Name: 三维胶原基质支架植入作为肝脏再生策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 了解三维胶原基质支架植入技术用于肝脏再生策略，通过大鼠模型评估胶原支架在肝纤维化中的修复效果。该方法基于组织工程学原理，为慢性肝病治疗提供新途径。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢实验医学科实验动物设施的工作人员、护士Carolina Baños G.在技术和手术方面的支持、Marco E. Gudiño Z.在显微摄影方面的协助，以及Erick Apo在肝脏组织学方面的帮助。本研究由国家科学技术委员会（CONACyT）资助，项目编号SALUD-2016-272579，以及PAPIIT-UNAM TA200515项目资助。

本研究经墨西哥国立自治大学（UNAM）医学院伦理委员会（DI/115/2015）和墨西哥总医院伦理委员会（CI/314/15）批准。该机构符合有关实验动物生产、饲养和使用的全部技术规范，并依据国家法规（NOM-062-ZOO-1999）获得合法认证。本研究使用的雄性Wistar大鼠体重为150–250 g（6–8周龄），均来自墨西哥国立自治大学（UNAM）医学院实验动物中心。
1. 从牛股骨中获取胶原基质支架
<ol>
	<li>从经墨西哥卫生和农业部门认证的屠宰场获取牛股骨髁。
	<ol>
		<li>使用外科器械仔细分离髁上的脂肪、肌肉和软骨。使用切割锯将髁组织切成 3 cm × 3 cm 的片段，并用毛巾清除脂肪和血液。用清水冲洗髁片段。</li>
		<li>将片段置于 1 L 阴离子洗涤剂（10 g/L）中煮沸（92 °C）30 分钟。用清水洗涤髁片段两次，以彻底去除残留的阴离子洗涤剂。</li>
		<li>使用滤纸（0.5 mm）干燥髁片段 3 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从步骤 1.1 中所述的片段制备尺寸为三角形（1 cm × 1 cm × 1 cm）、厚度为 0.5 cm 的脱细胞骨基质（CMS）（图 1A）。
	<ol>
		<li>将片段置于 100 mL 的 0.5 M 盐酸（HCl）中，持续振荡脱矿 10 分钟。移除 HCl。 
		注意：使用氢氧化钠（10 M）中和残余 HCl。</li>
		<li>每次用 100 mL 蒸馏水冲洗片段，持续振荡 15 分钟，共冲洗三次。使用滤纸（0.5 mm）干燥 CMS 1 小时。</li>
		<li>使用体视显微镜15分析 CMS 的结构特性（孔径大小、孔隙形成及孔隙连通性）（图 1B）。</li>
		<li>使用扫描电子显微镜16分析 CMS 小梁的粗糙表面（图 1C）。</li>
		<li>使用解剖器械进行揉捏和拉伸，评估 CMS 的力学性能变化（可塑性和柔韧性）（图 1D）。</li>
		<li>将 CMS 装入灭菌袋中，采用过氧化氢等离子体灭菌 38 分钟。将灭菌后的 CMS 保存在原包装中，置于干燥环境，温度保持在 20–25 °C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术区域的准备以及动物模型的处理与准备
<ol>
	<li>用2%氯己定溶液对术区、工作台、显微外科手术显微镜及座椅进行消毒。所有手术器械、手术海绵、棉拭子和一次性手术单均通过热力灭菌（121 °C/30 min/100 kPa）进行灭菌。</li>
	<li>将大鼠（n=5）分为三组，每组五只：1. 假手术组，2. 肝切除组，3. 肝切除联合慢性束缚应激（CMS）组，并于第3天、第14天和第21天对各组进行观察。
	<ol>
		<li>在后肢肌肉注射氯胺酮（35 mg/kg）和赛拉嗪（2.5 mg/kg）。 
		注意：镇静期通常持续 30-40 分钟。</li>
		<li>使用手术皂和双刃刀片剃除腹部皮肤（5 cm × 2 cm），并用局部10%聚维碘酮溶液进行三次皮肤消毒&#160;轮次17.</li>
