燥的12 mm或25 mm氨基硅烷涂层盖玻片（第1.1节）上加入约33 μL或100 μL上述溶液。</li>
		<li>使用弯头镊子，立即将经DCMS处理的盖玻片覆盖在凝胶溶液上，使处理面接触凝胶溶液，从而将凝胶溶液夹在DCMS处理的盖玻片与氨基硅烷涂层盖玻片之间。</li>
		<li>让凝胶溶液聚合5–15分钟，同时密切监测离心管中剩余溶液的凝胶聚合情况。</li>
		<li>凝胶聚合完成后，使用弯头镊子或刀片将DCMS处理的盖玻片分离，使凝胶保留在原始的氨基硅烷涂层盖玻片上。</li>
		<li>立即将带有附着水凝胶的盖玻片放入预先准备的4孔/24孔或6孔板中，分别加入500 µL和2 mL无菌PBS或DI H2O（对应12 mm和25 mm盖玻片），以防止凝胶干燥。</li>
		<li>对所有盖玻片重复步骤1.3.4–1.3.7。</li>
		<li>将水凝胶浸入无菌PBS或DI H2O中30分钟，以去除多余的丙烯酰胺溶液。可在此处暂停流程，将水凝胶储存在4 °C的无菌PBS或DI H2O中。</li>
		<li>在避光环境中，于锥形管中配制磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯（sulfo-SANPAH）混合液：将2.5 mL的50 mM 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES）（pH=8.5）与25 μL的50 μg/mL sulfo-SANPAH混合，用铝箔包裹以避光。使用移液器充分混匀后备用。 
		注意：2.5 mL sulfo-SANPAH溶液足以处理约二十五个12 mm水凝胶或五个25 mm水凝胶。</li>
		<li>吸除孔板中的PBS或DI H2O。分别向12 mm和25 mm盖玻片上的凝胶中加入约100 μL或500 μL sulfo-SANPAH溶液（步骤1.3.10），确保溶液完全覆盖凝胶表面。 
		注意：调节真空吸力强度，避免强力吸除导致水凝胶撕裂或移位。</li>
		<li>将加有溶液的凝胶置于15 W、365 nm的紫外&#160;光下照射10分钟，无需加盖，以最大限度减少紫外线与sulfo-SANPAH反应的干扰。</li>
		<li>倾斜孔板，吸除多余的sulfo-SANPAH溶液，尽可能回收。用50 mM HEPES清洗凝胶两到三次。</li>
		<li>向含有水凝胶的各孔中分别加入500 μL和2 mL用0.2%乙酸稀释的50 mg/mL I型胶原蛋白溶液。将凝胶置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育过夜。 
		注意：使用0.2%乙酸而非50 mM HEPES稀释I型胶原蛋白，有助于促进其均匀分布和牢固附着。</li>
		<li>吸除I型胶原蛋白溶液，用无菌PBS清洗三次，每次5分钟，以去除多余的胶原蛋白。将水凝胶在含10%马血清和5%胎牛血清（FBS）&#160;的PBS中，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育2小时。 
		注意：添加10%马血清相比仅使用FBS可促进更高的细胞增殖率，如先前发表的研究所示。</li>
		<li>吸除培养基。向每孔中加入500 mL经无菌过滤的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），含10% FBS和1%青霉素-链霉素（P/S）。将凝胶保存在37 °C、5% CO2培养箱中，直至进行细胞培养。</li>
		<li>准备就绪后，在基础培养基中以约1.5 × 104 个细胞/cm2的密度将O9-1细胞接种至培养皿中。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育2天。检查细胞融合度，确保细胞已充分贴附于凝胶，并在收集样本进行分析前确认细胞数量充足。 
		注意：O9-1细胞的复苏、传代和收集步骤详见先前发表的实验方案20。</li>
		<li>继续进行第2、3或4节，对水凝胶进行进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过原子力显微镜进行刚度的定量分析
<ol>
	<li>启动原子力显微镜（AFM）系统计算机，然后启动AFM控制器（参见材料表）。</li>
	<li>将AFM悬臂安装到AFM探针支架上。使用末端带有0.5 μm二氧化硅微球的球形悬臂（带球形微球的悬臂）。 
	注意：对于较硬的水凝胶（如10 kPa、20 kPa和40 kPa），使用弹性系数为0.24 N/m的较硬探针；对于较软的水凝胶（如0.5 kPa和1 kPa），则使用弹性系数为0.059 N/m的较软探针。</li>
	<li>将AFM软件设置为接触模式。</li>
	<li>将硅片安装到AFM样品台上，点击Engage使悬臂接触硅基底，从而采集力-距离曲线。</li>
	<li>利用上述步骤（2.4）获得的力-距离曲线进行校准，点击控制软件中的Calibrate，在热调谐条件下获取悬臂的平均弹性系数，并将校准后的数值保存至控制软件中。</li>
	<li>将附着水凝胶的盖玻片置于60 mm培养皿中，并将其安装到AFM扫描台上作为样品。在开始测量前向培养皿中加入3 mL PBS，以防止凝胶干燥。</li>
