Name: 使用脑和脊柱联合手术用双病毒载体靶向新生大鼠的皮质脊髓束 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习利用双病毒载体技术靶向新生大鼠皮质脊髓束进行基因治疗的方法。该方案通过精准手术操作实现特定神经元亚群的转导，为研究脊髓损伤后的神经修复机制提供重要工具。

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本工作由儿童烧伤医院（Shriners Hospitals for Children）提供的研究员资助项目 SHC-84706 资助。

以下所有外科手术和动物护理程序均已获得天普大学动物护理与使用委员会的批准。所述方案为可存活手术，动物在完成相应时间点后，通过腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥钠实施安乐死。
1. 术前准备
<ol>
	<li>使用3.5 nL玻璃毛细移液管制备至少两根拉制的玻璃针，用于病毒注射；一根用于DREADD病毒，另一根用于rCre病毒。为预防术中针头断裂，建议准备4-5根针头。</li>
	<li>使用显微剪刀剪去针尖多余的玻璃部分1-2 mm。</li>
	<li>对于每根针头，将其置于30°角，使用微移液管斜面打磨仪制备出孔径为30-40 µm、斜面角度为45°的针尖。</li>
	<li>将针头存放于带盖的培养皿中，随后将培养皿置于生物安全柜内的紫外灯下照射15分钟以进行灭菌。</li>
	<li>在手术前从-80 °C冰箱中取出适量体积的病毒，提前准备好所需病毒，注意每只动物需要各3 µL的两种病毒。 
	注意：不使用时应将病毒置于冰上运输和保存。本实验方案使用AAV2-hM3Dq-mCherry和AAV2-retroCre病毒，每只动物各注射3 µL。用于制备顺向传播AAV2病毒的DREADD质粒为pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry（见材料表），病毒滴度为1.54 × 1012 基因组拷贝 (GC)/mL；用于制备逆向传播AAV2病毒的Cre质粒为pAAV-CMV-scCre，病毒滴度为4.27 × 1012 GC/mL。</li>
	<li>将注射器插入微泵，并将其固定在带有游标尺的显微操作仪上。</li>
	<li>为便于直观确认针头内病毒的存在或缺失，可将有色染料（如红色油溶染料）注入针头中。注意避免针头内产生气泡。</li>
	<li>将玻璃针头插入注射器，确保针头安装到位。</li>
	<li>如有条件，使用独立的注射泵分别处理每种病毒。若仅有一台注射泵可用，则需准备两个独立的针头，并在更换病毒时更换已使用的针头。</li>
</ol>
2. 麻醉与手术部位准备
<ol>
	<li>使用电子天平称量动物体重。记录术前体重，以确定所需麻醉剂的用量。 
	注意：本方案发现，在整个手术过程中确保满意麻醉水平最可靠的麻醉技术是氯胺酮与低温的联合使用。单独使用氯胺酮不足以确保充分麻醉，而添加赛拉嗪则在增加术中死亡率方面具有较窄的安全阈值。单独使用低温对于长时间手术而言亦不充分（双节段脊柱与脑部联合手术可能需要） &gt;1小时稳定麻醉状态）。</li>
	<li>通过皮下注射稀释的氯胺酮（10 mg/mL）使幼鼠麻醉，注射部位为肩胛骨之间，给药剂量为100 mg/kg；注射后等待5分钟。 
	注意：例如，在出生后第5天，一只幼年大鼠体重为10 g，需给予0.1 mL稀释后的氯胺酮溶液（10 mg/mL）。</li>
	<li>将幼鼠置于碎冰上 6-8 分钟。为防止冻伤，可将动物放入乳胶手套或帕拉菲尔膜（parafilm）中，避免其与冰直接接触。</li>
	<li>用镊子用力夹住足部以确认适当的麻醉深度。如果出现反射性回缩，则需在冰上再放置2分钟，然后再继续操作。</li>
	<li>使用浸有5%碘溶液的无菌纱布，将消毒剂广泛涂抹于动物头部和背部区域。随后，使用浸有70%乙醇的纱布进行消毒。每种消毒剂各使用三次，交替以碘溶液和乙醇浸湿纱布进行擦拭。 
	注意：幼崽仅在出生后14天才睁开眼睛，因此无需进行眼部护理。</li>
	<li>若动物需接受双重手术（脑部 + 脊柱），术前应于肩胛骨之间皮下注射生理盐水负荷量（0.02 mL/g）。 
	注意：如果动物在手术过程中恢复反应，需要追加麻醉，则将动物重新置于冰上5分钟。</li>
</ol>
3. 手术区域与器械准备
<ol>
	<li>对包括手术刀柄、咬骨钳、止血钳、中号弯头镊子和牵开器在内的外科器械进行高压灭菌。</li>
	<li>准备好显微镜，并安装新生大鼠立体定位适配器，将其牢固地固定在成年型立体定位仪支架内。</li>
	<li>使用无菌手套进行手术。打开一包预包装的无菌外科手套，将无菌手套的包装纸铺在桌面上，用作放置使用过的器械的额外无菌区域。 
	注意：必须遵循良好的外科操作规范，并在整个手术过程中保持无菌状态。</li>
	<li>将11号刀片固定在手术刀柄上。准备好无菌生理盐水、4.0号铬制肠线缝合线、4.0号丝线缝合线，以及用于控制出血的材料，例如无菌纱布、无菌棉签和三角巾。</li>
	<li>按照上述方法设置两个手术区域，其中一个区域用于开颅术，另一个区域用于颈椎椎板切除术。</li>
	<li>取出动物并将其固定在立体定位适配器上：由于新生鼠软骨成分较多，应轻柔地将耳杆大致对准下颌关节方向固定。水平稳定后，轻柔地插入前部咬合器。 
	​注意：为获得“平坦”的手术操作面，通常采用的经验做法是将耳杆置于相同高度，而咬合器则置于约低2-3个刻度的位置。</li>
</ol>
4. 实施开颅手术并暴露躯体运动皮层
<ol>
	<li>用镊子在头皮顶部中线处按压，触摸矢状缝，确定切口位置。沿矢状缝平面做一长度为 1 cm 的切口，起始位置位于眼线正上方。牵紧皮肤，以确保切口干净、笔直且精确。</li>
	<li>用镊子轻轻探查颅骨表面，仔细观察冠状缝与矢状缝的走行线，以及镊子沿顶骨和额骨移动时可能产生的凹陷，从而识别前囟（冠状缝与矢状缝交汇处）。</li>
	<li>在目标侧使用加重复钩维持切口开放状态。注意：脊髓注射在右侧进行，颅内注射在左侧进行。</li>
	<li>使用棉签头与显微剪刀结合清除腱膜组织，充分暴露前囟区域，以提高定位准确性。确保冠状缝向外侧充分暴露，为后续注射提供大致的定位模板。</li>
	<li>使用显微剪刀切除前囟附近左侧额骨约 3 × 2 mm 的骨片。 
	注意：当骨瓣被小心移除后，应形成一个清晰的窗口，暴露出脑组织， ready for injection。对侧脑部残留的缝线结构可作为视觉参考，帮助在前后（AP）轴向上保持注射准确性。</li>