		<li>将动物置于俯卧位的温热板上，颈部过度伸展以保持气道通畅（图2).</li>
		<li>通过呼吸模式及四肢退缩反射的消失来评估麻醉深度。</li>
		<li>在剃净毛发的皮肤周围铺一次性手术巾，以剑突为参考点，在白线处用手术刀做一2.5 cm切口。注意避开腹壁血管，以防出血。</li>
		<li>放置腹部牵开器，观察腹腔。使用解剖镊夹取左肝叶并置于金属板上（图3A). 
		注意：假手术组仅分离左肝叶，随后将肝脏放回腹腔。使用3-0尼龙缝线缝合腹壁和皮肤。</li>
		<li>在有或无 CMS 的实验组中，使用手术刀片和无菌手术刀片（#15）进行两次切割，完成约 40% 的肝切除术。使用三角形金属模板（1 cm × 1 cm × 1 cm）执行肝切除术图3B).</li>
		<li>为防止肝脏出血，用纱布在肝脏边缘施加手术压迫，持续5分钟。</li>
		<li>在手术前，将 CMS 浸入无菌生理盐水中水化 20 分钟。将 CMS 植入肝切除部位，并在肝组织与 CMS 之间使用四针缝线固定，以防止生物材料移位。使用 7-0 不可吸收聚丙烯缝线（图3C). 
		注意：无需通过二次手术移除缝线；缝线可作为参考标记，用于识别 CMS 植入部位。</li>
		<li>将肝脏放回腹腔，使用3-0尼龙缝线缝合腹壁和皮肤。用浸有外科碘的海绵对手术切口进行两轮清洁。观察并监测动物的生命体征。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>在后肢肌肉注射美格鲁米宁氟尼辛（2.5 mg/kg）。镇痛药物的使用需经机构动物护理与使用委员会批准。</li>
	<li>麻醉恢复期间，将动物置于带有实验动物垫料的单独聚碳酸酯盒中，放置于温度可控（23 °C）、无噪音的环境中。</li>
	<li>观察动物恢复情况，并监测其2小时内饮水和进食情况。术后监测应遵循机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。</li>
</ol>
4. 血清中肝功能的评估
<ol>
	<li>在手术前（基线值）以及第3、14和21天，从麻醉后的&#160;动物侧尾静脉采集血液样本（500 µL）。</li>
	<li>将血液样本在室温（23 °C）下以850 × g 离心10分钟；分离血清并储存在-80°C，直至使用。</li>
	<li>进行一组肝功能检测：血清白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TB）和直接胆红素（DB）（表1）。</li>
</ol>
5. 安乐死与组织处理
<ol>
	<li>按照上述方案，在每次评估时（第3、14和21天）对动物进行麻醉&#160;。</li>
	<li>采用机构动物护理与使用委员会批准的方法实施安乐死。</li>
	<li>使用手术刀在白线处做一5-6 cm的切口，以观察腹腔器官，并对假手术组和实验组有无CMS的肝切除区域进行拍照。</li>
	<li>从所有研究组动物中采集肝组织样本（2 cm × 2 cm；0.40–0.45 g），置于4%甲醛溶液中固定24小时，用于后续组织学评估。</li>
</ol>
6. 组织学分析
<ol>
	<li>将肝组织置于4%甲醛中固定，并使用一系列浓度的酒精（60%、70%、80%、90%、100%）进行脱水处理；随后将组织置于二甲苯中（1小时），并包埋于石蜡中16。</li>
	<li>使用切片机将石蜡包埋块切成4 µm厚的切片，用于制备八张载玻片。</li>
	<li>进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色和马松三色染色16。</li>
	<li>在光学显微镜下观察染色切片，选择含有和不含有中央静脉周围肝窦阻塞综合征（CMS）的代表性肝组织区域。以4倍、10倍和40倍放大倍数获取显微图像，并使用适当的软件对图像进行处理18&#160;（参见材料表）。</li>
</ol>