	<li>将AFM设置为在接触模式（液体环境）下工作以开始测量。使球形微球持续接触并脱离凝胶样品表面。</li>
	<li>设置悬臂使其偏转阈值保持在10 nm，探针的扫描距离保持在10 μm。然后按照步骤2.4记录力-距离曲线。</li>
	<li>在水凝胶表面至少3至10个不同位置采集至少20条力-距离曲线。</li>
	<li>使用AFM成像与分析软件，对每个位置约20条力-距离曲线计算平均杨氏模量。采用延伸扫描的力-距离曲线及线性化球形模型进行计算，并对每个样品所有位置的杨氏模量取平均值，得到最终的刚度值。 
	注意：杨氏模量及相关数据（即标准差）将自动保存为电子表格文件。</li>
	<li>对所有样品重复执行步骤2.6–2.10。</li>
</ol>
3. 通过免疫荧光染色进行刚度的分子分析
<ol>
	<li>使用镊子将盖玻片转移至新的培养板，以尽量减少因细胞直接在培养板上生长而产生的假阳性信号。用 500 µL 无菌 PBS 洗涤细胞三次，以去除死细胞及残留的培养基。</li>
	<li>在室温下，加入 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 10 分钟，期间避免扰动。随后，每孔加入 500 µL PBS，洗涤细胞三次，每次 2 分钟。 
	注意：如需暂停实验流程，可将样品在 4 °C 下保存。</li>
	<li>在室温下，用 500 µL 0.1% Triton X-100 处理细胞 15 分钟。然后，每孔加入 500 µL PBS，洗涤细胞三次。</li>
	<li>每孔加入 250 µL 含 10% 驴血清（用 PBS 和 0.1% Tween 20 稀释）的封闭液，在室温下封闭 30 分钟。</li>
	<li>在室温下加入 250 µL 一抗，孵育 2 小时，或在 4 °C 下孵育过夜。随后，每孔加入 500 µL PBS，洗涤细胞三次，每次 5 分钟。 
	注意：本实验使用抗 Vinculin（Vcl）抗体（1:250）和抗 AP2 alpha 抗体（1:250），均用 10% 驴血清稀释。</li>
	<li>在室温下，每孔加入 250 µL 含相应二抗和/或用于 F-肌动蛋白染色的鬼笔环肽（按 1:400 稀释于 10% 驴血清中），孵育 30 分钟。然后，用 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。 
	注意：568 nm 标记的鬼笔环肽可与 488 nm 或 647 nm 标记的二抗共孵育，也可单独使用。</li>
	<li>在 250 µL PBS 中加入 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，1:1000 稀释），与细胞孵育 10 分钟，随后用 PBS 最后洗涤一次，持续 2 分钟。</li>
	<li>每孔加入 3–4 滴封片介质。将样品在 4 °C 下保存至少 2 小时，以确保封片介质充分固化后再进行成像。</li>
	<li>使用荧光显微镜对每种水凝胶样品至少拍摄 3 个随机视野，获取各荧光通道的独立图像及合并图像。</li>
</ol>
4. 定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）
<ol>
	<li>将带有贴壁细胞的水凝胶转移至新培养板中用于RNA收集，以尽量减少来自黏附在原培养板上细胞的非目标RNA。用PBS洗涤细胞3次，以去除死细胞和培养基。</li>
	<li>使用RNA提取试剂盒提取总mRNA。根据制造商说明书，使用反转录超级混合液将RNA反转录为cDNA。</li>
	<li>使用引物进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR） Vcl 作为首选的刚度标记物，并使用2进行分析-ΔΔCT 方法 
	注意：Vcl 引物序列：上游 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'；下游 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究的目的是&#160;提供一种有效且高效的方法 体外 系统以更好地理解机械信号对神经嵴细胞（NCCs）的影响。除了遵循上述分步实验方案外，研究人员还需注意，O9-1 NCCs的细胞培养会受到用于制备水凝胶的玻璃盖玻片类型的影响。例如，有研究发现，在特定类型的玻璃盖玻片上接种的细胞（参见 材料表) 存活并增殖良好，而在其他类型玻璃盖玻片上接种的培养细胞则表现出更多的细胞死亡。此外，严格遵循O9-1 NCCs的正确细胞培养条件至关重要38当水凝胶尽快使用或在无菌的37 °C培养箱中储存不超过两天时，细胞培养的质量最佳。
由于该实验方案中每个组分的敏感性，弹性模量在不同实验之间可能存在差异。除了方案中提到的关于10% APS（步骤1.3.2）的注意事项外，还有其他关键因素会影响这种变异性。另一个被怀疑导致原子力显微镜（AFM）测量结果出现较大差异的因素是水凝胶的厚度。先前一项研究探讨了厚度对杨氏模量的影响，厚度范围从15到1000 µm，结果发现厚度差异并未显著改变杨氏模量<sup c...

