一种优化的O9-1/水凝胶系统用于研究神经嵴细胞中的机械信号
2021年8月13日
此处详细描述了研究机械信号的分步实验方案 体外 使用多能性O9-1神经嵴细胞和不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶。
该方法有助于研究神经嵴细胞的机械信号传导及其与化学信号的相互作用，也可用于研究神经嵴发育在疾病中的分子与遗传机制。转移玻璃盖玻片是最具挑战性的步骤，因此应缓慢而专注地进行转移，以防止其破裂或掉落。
演示该实验步骤的是我和我实验室的博士后研究员赵雪（Dr. Sherry Zhao）。首先，将所需数量的玻璃盖玻片放置在一片实验室擦拭纸上。然后，用酒精灯火焰反复灼烧每一片盖玻片，以对其进行灭菌。
当盖玻片冷却后，向直径12毫米的盖玻片加入约200微升、直径25毫米的盖玻片加入800微升的0.1摩尔氢氧化钠溶液。五分钟后，吸除氢氧化钠溶液，让盖玻片在空气中干燥五分钟，以形成均匀的薄膜。盖玻片干燥后，在直径12毫米的盖玻片上加入约18微升的氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS），在直径25毫米的盖玻片上加入150微升APTS。
吸出APTS溶液，使残留的APTS干燥5分钟。随后将盖玻片浸入无菌去离子水中，每次5分钟，重复冲洗三次。将清洗后的盖玻片转移至新的培养皿中，确保反应面朝上。
将盖玻片浸入足量的0.5%戊二醛溶液中处理30分钟。吸除戊二醛后，用去离子水冲洗盖玻片一次，持续三分钟，并将具有反应活性的一面朝上自然晾干。制备硅化盖玻片时，将与氨基硅烷涂层盖玻片数量相等的盖玻片置于铺有Parafilm衬垫的培养皿中。
然后，将12毫米的盖玻片用40微升、25毫米的盖玻片用150微升的二氯甲硅烷（dichloromethane silane, DCMS）处理5分钟。用无菌去离子水将盖玻片清洗一次，每次1分钟，然后将具有反应活性的盖玻片正面朝上放置于实验室擦拭纸上。制备水凝胶时，将新配制的丙烯酰胺凝胶溶液滴加到已干燥的氨基硅烷涂层盖玻片上。
使用弯头镊子，立即将经 DCMS 处理的盖玻片转移至凝胶溶液上方，使处理面接触凝胶溶液，从而将凝胶溶液夹在两张盖玻片之间。待凝胶聚合后，用弯头镊子分离 DCMS 处理的盖玻片，使凝胶保留在氨基硅烷涂层的盖玻片上。接着，将带有附着水凝胶的 12 毫米盖玻片浸入预先准备的 4 孔或 24 孔板中，每孔加入 500 微升无菌 PBS 或去离子水；将 25 毫米盖玻片放入 6 孔板中，每孔加入 2 毫升无菌 PBS 或去离子水，孵育 30 分钟。
除去多余的丙烯酰胺溶液后，将水凝胶置于室温下的无菌 PBS 或去离子水中保存 30 分钟。随后，在加入磺基琥珀酰亚胺基或 Sulfo-SUNPAH 溶液完全覆盖凝胶之前，吸除孔板中的 PBS 或去离子水。然后将凝胶连同溶液置于未加盖的 15 瓦、365 纳米紫外灯下照射 10 分钟。
通过倾斜培养板，尽可能收集每份溶液中的 Sulfo-SANPAH。然后用 15 毫摩尔 HEPES 洗涤凝胶两到三次。向每孔含有水凝胶的孔中加入用 0.2% 乙酸稀释的 15 毫克/毫升 Collagen 1。
在37摄氏度和5%二氧化碳条件下将凝胶孵育过夜。次日，按照论文所述方法进行洗涤，然后将水凝胶在含有10%马血清和5%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。孵育2小时后，向每孔中加入500微升经无菌过滤的含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，并将凝胶置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下保存。
当细胞培养准备好后，在bazell培养基中以每平方厘米约1.5 × 10⁴个09-1细胞的密度进行接种。使用镊子将盖玻片转移至新的培养板中，以尽量减少直接在培养板上生长的细胞产生的假信号。随后，加入500 µL 4%多聚甲醛室温固定细胞10分钟，再用500 µL 0.1% Triton X-100在室温下处理细胞。
孵育15分钟后，加入250微升含10%驴血清的溶液处理细胞。用菲洛地平按1:400的比例溶于250微升含10%驴血清的溶液中对F-肌动蛋白进行染色，随后加入DAPI孵育10分钟。在每孔中加入三至四滴封片介质前，用PBS洗涤细胞2分钟。
在荧光显微镜下，对每个水凝胶样品至少拍摄三个随机视野的图像，分别获取各单独通道及合并通道的图像。通过原子力显微镜（AFM）对水凝胶进行刚度评估时，软水凝胶的力-距离曲线斜率较平缓，因为AFM探针所需的作用力较小；而在较硬的水凝胶上，所获得的斜率则显著更陡峭。
随后利用原子力显微镜（AFM）测量结果，通过千帕（kPa）单位的杨氏弹性模量计算水凝胶的平均刚度。在对照组和改性凝胶体系的1 kPa和40 kPa水凝胶中观察了P19和09-1细胞的生长特性。在原始凝胶体系上培养的09-1细胞导致死亡细胞数量更高。
相比之下，在改良的凝胶系统上培养的09-1细胞表现出健康的细胞生长状态，并能充分附着于水凝胶基质，仅有少量细胞脱落，表现为圆形细胞极少。在两种水凝胶系统上接种的P19细胞则显示出大量圆形漂浮细胞，且细胞与基质之间的附着能力较差。通过AP-2免疫荧光染色评估神经嵴细胞（NCCs）与改良水凝胶系统的相容性。
在接种于改性水凝胶系统上的09-1细胞中，观察到AP-2表达显著增加。此外，09-1细胞在低刚度和高刚度水凝胶上表现出不同的形态，这通过应力纤维的数量差异得以体现。在40千帕水凝胶上培养的09-1细胞中，抗vinculin表达高于在1千帕水凝胶上培养的细胞，表明在较软基质上生长的细胞形成的局灶性黏附复合物少于在较硬基质上生长的细胞。