	<li>用棉签头清除任何碎屑、脑脊液（CSF）和血液。 
	注意：血液或脑脊液轻微遮挡视野属于正常现象，建议定期使用棉签头清理操作区域。 
	<img alt="脑立体定位坐标示意图；以前囟为参考点并标注位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62698/62698fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"></li>
</ol>
图3：相对于前囟的颅内注射坐标（毫米）示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62698/62698fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 加载病毒并定位注射器
<ol>
	<li>用移液器吸取约 5 µL 病毒液滴加到一块石蜡膜上，将注射针尖置于病毒液滴表面。</li>
	<li>确保向注射器中加载过量的病毒，以保证注射过程顺畅。例如，当总共注射 3 µL（每个注射位点 1 µL）时，使用微量泵以 250 nL/s 的速度吸取 4 µL 病毒液。</li>
	<li>用实验室擦拭纸去除多余的病毒液。</li>
	<li>调整显微操作仪位置，使游标尺清晰可见，并将针头置于矢状缝上方。</li>
	<li>将针头下降至前囟所在区域的稍上方（图 3），记录前后（AP）和内外侧（ML）坐标。</li>
	<li>由于注射将位于左侧，从前囟的 ML 坐标分别减去 1 mm、1.5 mm 和 2.0 mm（ML：-1.0、-1.5、-2.0）以确定目标坐标。 
	注意：三个注射位点的 AP 位置均位于前囟前方 +0.5 mm 处。</li>
	<li>移动针头至第一个注射位点。AP：+0.5，ML：-1.0</li>
	<li>将针头下降至暴露的大脑表面，直至轻微压入外层皮质。记录针头高度，并从脑表面高度再下降 0.6 mm 以到达注射位置。注射深度：皮质表面下 -0.6 mm。 
	注意：每次注射时均需记录脑表面深度，因为大鼠体位可能发生轻微变动。</li>
</ol>
6. 向躯体运动皮层注射病毒
<ol>
	<li>针头到位后，设置注射器以 250 nL/min 的速度注入 1 µL 溶液。</li>
	<li>注射完成后，让针头在皮层内留置 3 分钟。</li>
	<li>按照其他坐标重复注射：相对于前囟，在深度均为 -0.6 mm 的位置沿皮层共进行 3 次注射：1) 前后向（AP）：+0.5 mm，内外向（ML）：-1.0 mm；2) 前后向（AP）：+0.5 mm，内外向（ML）：-1.5 mm；3) 前后向（AP）：+0.5 mm，内外向（ML）：-2.0 mm。</li>
	<li>注射完成后，参照第 9 节进行缝合，并将动物转移至另一手术台进行颈椎椎板切除术。</li>
</ol>
7. 创建脊柱窗以进行精确的脊髓注射
<ol>
	<li>通过手指触诊颅底来确定切口位置。在中线处，使用#11刀片从颅底后方1-2 mm处开始切口，并向后延伸1 cm以暴露浅层肌肉。用拇指和食指拉紧皮肤，保持张力，以确保切口整齐。</li>
	<li>使用刀片的尖端，沿浅层肌肉的中线轻轻进行一系列切割，暴露脊髓腔和深层脊髓肌。用一对镊子撑开肌肉，以观察手术视野。 
	注意：浅层肌肉呈淡粉色，而深层脊髓肌则呈淡灰白色。</li>
	<li>一旦暴露深层脊髓肌，将牵开器插入手术视野。如有必要，使用镊子夹住侧方的皮肤和肌肉，将其拉伸至牵开器齿部周围。将手术视野牵开至7-8 mm宽，以获得无遮挡的脊柱视野。</li>
	<li>通过其突出并向背侧延伸的棘突以及被一个大型穹顶状肌肉包裹的特征，识别第二颈椎（C2或枢椎）。使用镊子或钝性探针触探并确认该棘突，因其将作为定位的解剖标志。 
	注意：相邻的C3椎体常被较大的C2肌肉部分遮挡；因此，使用镊子或骨刮匙对C3处肌肉进行轻柔分离，有助于明确椎体边界，辅助椎体计数。</li>
	<li>使用骨刮匙的平边，沿椎板方向由内侧向外侧轻轻刮除两侧的深层脊髓肌，暴露C3-C7椎体。操作应平行于椎板进行，以确保充分暴露，从而清晰分辨各椎板结构。如有出血，使用棉签头控制。</li>
	<li>使用一对显微剪刀，小心剪开C6和C7节段软骨性椎板的侧缘。计数椎体节段时，以C2作为参考定位。</li>
	<li>使用精细镊子，小心移除已解剖的椎板部分，以暴露脊髓。确保手术窗口足够大，能够容纳目标注射部位。使用上述显微剪刀和镊子，清除可能刺伤脊髓的骨缘锐利或不规则部分。</li>
	<li>按照第3.6节所述，将动物固定于立体定位颅骨夹持器中。此外，在动物躯干下方放置卷起的纱布，以抬高其后肢。 
	注意：抬高动物后肢可有效将胸廓抬离夹持器表面，防止呼吸运动影响注射针头的位置。</li>
	<li>开始注射前，使用棉签头和Sugi三角纱布轻轻吸除手术窗口内的血液或脑脊液，避免损伤脊髓。此外，应在手术窗口周围建立屏障，防止持续出血或脑脊液渗漏堵塞注射部位。可通过在脊髓窗口的侧方放置一小块可吸收棉片来实现此目的。</li>
</ol>
8. 靶向轴突末梢的脊髓内直接注射
<ol>
	<li>使用玻璃注射针的尖端，通过识别脊髓动脉来大致确定脊髓的中线位置。然而，如果脊髓动脉明显偏离中心或存在任何偏移，则应通过C2棘突的位置来估算中线，并沿脊柱长度向下推断其位置。 
	注意：有关病毒装载的说明，请参见第5.1节。</li>
	<li>确定位置后，将针头置于C5椎板后方近似中线处，并以此作为参考点。然后，使用显微操作器将针头向右侧横向移动0.3 mm。降低针头直至其刚好接触脊髓表面；从此深度将针头刺入脊髓0.6 mm。如有必要，继续进针直至穿透脊髓，随后将针头回撤或下移至适当深度。</li>
	<li>以250 nL/min的速度注射1 µL的retroAAV2-scCre。注射完成后，等待2分钟，使病毒充分扩散进入脊髓，然后缓慢撤出针头。在脊髓暴露区域内的另外两个位点重复上述注射操作，使用相同的横向和深度坐标，一个位于中点，另一个位于T1椎板前方附近。</li>
</ol>
9. 伤口闭合与术后护理
<ol>
	<li>将动物从立体定位仪中取出，并移除牵开器或钩子。用几滴无菌生理盐水清洗伤口区域。</li>
	<li>使用4.0丝线缝合头皮，共缝合两到三针。</li>
	<li>缝合颈部切口时，使用4.0铬制肠线紧密缝合肌肉层（两针即可）。使用4.0丝线缝合颈部皮肤切口（预计四针）。</li>
	<li>动物缝合完毕后，在缝线处适量涂抹液体敷料。</li>
	<li>将动物置于加热灯下，并密切监测直至完全苏醒。待动物清醒、能够活动且身体干燥后，用无菌纱布轻轻清洁伤口。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。</li>