神经嵴细胞（NCCs）是一类在脊椎动物胚胎发育过程中存在的干细胞，具有显著的迁移能力，并参与多种器官和组织的发育。NCCs 可分化为多种不同类型的细胞，包括感觉神经元、软骨、骨、黑色素细胞和平滑肌细胞，其分化命运取决于神经嵴细胞的轴向起源位置以及局部微环境的引导作用1,2。由于 NCCs 具有向多种细胞类型分化的潜能，因此在神经嵴（NC）发育的任何阶段发生导致调控异常的遗传缺陷，都可能引发多种先天性疾病2。例如，在 NCCs 的形成、迁移和发育过程中出现干扰，会导致一组统称为神经嵴病（neurocristopathies）的发育障碍1,3。这些疾病包括因 NCCs 形成失败而导致的颅面畸形，如 Treacher Collins 综合征；也包括由于 NCCs 具有转移性迁移能力而引发的多种癌症，例如黑色素瘤3,4,5,6。在过去的几十年中，研究人员对 NCCs 在发育和疾病中的作用及其机制取得了显著进展，其中大多数研究集中于化学信号的作用7,8。近年来，机械信号被发现也在 NCCs 的发育过程中发挥着关键但尚未被充分理解的作用9,10。
神经嵴细胞（NCCs）在发育过程中受到环境信号的显著调控，包括调控NCC向多种细胞类型的分化。环境信号（例如物理信号）会影响关键的细胞行为和反应，如功能多样化。机械转导使细胞能够感知并响应这些信号，以维持多种生物学过程2。NCC周围存在邻近细胞和不同基质（如细胞外基质（ECM）），这些结构可产生机械刺激，通过细胞命运决定、增殖和凋亡等过程维持稳态并适应环境变化11。机械转导始于细胞质膜，在此处机械性胞外刺激被感知，进而引发细胞内的调控反应12。整合素、黏着斑和质膜连接结构可将剪切力、应力以及周围基质刚度等机械信号转化为化学信号，从而引发细胞反应12。这些化学信号从质膜传递至最终的细胞调控，通过不同的信号通路完成对机体至关重要的生命过程，例如分化。
多项研究表明，基质硬度产生的机械信号在细胞分化中起着重要作用13,14例如，先前的研究表明，在刚度与脑组织相似（范围为0.1–1.0 kPa）的柔软基质上培养的间充质干细胞（MSCs）可分化为神经元样细胞15,16然而，当间充质干细胞在模拟肌肉硬度的8-17 kPa基质上培养时，会更多地分化为类似肌细胞的细胞；而在较硬的基质（25-40 kPa）上培养时，则观察到向类似成骨细胞方向的分化。15,16机械转导的重要性体现在机械信号通路中的异常和紊乱可能引发严重的发育缺陷和疾病，包括癌症、心血管疾病和骨质疏松症。17,18,19在癌症中，正常的乳腺组织质地较软，而僵硬且致密的乳腺组织会增加乳腺癌的风险，这种环境更类似于乳腺肿瘤。15通过调控基质刚度这一简单操作，可利用该知识研究机械信号对神经嵴细胞发育的影响。 体外 系统，为深入理解与纳米材料相关疾病的进展机制和病因提供了更多优势与可能性。
为了研究机械信号对神经嵴细胞（NCCs）的影响，我们建立了一种高效的方法 体外 基于对已发表方法的优化以及神经嵴细胞对不同机械信号响应的评估，建立了一种神经嵴细胞培养系统20,21提供了一种详细的水凝胶刚度调控制备方案，并用于评估机械信号对神经嵴细胞（NCCs）的影响。为实现该目标，采用O9-1 NCCs作为神经嵴（NC）模型&#160;用于研究刚性与柔性水凝胶响应效应及变化的模型。O9-1 NCCs 是一种稳定的神经嵴细胞系，源自小鼠胚胎（E）8.5 天，可模拟神经嵴细胞（NCCs）的特性 体内 因为它们在特定的分化培养基中可分化为多种神经嵴来源的细胞类型22为了研究神经嵴细胞（NCCs）的力学信号传导，通过调节丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液的浓度制备了具有可调弹性的基质材料，以获得目标刚度，从而模拟生物基质的刚度特性20,21,23为优化神经嵴细胞（特别是O9-1细胞）的基质底物条件，对先前发表的实验方案进行了改进20将水凝胶在胶原蛋白I中孵育，胶原蛋白I用0.2%乙酸稀释而非50 mM HEPES，于37 °C过夜孵育。乙酸的低pH值有助于实现更均匀的分布和更高的胶原蛋白I整合，从而促进细胞外基质蛋白更均匀地附着24此外，在将水凝胶置于培养箱中储存之前，分别在磷酸盐缓冲液（PBS）中使用了浓度为10%的马血清和5%的胎牛血清（FBS）。由于马血清在10%浓度下具有促进细胞增殖和分化的能力，因此被作为胎牛血清的补充添加剂使用。25.
通过该方法，利用细胞外基质蛋白包被（例如 I 型胶原）模拟生物环境，以构建精确的 体外 为神经嵴细胞生长和存活提供环境20,21通过原子力显微镜（AFM）对所制备水凝胶的刚度进行定量分析，该技术是表征弹性模量的常用方法。26为了研究不同刚度水平对神经嵴细胞（NCCs）的影响，将野生型O9-1细胞培养并接种于水凝胶上，进行丝状肌动蛋白（F-actin）免疫荧光（IF）染色，以显示细胞黏附和形态在应对基底刚度变化时的差异。利用该方法 体外 通过该系统，研究人员将能够研究机械信号在神经嵴细胞（NCCs）中的作用及其与其他化学信号的相互作用，从而更深入地理解神经嵴细胞与机械信号之间的关系。