<ol><li>Li, N., Hua, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Immune cells in liver regeneration.</a> Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).</li>
<li>Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering.</a> Science. 260 (5110), 920-926 (1993).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+liver+decellularized+extracellular+matrix+bioink+for+three-dimensional+cell+printing-based+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Shafiee, A., Atla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Toward+a+new+era+of+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Toward a new era of medicine.</a> Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).</li>
<li>Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+and+their+derivatives+effectively+promotes+liver+regeneration+to+attenuate+acetaminophen-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).</li>
<li>Sancho-Bru, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+possibilities+of+stem+cells+in+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterologia+y+Hepatologia%22%5BJournal%5D)">Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases.</a> Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).</li>
<li>Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Identification%2C+phenotypic+characterization%2C+biological+properties+and+potential+for+regenerative+medicine+through+biomaterial+micro-engineering+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche.</a> Methods. 99, 62-68 (2016).</li>
<li>Freedman, B. R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+to+mimic+and+heal+connective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials to mimic and heal connective tissues.</a> Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+collagen+based+biomaterials+and+the+resulting+materials+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties.</a> Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).</li>
<li>El Baz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplant+of+hepatocytes%2C+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%2C+and+in+vitro+hepatocyte-differentiated+mesenchymal+stem+cells+in+a+chronic+lver+failure+experimental+model%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).</li>
<li>Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+multiple+osteogenic+differentiation+pathways+of+mesenchymal+stem+cells+through+different+scaffold+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).</li>
<li>Chan, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+collagen+scaffold+promotes+intrinsic+vascularisation+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications.</a> PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).</li>
<li>Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+for+whole+organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularization for whole organ bioengineering.</a> Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).</li>
<li>Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+decellularized+extracellular+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).</li>
<li>Gacek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+microscope%2C+neglected+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochemii%22%5BJournal%5D)">Stereo microscope, neglected tool.</a> Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).</li>
<li>Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+survivable+liver+biopsy+procedure+in+mice+to+assess+non-alcoholic+steatohepatitis+%28NASH%29+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).</li>
<li>The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Use+of+Chemical+Depilatory+Agents+on+Laboratory+Animals%22">Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://research.utexas.edu">https://research.utexas.edu</a> (2021).</li>
<li>Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+learning+in+neural+net+models+with+Poisson+and+Gauss+connectivities%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Networks%22%5BJournal%5D)">The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities.</a> Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).</li>
<li>León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterization+of+collagen+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).</li>
<li>León, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematological+and+biochemical+parameters+in+Sprague+Dawley+laboratory+rats+breed+in+CENPALAB%2C+Cenp%3ASPRD%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Electronica+de+Veterinaria%22%5BJournal%5D)">Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD.</a> Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).</li>
<li>Tsuchiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapies+for+liver+cirrhosis%3A+MSCs+as+%22conducting+cells%22+for+improvement+of+liver+fibrosis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
<li>Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Universidad+Nacional+Aut%C3%B3noma+de+M%C3%A9xico%22">Universidad Nacional Autónoma de México</a>. , Specialty of Urology thesis (2011).</li>
<li>Montalvo-Jave, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+bioprosthesis+for+the+treatment+of+bile+duct+injury+in+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model.</a> International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。Benjamín León-Mancilla 是墨西哥国立自治大学（Universidad Nacional Autónoma de México，UNAM）生物医学科学博士项目的一名博士生，并获得了 DGAPA-UNAM 奖学金。

对于肝纤维化或肝硬化患者，器官移植是主要的治疗手段。然而，仅有少数患者能够从该手术中获益，因此有必要为等待移植的患者提供其他治疗替代方案。组织工程是一种具有前景的策略，其利用具有再生潜能的支架和细胞2,4,13。在该操作过程中，切除部分肝脏是一个关键步骤，因为肝脏作为高度血管化的器官，极易发生大量出血。因此，必须对术区进行止血处理，以防止此类并发症的发生。此外，为确保组织与生物材料之间的相互作用，需将肝组织与CMS（细胞基质支架）进行固定连接，这一过程通常借助缝合线来实现。然而，操作时必须格外谨慎，以避免撕裂肝组织并引发术后出血。
尽管本文提出的生物材料来源于牛（异种源），但尚无关于该生物材料在大鼠体内反应的数据，这使得选择性肝切除成为可能。相比之下，2/3肝切除模型已被证明会因切除大量肝组织而导致动物死亡14。此外，由于在肝切除和CMS操作中难以标...