	<li>将动物放回母鼠所在的饲养笼中。需注意防止母鼠忽视或吞食幼崽：
	<ol>
		<li>术前一周开始，每天两次轻柔地抓握并接触母鼠（每次5–10分钟），使实验人员与母鼠相互熟悉，为手术做好准备。</li>
		<li>将幼崽一同放回饲养笼，以尽量减少对母鼠的干扰。</li>
		<li>手术当天，皮下注射acepromazine（1.5 mg/kg），每12小时一次（q12 h）。 
		注意：镇痛处理不仅可为幼崽提供镇痛作用，还能促进其尽早恢复活动，有助于重新融入母鼠照料。</li>
		<li>术后开始皮下注射buprenorphine（0.05 mg/kg），每8小时一次（q8 h），连续使用3天（术后第0、1、2天）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+in+the+pediatric+population%3A+A+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).</li>
<li>Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+pediatric+spinal+cord+injury+in+the+united+states%3A+Years+1997+and+2000%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000.</a> Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).</li>
<li>Bregman, B. S., Goldberger, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+plasticity+and+sparing+of+function+after+spinal+cord+damage+in+neonatal+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats.</a> Science. 217 (4559), 553-555 (1982).</li>
<li>Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipsilateral+corticospinal+projections+after+large+lesions+of+the+cerebral+hemisphere+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats.</a> Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).</li>
<li>Commissiong, J. W., Toffano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+spinal+cord+transection+at+different+postnatal+ages%3A+Recovery+of+motor+coordination+correlated+with+spinal+cord+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines.</a> Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).</li>
<li>Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+neuropathology+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+developing+and+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats.</a> Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualizing+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li>
<li>Pawliuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+sickle+cell+disease+in+transgenic+mouse+models+by+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy.</a> Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).</li>
<li>Atasoy, D., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+tools+for+causal+cellular+and+neuronal+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).</li>
<li>Brandt, H. M., Apkarian, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin-dextran%3A+A+sensitive+anterograde+tracer+for+neuroanatomic+studies+in+rat+and+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey.</a> Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).</li>
<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li>
<li>Reiner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).</li>
<li>Oguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+virus+vector+infection+to+the+prefrontal+network+of+the+macaque+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain.</a> PloS One. 10 (7), 0132825(2015).</li>