<table><tbody><tr><td>12 mm #1 Corning 0211 玻璃盖玻片</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-012</td><td></td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662165</td><td></td></tr><tr><td>25 mm #1 Corning 0211 玻璃盖玻片</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-025</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>4 孔细胞培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>J61899-AP</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>50% 戊二醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜悬臂梁（球形微珠）</td><td>Novascan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜软件</td><td>Catalyst NanoScope</td><td></td><td>型号：8.15 SR3R1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td>粉末</td></tr><tr><td>抗 AP-2&amp;alpha; 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-12726</td><td></td></tr><tr><td>抗连环蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜（AFM）Bioscope Catalyst</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白（100 mg）</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲基硅烷（DCMS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440272</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>型号 DMi8</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片剂</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-35</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>粉末</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Corning</td><td>35-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>iScript 反转录超级混合液</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素抗生素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 微量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>无菌 1× PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>无菌去离子水</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>U284</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472908</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

一种优化的o9-1/水凝胶系统用于研究神经嵴细胞中的机械信号

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎中具有多向分化潜能的细胞，能够迁移并分化为多种细胞类型，进而形成多种器官和组织。组织硬度产生的机械力作为一种物理信号，在NCC分化过程中发挥关键作用，但其作用机制尚不明确。本文所述方法详细介绍了如何优化制备不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶，准确测定其硬度，并评估机械信号对O9-1细胞（一种模拟NCC的细胞系）的影响 体内 NCCs
水凝胶刚度采用原子力显微镜（AFM）进行测量，并据此显示出不同的刚度水平。在不同刚度的水凝胶上培养的O9-1神经嵴细胞表现出不同的细胞形态以及应激纤维相关基因的表达差异，表明机械信号变化引发了不同的生物学效应。此外，该结果证实调节水凝胶刚度可实现有效的 体外 通过改变凝胶刚度并分析神经嵴细胞（NCCs）中分子与遗传调控，来操控机械信号传导的系统。在相应分化培养基的影响下，O9-1 NCCs 可分化为多种细胞类型，且便于化学信号的操控 体外因此，这 体外 该系统是研究机械信号在神经嵴细胞（NCCs）中的作用及其与化学信号相互作用的强大工具，将有助于研究人员更深入地理解神经嵴发育及相关疾病的分子与遗传机制。

水凝胶制备及通过原子力显微镜与赫兹模型评估其刚度 
在此，提供了一种通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例来制备不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶的详细实验方案。然而，由于缺乏细胞外基质（ECM）蛋白，聚丙烯酰胺水凝胶尚不能支持细胞黏附。因此，需使用磺基-SANPAH作为交联剂，使其共价结合至水凝胶，并与ECM蛋白中的伯胺基团发生反应，从而实现ECM蛋白通过共价连接固定于水凝胶表面 N-sulfo-SANPAH 经紫外线活化后生成的羟基琥珀酰亚胺酯。选用 I 型胶原蛋白作为细胞外基质蛋白，以有效促进 O9-1 细胞的黏附。为确保不同水凝胶的刚度值准确，采用原子力显微镜（AFM）进行刚度评估，该技术常用于测定弹性模量。
聚丙烯酰胺凝胶成功形成并牢固附着于玻璃盖玻片后，凝胶表面均匀，无明显撕裂，且与盖玻片保持良好粘附。通过原子力显微镜（AFM）采用压痕技术原理测定凝胶刚度，该方法使用刚性压头对样品施加特定作用力，以达到所需的压痕深度26。基于赫兹模型（Hertz's model）这一弹性理论，结合...

此处详细描述了研究机械信号的分步实验方案 体外 使用多能性O9-1神经嵴细胞和不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶。

一种优化的O9-1/水凝胶系统用于研究神经嵴细胞中的机械信号

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎中的多能细胞，能够迁移并分化为多种细胞类型，进而形成……

