一种优化的O9-1/水凝胶系统，用于研究神经嵴细胞中的机械信号

该方法有助于研究神经嵴细胞的机械信号传导及其与化学信号的相互作用。它还可以帮助疾病中神经嵴发育的分子和遗传机制。转移玻璃盖滑移是最具挑战性的，因此缓慢而专注地转移它们以防止它们破裂和掉落。

演示该程序的将是我和来自我实验室的博士后研究员Sherry Zhao博士。首先将所需数量的玻璃盖滑片放在一块实验室湿巾上。然后，通过酒精燃烧器的火焰来回传递每个盖玻片，对每个盖玻片进行消毒。

当盖板滑落冷却时，用大约200微升和25毫米盖玻片用800微升0.1摩尔氢氧化钠覆盖12毫米盖玻片。五分钟后，吸出氢氧化钠，让盖子滑落风干五分钟，形成均匀的薄膜。一旦盖玻片干燥，在12毫米盖玻片上加入约18微升氨丙基三乙氧基硅烷或APTS，在25毫米盖玻片上加入约150微升APTS。

吸出接入APTS，让残留的APTS干燥五分钟。之后，将盖子浸没在无菌去离子水中三次冲洗五分钟。将洗净的盖子滑到新鲜的培养皿中，反应性面朝上。

并通过在足够的0.5%戊二醛中浸泡30分钟来处理盖子滑。吸入戊二醛后，用去离子水冲洗盖子滑落一次三分钟，然后风干盖子，反应性面朝上。要准备硅化盖玻片，请将相同数量的盖玻片放在衬有para膜的培养皿中，因为氨基硅涂层盖板滑移。

然后，用40微升处理12毫米盖玻片，用150微升二氯甲烷硅烷或DCMS处理25毫米盖玻片5分钟。用无菌去离子水清洗盖子滑盖一分钟，然后将反应性盖子面朝上放在实验室湿巾上。为了制备水凝胶，将新鲜制备的丙烯酰胺凝胶溶液移液到干燥的氨基硅烷包衣纸上。

使用弯曲的镊子，立即将DCMS处理过的盖玻片转移到凝胶溶液的顶部，处理过的一面接触凝胶溶液，从而在两个盖玻片之间夹住改变凝胶溶液。凝胶聚合后，用弯曲的镊子分离DCMS处理的盖玻片，使凝胶附着在氨基硅烷涂层的盖玻片上。接下来，将带有所附附水凝胶的12毫米盖玻片浸入用500微升无菌PBS或去离子水覆盖的预定4孔或24孔板中，并将25毫米盖玻片浸入覆盖有2毫升无菌PBS或去离子水的6孔板中30分钟。

除去多余的丙烯酰胺溶液后，将水凝胶在室温下将水凝胶储存在无菌PBS或去离子水中30分钟。之后，从孔板中吸取PBS或去离子水，然后加入磺胺基琥珀酰基或磺胺-SUNPAH溶液以完全覆盖凝胶。并将含有溶液的凝胶置于15瓦，365纳米的紫外线下，揭开10分钟。

通过倾斜板收集尽可能多的Sulfo-SANPAH每种溶液。然后用15毫摩尔HEPES洗涤凝胶两到三次。向含有水凝胶的每个孔中加入每毫升15毫克稀释的0.2%乙酸胶原蛋白1。

并将凝胶在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。第二天，按照手稿中所述进行洗涤，然后用含有10%马血清和5%FBS的PBS在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育水凝胶。孵育两小时后，向每个孔中加入500微升无菌过滤的DMEM和10%FBS和1%青霉素链霉素，并将凝胶储存在37摄氏度和5%二氧化碳下。

当细胞培养准备就绪时，在bazell培养基中每平方10至第四个09-1个细胞约1.5倍。使用镊子将盖玻片输送到新板上，以最大限度地减少来自直接生长到板上的细胞的错误信号。然后，使用500微升4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后在室温下用500微升0.1%Triton X-100处理细胞。

15分钟后，用250微升10%驴血清行走细胞。用非洛地平在250微升10%驴血清中以1至400的稀释液染色细胞中的F-肌动蛋白，然后用DAPI孵育10分钟。用PBS洗涤细胞两分钟，然后向每个孔中加入三到四滴安装培养基。

在荧光显微镜下，捕获每个水凝胶样品至少三个随机帧的图像，产生单个和合并的通道。在通过原子力显微镜或AFM对水凝胶的刚度评估中，由于AFM探针所需的力较小，因此软水凝胶的力曲线斜率是温和的。然而，在坚硬的水凝胶上，产生的斜率要陡得多。

然后使用AFM测量值从杨氏弹性模量（以千帕斯卡为单位）计算水凝胶的平均刚度。在对照和修饰凝胶体系的1千帕斯卡和40千帕斯卡水凝胶中观察到P19和09-1细胞的生长特征。在原始凝胶系统上生长的09-1细胞导致死细胞数量增加。

相比之下，在修饰的凝胶系统上生长的09-1细胞表现出健康的细胞生长和对水凝胶底物的充分附着，细胞甲板很少，由最小的圆形细胞指示。接种在两种水凝胶体系上的P19细胞显示出过量的圆形漂浮细胞和缺乏细胞底物附着。通过AP-2的免疫荧光染色评估神经嵴细胞或NCC与修饰的水凝胶系统的相容性。

观察到接种在改性水凝胶系统上的09-1细胞中AP-2表达显着增加。此外，09-1细胞通过不同量的应力纤维表现出基于低刚度或高刚度水凝胶的不同形态。在40千帕斯卡水凝胶上生长的09-1细胞中的抗长春花素表达高于在1千帕斯卡水凝胶上生长的细胞，反映出在较软底物上生长的细胞比刚性底物形成最小的局灶性添加复合物。

适当的等待时间对于水凝胶的聚合至关重要，因为丙烯酰胺对细胞有毒。将水凝胶浸没在PBS或去离子水中至少30分钟，以确保更好的效果。