<li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).</li>
<li>Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+corticospinal+tract+following+midthoracic+spinal+injury+in+the+postnatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).</li>
<li>Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+recovery+after+spinal+cord+injury+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).</li>
<li>Tillakaratne, N. J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+of+stepping+in+rats+after+a+complete+neonatal+spinal+cord+transection+is+not+due+to+regrowth+across+the+lesion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site.</a> Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).</li>
<li>Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+motor+cortical+plasticity+after+cortical+lesions+in+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats.</a> Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).</li>
<li>Gennaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stroke+in+the+developing+rat+motor+cortex+induces+age-+and+experience-dependent+maladaptive+plasticity+of+corticospinal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 47(2017).</li>
<li>Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrichta%2C+AM+%22The+rat+nervous+system%22">The rat nervous system</a>. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).</li>
<li>Kjell, J., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+spinal+cord+injury%3A+From+pathology+to+potential+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies.</a> Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).</li>
<li>Takeoka, A., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+local+proprioceptive+feedback+circuits+initiate+and+maintain+locomotor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury.</a> Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).</li>
<li>Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+propriospinal+interneurons+in+recovery+from+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).</li>
<li>Ohne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+in+rats+with+cervical+spinal+cord+hemisection-neuroanatomical+validation%5BTitle%5D)+AND+%22IBRO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation.</a> IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li>
<li>Sheikh, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrogradely+transportable+lentivirus+tracers+for+mapping+spinal+cord+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).</li>
<li>Kinoshita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+circuit+for+hand+dexterity+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates.</a> Nature. 487, 235-238 (2012).</li>
<li>Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+injection+of+a+lentiviral+vector+highlights+multiple+motor+pathways+in+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160(2019).</li>