该方法有助于研究神经嵴细胞的机械信号传导及其与化学信号的相互作用，也可用于研究神经嵴发育在疾病中的分子与遗传机制。转移玻璃盖玻片是最具挑战性的步骤，因此应缓慢而专注地进行转移，以防止其破裂或掉落。演示该实验步骤的是我和我实验室的博士后研究员赵雪（Dr. Sherry Zhao）。首先，将所需数量的玻璃盖玻片放置在一片实验室擦拭纸上。然后，用酒精灯火焰反复灼烧每一片盖玻片，以对其进行灭菌。当盖玻片冷却后，向直径12毫米的盖玻片加入约200微升、直径25毫米的盖玻片加入800微升的0.1摩尔氢氧化钠溶液。五分钟后，吸除氢氧化钠溶液，让盖玻片在空气中干燥五分钟，以形成均匀的薄膜。盖玻片干燥后，在直径12毫米的盖玻片上加入约18微升的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS），在直径25毫米的盖玻片上加入150微升APTS。吸出APTS溶液，使残留的APTS干燥5分钟。随后将盖玻片浸入无菌去离子水中，每次5分钟，重复冲洗三次。将清洗后的盖玻片转移至新的培养皿中，确保反应面朝上。将盖玻片浸入足量的0.5%戊二醛溶液中处理30分钟。吸除戊二醛后，用去离子水冲洗盖玻片一次，持续三分钟，并将具有反应活性的一面朝上自然晾干。制备硅化盖玻片时，将与氨基硅烷涂层盖玻片数量相等的盖玻片置于铺有Parafilm衬垫的培养皿中。然后，将12毫米的盖玻片用40微升、25毫米的盖玻片用150微升的二氯甲硅烷（dichloromethane silane, DCMS）处理5分钟。用无菌去离子水将盖玻片清洗一次，每次1分钟，然后将具有反应活性的盖玻片正面朝上放置于实验室擦拭纸上。制备水凝胶时，将新配制的丙烯酰胺凝胶溶液滴加到已干燥的氨基硅烷涂层盖玻片上。使用弯头镊子，立即将经 DCMS 处理的盖玻片转移至凝胶溶液上方，使处理面接触凝胶溶液，从而将凝胶溶液夹在两张盖玻片之间。待凝胶聚合后，用弯头镊子分离 DCMS 处理的盖玻片，使凝胶保留在氨基硅烷涂层的盖玻片上。接着，将带有附着水凝胶的 12 毫米盖玻片浸入预先准备的 4 孔或 24 孔板中，每孔加入 500 微升无菌 PBS 或去离子水；将 25 毫米盖玻片放入 6 孔板中，每孔加入 2 毫升无菌 PBS 或去离子水，孵育 30 分钟。除去多余的丙烯酰胺溶液后，将水凝胶置于室温下的无菌 PBS 或去离子水中保存 30 分钟。随后，在加入磺基琥珀酰亚胺基或 Sulfo-SUNPAH 溶液完全覆盖凝胶之前，吸除孔板中的 PBS 或去离子水。然后将凝胶连同溶液置于未加盖的 15 瓦、365 纳米紫外灯下照射 10 分钟。通过倾斜培养板，尽可能收集每份溶液中的 Sulfo-SANPAH。然后用 15 毫摩尔 HEPES 洗涤凝胶两到三次。向每孔含有水凝胶的孔中加入用 0.2% 乙酸稀释的 15 毫克/毫升 Collagen 1。