肝脏是维持体内稳态和蛋白质合成最重要的器官之一1。然而，肝病是全球范围内导致死亡的主要原因。在肝损伤的晚期阶段，包括肝硬化和肝细胞癌，临床推荐的治疗方法是肝移植。但由于供体稀缺且移植成功率较低，组织工程（TE）和再生医学（RM）领域已开发出新的技术2,3。
组织工程（TE）涉及利用干细胞、支架材料和生长因子4，以促进炎症性、纤维化及水肿器官和组织的修复1,5,6。支架中所用的生物材料可模拟天然细胞外基质（ECM），为细胞的定向重塑提供物理、化学和生物学信号7。胶原蛋白是从真皮、肌腱、肠道和心包组织中提取的最丰富的蛋白质之一8,9。此外，胶原蛋白可作为生物聚合物，通过生物打印或静电纺丝技术制备二维和三维支架10,11。本研究团队是首个报道使用骨源性胶原蛋白用于肝组织再生的研究。另一项研究报道了使用从牛皮中提取的牛胶原蛋白合成的支架，其孔隙均匀且紧密排列，但彼此之间无连通性12。
脱细胞化可保留天然的细胞外基质（ECM），从而允许后续引入具有干细胞潜能的细胞13,14。然而，该技术在小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、牛和马的肝脏、心脏、肾脏、小肠及膀胱中仍处于实验阶段3,14。目前，在任何动物肝切除模型中，被切除的肝组织体积均未得到替代。然而，使用额外的支撑结构或网络（生物材料）以促进细胞增殖和血管生成，可能对肝脏实质功能的快速恢复至关重要。因此，支架材料可作为再生或修复慢性肝病组织的替代策略，进而克服供体短缺以及肝移植临床并发症所带来的局限性。

<table><tbody><tr><td>阴离子去垢剂</td><td>Alconox</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>活检包埋盒</td><td>Leica</td><td>3802453</td><td></td></tr><tr><td>相机 DMX</td><td>尼康</td><td>DXM1200F</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖酸氯己定 4%</td><td>BD</td><td>372412</td><td></td></tr><tr><td>25 mm × 40 mm 盖玻片</td><td>康宁</td><td>2980-224</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200-M</td><td>CAS 17372-87-1</td></tr><tr><td>乙醇，纯品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>CAS 64-17-5</td></tr><tr><td>氟尼辛葡甲胺</td><td>默克密理博（Merck Millipore）</td><td>Q-0273-035</td><td></td></tr><tr><td>75 mm × 25 mm 玻片</td><td>康宁</td><td>101081022</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>默克</td><td>H9627</td><td>CAS 571-28-2</td></tr><tr><td>盐酸 37%</td><td>默克</td><td>339253</td><td>CAS 7647-01-0</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>比萨农业</td><td>Q-7833-028</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>尼康</td><td>Microphoto-FXA</td><td></td></tr><tr><td>显微外科立体显微镜</td><td>Zeiss</td><td>OPMI F170</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer 黄色盖帽管</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>RM2125</td><td></td></tr><tr><td>模式动物：Wistar大鼠</td><td>国立自治大学&amp;oacute;noma de M&amp;eacute;xico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙3-0（Dermalon）</td><td>Covidien</td><td>1750-41</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯 7-0</td><td>Atramat</td><td>SE867/2-60</td><td></td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘皮肤溶液</td><td>Diafra SA de CV</td><td>1.37E+86</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>DSM-950</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，颗粒</td><td>J. T. Baker</td><td>3722-01</td><td>CAS 1310-73-2</td></tr><tr><td>软件 ACT-1</td><td>尼康</td><td>版本 2.70</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>EZ4Stereo 8X-35X</td><td></td></tr><tr><td>Sterrad 100S</td><td>强生公司</td><td>99970</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 带针注射器（27G × 13 mm）</td><td>SensiMedical</td><td>LAN-078-077</td><td></td></tr><tr><td>组织处理仪（Histokinette）</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5（组织包埋仪）</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>5229</td><td></td></tr><tr><td>三色染色试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT15</td><td></td></tr><tr><td>Unicell DxC600 分析仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>BC 200-10</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>比萨农业畜牧业</td><td>Q-7833-099</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>CAS 1330-20-7</td></tr></tbody></table>