<li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+tract+transduction%3A+A+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).</li>
<li>Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+as+a+tracer+for+labeling+axons%3A+Implications+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration.</a> Plos One. 9 (2), 87447(2014).</li>
<li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Abdellatif, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((delivery+to+the+spinal+cord%3A+Comparison+between+lentiviral%2C+adenoviral%2C+and+retroviral+vector+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems.</a> Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).</li>
<li>Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+specificity+and+application+of+anterograde+transsynaptic+AAV+for+probing+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+forelimb+motor+function+restoration+after+cervical+spinal+cord+hemisection+in+rats%3A+A+comparison+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults.</a> Behavioural Neurology. 2016, 1035473(2016).</li>
<li>Alstermark, B., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+for+skilled+reaching+and+grasping%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuits for skilled reaching and grasping.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).</li>
<li>García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+subcortical+pathways+promote+recovery+of+skilled+hand+function+in+rats+after+corticospinal+and+rubrospinal+tract+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries.</a> Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).</li>
<li>Tohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+propriospinal+neurons+to+recovery+of+hand+dexterity+after+corticospinal+tract+lesions+in+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).</li>
<li>Z'Graggen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+sprouting+and+impulse+rerouting+after+unilateral+pyramidal+tract+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion.</a> Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticospinal+circuits+from+the+sensory+and+motor+cortices+differentially+regulate+skilled+movements+through+distinct+spinal+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons.</a> Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).</li>
<li>Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用可注射的化学遗传学修饰剂对脑活动进行可诱导的基因调控，是研究脊髓损伤（SCI）后恢复机制的有力工具。当结合荧光示踪技术在组织学上验证解剖学精度时，对可诱导G蛋白偶联受体（DREADD）的靶向准确性进一步提高。本文介绍了一种可靠的方法，用于探索抑制或激活特定神经通路（使用兴奋性或抑制性DREADD）是否能够促进轴突再生或 sprouting34,35。将一种可逆向运输的病毒载体注射至脊髓，可特异性标记特定神经元群体，无论是直接标记还是通过其突触连接进行标记，使该方法成为评估神经损伤后神经生物学反应的理想选择。
如上所述，通过新生动物模型研究脊髓损伤（SCI），以阐明儿科人群与成人人群之间此前未知的差异，只会使研究更加复杂。因此，研究设计范围更窄。新生动物研究领域的共识是，SCI 后观察到的改善效果依赖于轴突再生能力的增强和出芽增加，这种现象在啮齿类动物出生后约第 7 天之前存在3,<sup cl...