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下将凝胶孵育过夜。次日，按照论文所述方法进行洗涤，然后将水凝胶在含有10%马血清和5%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。孵育2小时后，向每孔中加入500微升经无菌过滤的含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，并将凝胶置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下保存。当细胞培养准备好后，在bazell培养基中以每平方厘米约1.5 × 10⁴个09-1细胞的密度进行接种。使用镊子将盖玻片转移至新的培养板中，以尽量减少直接在培养板上生长的细胞产生的假信号。随后，加入500 µL 4%多聚甲醛室温固定细胞10分钟，再用500 µL 0.1% Triton X-100在室温下处理细胞。孵育15分钟后，加入250微升含10%驴血清的溶液处理细胞。用菲洛地平按1:400的比例溶于250微升含10%驴血清的溶液中对F-肌动蛋白进行染色，随后加入DAPI孵育10分钟。在每孔中加入三至四滴封片介质前，用PBS洗涤细胞2分钟。在荧光显微镜下，对每个水凝胶样品至少拍摄三个随机视野的图像，分别获取各单独通道及合并通道的图像。通过原子力显微镜（AFM）对水凝胶进行刚度评估时，软水凝胶的力-距离曲线斜率较平缓，因为AFM探针所需的作用力较小；而在较硬的水凝胶上，所获得的斜率则显著更陡峭。随后利用原子力显微镜（AFM）测量结果，通过千帕（kPa）单位的杨氏弹性模量计算水凝胶的平均刚度。在对照组和改性凝胶体系的1 kPa和40 kPa水凝胶中观察了P19和09-1细胞的生长特性。在原始凝胶体系上培养的09-1细胞导致死亡细胞数量更高。相比之下，在改良的凝胶系统上培养的09-1细胞表现出健康的细胞生长状态，并能充分附着于水凝胶基质，仅有少量细胞脱落，表现为圆形细胞极少。在两种水凝胶系统上接种的P19细胞则显示出大量圆形漂浮细胞，且细胞与基质之间的附着能力较差。通过AP-2免疫荧光染色评估神经嵴细胞（NCCs）与改良水凝胶系统的相容性。在接种于改性水凝胶系统上的09-1细胞中，观察到AP-2表达显著增加。此外，09-1细胞在低刚度和高刚度水凝胶上表现出不同的形态，这通过应力纤维的数量差异得以体现。在40千帕水凝胶上培养的09-1细胞中，抗vinculin表达高于在1千帕水凝胶上培养的细胞，表明在较软基质上生长的细胞形成的局灶性黏附复合物少于在较硬基质上生长的细胞。适当的等待时间对于水凝胶的聚合至关重要，因为丙烯酰胺对细胞具有毒性。为获得更好的结果，需将水凝胶浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）或去离子水中至少30分钟。