三维胶原基质支架植入作为肝脏再生策略

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

肝脏疾病是全球范围内的首要致死原因。过量饮酒、高脂饮食以及丙型肝炎病毒感染可促进肝纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌的发生。在疾病晚期，临床推荐的治疗方案是肝移植，以改善并延长患者寿命。然而，仅有10%的移植手术能够成功，器官可获得性、术前及术后操作流程以及高昂的费用均与该结果直接相关。细胞外基质（ECM）支架已作为一种组织修复的替代方案出现。这些生物材料的主要优势在于其良好的生物相容性和移植物接受度。尽管已在肝切除模型中评估了恢复肝脏大小和正常功能的能力，但尚未评估使用支架或其他类型支撑结构来替代被切除肝组织体积的效果。
在大鼠肝脏中进行了部分肝切除术，并移植了来自牛髁突的胶原基质支架（CMS）。切除了左侧肝叶组织（约40%），并以相同比例外科植入CMS。术前和术后均评估了肝功能检测指标。术后第3、14和21天，处死动物并进行大体及组织学评估。在第3天和第14天，观察到CMS周围存在脂肪组织，无临床排斥或感染迹象；至第21天可见新生血管形成及CMS被重新吸收。苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色和Masson三色染色显示炎症反应极轻微，并可见邻近细胞向CMS迁移。结果表明，CMS在肝组织中表现良好，可能成为研究慢性肝病组织再生与修复的有用替代方法。

骨脱矿会改变髓腔支架（CMS）的力学性能，但不会改变其孔隙的原始形态或相互连通的结构。 CMS 可以具有任意形状，因此可根据所选器官或组织的大小和形状进行调整19。在本实验方案中，我们使用了三角形的 CMS（图 1A-D）。采用大鼠模型评估 CMS 异种移植体在肝脏中的再生能力。尽管肝脏是一种脆软的器官，但本方案中实施的手术操作确保了 CMS 能够稳定固定（图 2 和 图 3A-C）。切除左叶 40% 的肝组织可使部分器官用于评估，同时保持其余肝脏组织完整，从而能够比较植入物与天然实质组织的变化。此外，我们采集了血液样本，以评估 CMS 植入前后肝脏功能的变化。
<p class="jove_conten...

肝脏疾病可由多种原因引发，导致纤维化或肝硬化。移植是恢复健康的唯一选择。然而，鉴于可移植器官的稀缺，必须探索替代方案。我们的研究提出在动物模型的肝组织中植入胶原支架。