尽管脊髓损伤（SCI）在儿童人群中相对罕见，但其具有极强的创伤性，会导致永久性残疾，需要极为周密的长期规划。此外，与成人人群相比，更大比例的儿童脊髓损伤属于颈段损伤且为完全性损伤1,2。在哺乳动物中普遍存在的一种特征是，新生个体在脊髓损伤后的恢复能力显著优于成年个体，这为研究年轻群体中恢复机制的驱动因素提供了机会3,4,5。尽管如此，针对新生和幼年啮齿类动物的研究仍较少，部分原因在于幼年动物解剖结构更为紧凑，精确靶向特定神经元群体的技术难度更高6。本文重点介绍将高效顺行性和逆行性腺相关病毒载体直接注射至大鼠脊髓，结合Cre依赖性DREADDs技术调控主要运动通路，从而拓展多模态再生研究的应用范围。
病毒载体是重要的生物学工具，具有广泛的应用，包括引入遗传物质以替代靶基因、上调生长蛋白以及描绘中枢神经系统（CNS）的解剖结构7,8,9。脊髓运动通路的许多解剖学细节曾通过经典示踪剂（例如生物素化葡聚糖胺）进行研究。尽管传统示踪剂在揭示神经解剖结构方面发挥了关键作用，但其也存在局限性：即使注射位置准确，它们也会非特异性地标记通路，且已有研究发现它们可被受损轴突摄取10,11,12。因此，在再生研究中，这可能导致错误解释，例如将断裂的轴突误认为是再生的纤维。
以下方法采用近期在调控研究中广泛使用的双病毒载体系统，将两种不同的病毒载体分别导入同一神经元的两个不同区域13,14一种是可局部感染投射神经元胞体的载体；另一种是可从投射神经元的轴突末梢逆向运输的逆向载体图1）。逆向病毒载体携带Cre重组酶，局部载体则包含 &#34;Cre-On&#34; 双flox序列，其中编码一种荧光蛋白（mCherry）。该天然转基因序列相对于启动子呈反向排列，并在其两侧各有一个LoxP位点图2）。因此，mCherry 仅在双重转导的投射神经元中表达，其中 Cre 重组酶介导 LoxP 位点之间的重组事件，使转基因方向翻转至正确的读码框，从而允许 DREADD 和荧光蛋白同时表达。一旦病毒转基因处于正确方向，在需要时即可通过另行注射的配体（即氯氮平-N-氧化物）短暂诱导神经调节。该方案旨在验证在新生儿中进行可诱导性神经调节的研究，其中通过注射 DREADD 以选择性调控皮质脊髓束（CSTs）。双病毒系统起到保险作用，确保所有 DREADD 阳性神经元&#160;细胞在荧光下可被追踪，且具有高保真性，可用于验证注射效果。
该方法还有助于弥补新生儿研究领域的空白。小儿脊髓损伤（SCI）具有其独特挑战，针对再生、 sprouting（出芽）或可塑性的研究应强调新生儿与成体之间的差异3,15,16,17。通过优化手术操作，并结合尼氏染色进行前期解剖学研究，验证了颅内和脊髓注射的定位坐标。本研究旨在提供一种可对新生大鼠进行双侧注射、且具有更高准确性和存活率的方法。
在本模型中，以颅骨前囟为参考定位，将顺行性病毒载体注射至躯体运动皮层的细胞体中18,19。对于脊髓注射，则将逆行性病毒载体注射至脊髓V–VII层，该区域是皮质脊髓束（CST）轴突终末的所在位置20,21。目前仍有许多基础性问题尚待阐明，例如不同损伤模型对幼年动物的影响有何特异性，以及其后续功能恢复过程与成年动物相比存在哪些差异。本研究展示了一种可靠的方法，可用于研究新生啮齿类动物颈段脊髓损伤及其前肢功能的恢复能力。相比之下，以往大多数研究主要关注腰段或胸段脊髓损伤后的运动功能恢复5,22,23,24。通过将双病毒载体系统与本文所述的新型注射技术相结合，该实验方案有助于缓解新生啮齿类动物研究中可能遇到的某些难题（例如存活率问题）。该方法具有可靠性高、操作性强和适用范围广的特点：通过对该技术进行细微调整，即可实现对不同神经通路的靶向标记，例如腹侧皮质脊髓束、背侧皮质脊髓束以及上行性背侧通路。
对于该系统，首先在目标神经元胞体所在区域注射一种局部作用的病毒（例如 AAV2）。随后，在该神经元群体的轴突末梢处注射第二种可逆向运输并调控局部病毒表达的病毒。因此，根据定义，只有皮质脊髓神经元会被标记。选择带有组成型活性 CMV 启动子的 retroAAV-Cre 病毒，因为该穿梭质粒可用于产生多种 AAV 血清型，以实现多种细胞类型中 Cre 依赖性的基因表达。对于皮层注射，选用 AAV2，并由 synapsin-1 启动子驱动转基因表达，以将表达限制在神经元中。由于这种双病毒系统更依赖于目标神经元群体的起源和投射终点，因此只要启动子能够在目标神经元群体内驱动目的基因表达，便可使用多种不同的启动子。例如，兴奋性神经元特异性启动子 CamKII 可替代 synapsin-1 启动子。除了使用这些 AAV 血清型外，还可利用高效逆向转运的慢病毒（HiRet）25 实现对未成熟神经元以及（程度较轻的）成年皮质脊髓运动神经元的逆向转运。HiRet 慢病毒采用嵌合型狂犬病病毒/VSV 糖蛋白，以靶向突触部位的摄取并实现逆向运输。结合 Tet-On 启动子，该双病毒系统可实现依赖于逆向运输的诱导型基因表达26,27。