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发育生物学

一种优化的O9-1/水凝胶系统，用于研究神经嵴细胞中的机械信号

我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置，证明了表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞（NSCs）的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统，特别是在细胞来源稀少（如人神经干细胞）且实验周期至关重要的情况下。...

利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

在本视频中，我们介绍使用荧光显微镜进行荧光染色的实验步骤，以展示在不同硬度水凝胶上培养的神经嵴细胞经鬼笔环肽染色后，细胞骨架结构的可视化与分析方法。...

在不同硬度水凝胶上培养的神经嵴细胞的荧光染色

我们介绍一种新型聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基-PAAm，可实现细胞外基质蛋白的直接结合，且成本低廉、操作简便。将羟基-PAAm水凝胶与微接触印刷技术结合，可独立调控天然细胞微环境中的多种信号，从而用于研究细胞力学转导。...

用于解耦机械转导信号影响的羟基-PAAm水凝胶的制备

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。...

改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

本方案描述了一种生理相关、加压液体方法，用于在神经元中快速且可逆地诱导曲张体形成。...

用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统

O9-1 神经嵴细胞的培养与操作

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。...

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

本方案描述了从小鼠模型中分离和培养颅神经嵴细胞的方法，主要用于细胞迁移研究。我们介绍了所使用的活体成像技术，以及对细胞运动速度和形态变化的分析方法。...

小鼠颅神经嵴细胞的分离、培养及分析：用于研究神经嵴细胞脱离与迁移

该方法旨在阐明细胞外基质信号（如基质刚度、蛋白质组成和细胞形态）调控施万细胞（SC）表型的机制。...

可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

本方案概述了一种 体外 适用于参与迁移实验的分子功能分析 体内...

体外 透明质酸富集的细胞外基质对神经嵴细胞迁移影响的研究

了解利用O9-1神经嵴细胞与聚丙烯酰胺水凝胶研究机械信号的方法。该技术揭示机械与化学信号相互作用机制，助力发育生物学与疾病研究。

一种优化的O9-1/水凝胶系统用于研究神经嵴细胞中的机械信号

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