肝脏疾病是全球范围内的首要死因。过量饮酒、高脂饮食以及丙型肝炎病毒感染可促进肝纤维化，……

该方法通过在肝脏中植入胶原基质作为支架，以促进肝脏再生。这种植入技术为探索恢复切除组织形态和体积的策略开辟了新途径，从而减少麻醉时间、手术时长及恢复时间。该方法可用于促进肝纤维化模型以及其他哺乳动物物种中的再生过程。该方法基于组织工程学与再生医学，旨在促进受损组织的修复。首先，使用2%氯己定溶液对术区工作台、显微外科手术显微镜及座椅进行消毒；随后，将取自牛髁突的胶原基质支架置于无菌生理盐水中水化20分钟。接下来，使用外科皂液和双刃刀片，剃除一只6至8周龄雄性Wistar大鼠腹部的皮肤毛发（该大鼠已麻醉），然后使用10%聚维碘酮溶液对皮肤进行三次消毒。将动物置于俯卧位的温热板上，颈部过伸以保持气道通畅。通过呼吸模式及四肢撤退反射的消失来评估麻醉深度。随后在剃毛的皮肤周围放置一次性手术巾，以剑突为解剖标志，使用解剖镊在腹白线上做一道2.5厘米的切口，注意避免损伤腹壁血管以防止出血。放置腹腔牵开器后，观察腹腔。使用解剖镊夹取左肝叶并将其置于金属板上。使用无菌的1厘米×1厘米×1厘米三角形金属模板，进行肝切除术。为防止肝脏出血，用纱布在肝脏边缘施加外科压迫，持续五分钟。接着，使用7-0不可吸收聚丙烯缝线，通过在肝组织与支架之间缝合四针，将水合胶原基质支架植入肝切除部位，以防止生物材料移位。将肝脏复位至腹腔内，并用3-0尼龙缝线缝合腹壁和皮肤。用浸有外科碘的海绵清洁手术切口两次，并监测动物的生命体征。然后将动物置于侧卧位。给予镇痛剂后，将动物放入带有实验动物垫料的独立聚碳酸酯盒中，置于温度可控、无噪音的环境中。观察麻醉后的恢复情况，并监测两小时内水和食物的摄入量。假手术组与植入或未植入胶原基质支架的实验组在术后3天、14天和21天的肝功能无差异，表明胶原基质支架不会干扰肝功能。术后第3天的组织学分析显示，肝脏中存在胶原基质支架并未引发异物反应，且可见疏松结缔组织的明显存在。在第14天和第21天，疏松结缔组织更为丰富，胶原基质支架小梁周围被肝细胞包绕，提示肝细胞已迁移至胶原基质支架中。可见由血管灌注的肝细胞区域，而附着于胶原基质支架小梁的肝细胞有时被疏松结缔组织包绕。进行肝切除术时，应采用无菌技术以避免感染，术后需施加压迫以防止肝脏出血。此外，使用7-0缝线植入胶原基质支架，以避免撕裂。在纤维化动物模型中植入胶原基质支架后，可评估用于肝再生的鼻源性植入的优势。目前尚未评估使用胶原基质支架替代肝脏切除组织的研究。这些成因性材料为慢性肝病领域的另一种治疗选择开辟了道路。

three-dimensional-collagen-matrix-scaffold-implantation-as-liver

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。...

全肝脱细胞与再细胞化

为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。...

组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

组织工程通常包括 体外 扩增以创建用于组织再生的自体移植物。本研究介绍了一种组织扩增、再生与重建的方法 体内...

压缩胶原中的组织匀浆：一种含细胞的生物移植物用于单阶段重建修复

一种创新的生物制造技术被开发出来，用于构建在结构特征、组分和力学性能方面类似于天然组织的三维结构 体内 组织。该技术采用了一种新开发的牺牲材料——BSA橡胶，可转移精细的空间特征，实现对 体内...

三维仿生技术：新型生物橡胶在胶原水凝胶中构建明确的微米与宏观结构

本文提供了一种新型三维肝细胞培养平台——反向胶体晶体支架的详细制备方案，以及评估肝细胞行为的相关技术。该聚乙二醇（PEG）支架具有可调控的孔径尺寸、良好的孔间连通性，并能够偶联细胞外基质蛋白，从而显著提升Huh-7.5细胞的性能。...

倒置胶体晶体聚乙二醇支架的制备：用于肝组织工程的三维细胞培养平台

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

本方案介绍了一种具有伴随性纤维化间质区室的三维仿生模型。该模型采用生理相关浓度的水凝胶按比例制备，模拟间质细胞外基质的生物物理特性，而细胞外基质是细胞相互作用、肿瘤生长及转移的活性调节介质。...

一种用于在具有可调生物物理特性的三维环境中研究肿瘤-间质相互作用的肝癌仿生模型

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

类器官技术革新了器官发育、药物发现和疾病研究中的个性化组织建模。类器官工程正朝着构建复杂合成组织的方向发展。其目标是整合形态发生、类组装体技术与生物基质，以推动组织工程的进步。本实验方案有助于模拟肝脏器官发生过程，并为合成组织的构建建立指导性规范。...

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

了解三维胶原基质支架植入技术用于肝脏再生策略，通过大鼠模型评估胶原支架在肝纤维化中的修复效果。该方法基于组织工程学原理，为慢性肝病治疗提供新途径。

三维胶原基质支架植入作为肝脏再生策略

探索更多视频