逆向病毒可将载体插入目标神经元的突触间隙，使其被该细胞的轴突摄取并运输至胞体。尽管慢病毒载体在基因治疗研究中已取得巨大成功，并能实现长期表达，但本研究转向使用腺相关病毒（AAV）载体，主要基于以下几个简单原因26,28：AAV更具经济性，效果相当，且由于其生物安全等级较低，操作上的后勤负担更小29,30,31,32。虽然最常用的血清型AAV2在皮质脊髓束（CST）轴突的转染中表现出较强的效率，但未来研究者应注意，AAV1具有一定灵活性，因其可实现跨突触标记，从而为后续研究提供多种可能的应用方式33。最后的一项改进是将Cre重组酶编码于逆向病毒中，以便同时引入多种顺向病毒载体，从而减少不必要的实验室病毒浪费，并最大化DREADDs以正确方向表达的可能性。
最终，本方案展示了同时向大脑皮层和颈椎部位注射，分别特异性靶向皮质脊髓束的胞体和轴突末梢。在大脑皮层和脊髓中均可见高保真转染效果。尽管所述方案针对5日龄的Sprague Dawley大鼠优化而成，但经过对麻醉条件进行微调后，亦适用于出生后4至10日龄的幼鼠。&#160;立体定位坐标

<table><tbody><tr><td>#11 手术刀片</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-11</td><td>用于手术刀。</td></tr><tr><td>#10 手术刀片</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-10</td><td>用于手术刀。</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>用于麻醉的皮下注射和液体推注</td></tr><tr><td>4.0 丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>771-683G</td><td>用于皮肤缝合</td></tr><tr><td>4.0 铬制羊肠线缝合线</td><td>DemeTECH</td><td>NN374-16</td><td>在闭合过程中重新结合肌肉。</td></tr><tr><td>48000 微量移液器斜面打磨仪</td><td>世界精密仪器公司</td><td>32416</td><td>用于修整拉制后的玻璃毛细管尖端，以制备功能性玻璃针。</td></tr><tr><td>5% 碘溶液</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>L01020-08</td><td>用于手术部位的消毒。</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于新制备玻璃针的灭菌，以及手术准备过程中的动物模型</td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketaset）</td><td>硕腾</td><td>240048</td><td>用于在手术期间维持动物处于正确的意识状态。</td></tr><tr><td>珠式灭菌器</td><td>CellPoint</td><td>5-1450</td><td>对手术器械进行加热灭菌。</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Okaus</td><td>REV.005</td><td>用于手术准备过程中称量动物体重。</td></tr><tr><td>柔性针头连接装置</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>用于清洗玻璃针并装填红色油染料至玻璃针中。</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>对于拉制的玻璃针，应设计用于纳升注射器。</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Roboz</td><td>RS-7231</td><td>适用于外科手术的常规使用。</td></tr><tr><td>中弯钳</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>用于外科手术的常规用途。</td></tr><tr><td>带游标刻度的显微操作器</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td>用于手术中的精确定位。</td></tr><tr><td>显微剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>用于切割新拉制的玻璃毛细管上的玻璃丝。</td></tr><tr><td>标准实验室立体定位仪</td><td>斯托尔廷</td><td>51600</td><td>固定新生儿立体定位仪支架</td></tr><tr><td>带小鼠的实验室标准 &amp;和新生儿适配器</td><td>51615</td><td>用于颅脑手术和脊髓注射期间的新生儿颅骨固定</td><td></td></tr><tr><td>带有光度计和游标尺目镜的显微镜</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>N/A</td><td>用于观察和测量拉制玻璃毛细管形成功能性玻璃针时的斜面情况。