适当的等待时间对于水凝胶的聚合至关重要，因为丙烯酰胺对细胞具有毒性。为获得更好的结果，需将水凝胶浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）或去离子水中至少30分钟。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了利用多能性O9-1神经嵴细胞和不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶在体外研究机械信号的详细实验方案。该方法有助于探索神经嵴发育过程中机械信号与化学信号之间的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 神经嵴细胞在发育过程中起着至关重要的作用。
- 理解机械信号传导可为细胞行为提供深入见解。
- 聚丙烯酰胺水凝胶可在实验中实现刚度的精确控制。
- 在发育过程中，机械信号与化学信号相互作用。
研究目的
- 研究神经嵴细胞的机械信号传导。
- 理解机械信号与化学信号之间的相互作用。
- 探索参与神经嵴发育的分子机制。
使用的方法
- 细胞培养用玻璃盖玻片的制备。
- 使用酒精灯对盖玻片进行灭菌。
- 利用不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶。
- 观察细胞对机械信号的响应行为。
主要结果
- 该方法有效展示了神经嵴细胞中的机械信号传导。
- 研究中识别出处理玻璃盖玻片所面临的技术挑战。
- 结果表明，机械信号与化学信号之间存在显著的相互作用。
- 该研究有助于理解神经嵴发育在疾病中的作用。
结论
- 本方案提供了一种研究神经嵴细胞的可靠方法。
- 理解机械信号传导有助于指导治疗策略的制定。
- 未来的研究可进一步拓展相关分子机制的探索。
常见问题
行业应用价值
该方法建立了一个可调节的体外系统，用于解析细胞外基质的力学信号如何影响神经嵴细胞的命运，这在发育障碍建模和组织工程中具有重要意义。通过精确控制基底刚度，并同步获取细胞形态和基因表达的读数，该系统有助于在神经发育和再生治疗的早期靶点验证中进行机制性风险评估。该系统将理化参数与分子结果相联系，为筛选调控机械转导通路的干预措施提供了预测价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够探究基质刚度如何调控神经嵴细胞分化及应力纤维形成，从而阐明机械敏感性信号通路。
- 操作价值：提供一个可重复的实验平台，用于关联生物物理输入与分子输出（如 AP-2 和 vinculin 的表达）。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的、依赖于刚度的表型读数（细胞形态、贴附性、标志物表达），适用于检测标准化。
- 操作价值：支持在明确且可调节的微环境中筛选调节机械敏感信号通路的化合物。
转化与临床前研究
- 科学价值：构建与疾病相关的力学微环境模型，用于评估组织硬度改变对神经嵴来源谱系的影响。
- 操作价值：通过将水凝胶定义的条件与细胞功能反应相联系，促进从机制发现到临床前验证的连续性研究。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段的工作流程，其中对靶点生物学机制的深入理解有助于先导化合物的发现，尤其适用于涉及机械转导或基质相互作用的靶点。
- 发现生物学：支持围绕细胞外基质刚度如何影响神经嵴细胞行为及谱系特化的假设验证。
- 筛选：提供可直接用于检测的、刚度可控的环境，用于评估化合物对细胞黏附、形态和分化的影响。
- 分析：提供可量化的输出结果，包括通过原子力显微镜（AFM）测定的杨氏模量、应力纤维排列以及标志物表达（如 AP-2、vinculin），用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：将体外力学调控与神经嵴相关疾病及纤维化相关病理过程的生理病理意义相联系。
- 企业级复用：建立一种标准化且可调节的水凝胶平台，适用于多个研究干细胞或前体细胞力学生物学的项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在生理相关系统中将刚度作为明确定义的变量进行分离，减少靶点验证中的机制模糊性。
- 操作价值：通过标准化水凝胶制备、刚度测量和细胞培养方案，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过提供微环境刚度如何调控靶点结合及表型响应的早期洞察，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于靶点在神经嵴来源组织中对机械环境的敏感性，实现风险调整后的靶点优先排序。
实施注意事项
- 需要具备水凝胶制备、基于原子力显微镜（AFM）的刚度测量，以及细胞骨架和谱系标志物的荧光免疫染色方面的专业知识。
- 依赖于原子力显微镜进行纳米力学表征，以及荧光显微镜进行表型分析。
- 需要在不同团队之间进行标准化，以确保水凝胶刚度、包被处理及细胞接种密度的一致性。
- 在将该体系扩展至其他干细胞类型或除I型胶原以外的细胞外基质蛋白时，需考虑相应的适应性调整。
- 存在一些实际限制，例如未聚合丙烯酰胺的毒性，以及为确保生物相容性而必须进行的充分洗涤步骤。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:34
Preparation of Aminosilane-Coated and Siliconized Glass Coverslips
3:13
Preparation of Hydrogels
6:40
Molecular Analysis of Stiffness via Immunofluorescence Staining
8:04
Results: Characterization of O9-1 Cells Grown on Control and Modified Hydrogel System
10:31
Conclusion