</td></tr><tr><td>微注射泵控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>62403</td><td>控制注射速率。</td></tr><tr><td>纳升级2000泵头注射器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>500150</td><td>以受控方式加载并注射病毒。</td></tr><tr><td>针头拉拔器</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>将玻璃毛细管加热并拉伸，以制成玻璃针。</td></tr><tr><td>pAAV-CMV-scCre</td><td>吴实验室&amp;nbsp;</td><td></td><td>Cre 质粒</td></tr><tr><td>pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry（质粒 #44361）</td><td>Bryan Roth&amp;rsquo;通过Addgene获取实验室的s基因</td><td></td><td>DREADD 质粒</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>贝米斯</td><td>PM-996</td><td>为协助将病毒装入纳米注射器。</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头（25G × 5/8）</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>用于1 mL和10 mL注射器，以便对动物模型进行注射。</td></tr><tr><td>大鼠牙齿镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5152</td><td>用于抓握棘突。</td></tr><tr><td>红油</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>为观察病毒在注射过程中进入组织提供可视化条件。</td></tr><tr><td>牵开器</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>用于撑开手术切口。</td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>Roboz</td><td>RS-8300</td><td>在手术过程中去除脊柱上的肌肉。</td></tr><tr><td>手术刀片刀柄</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>用于手术过程中切开动物模型的皮肤和脂肪垫。</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>适用于外科手术的常规使用。</td></tr><tr><td>移除订书钉镊子</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750347</td><td>若订书钉安装不当，需将其拆除。</td></tr><tr><td>无菌布</td><td>Phenix Research Products</td><td>BP-989</td><td>为手术提供无菌操作表面。</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>普尔itan</td><td>806-WC</td><td>在保持无菌的同时吸收手术伤口中的血液。</td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>在保持无菌的条件下清洁手术区域和手术器械。</td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>281324</td><td>用于血液净化及术后体液替代。</td></tr><tr><td>外科手套</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>供外科医生在手术过程中维持无菌区域使用。</td></tr><tr><td>手术加热垫</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于维持动物模型在手术期间的体温。</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>为了更清晰地观察手术切口。</td></tr><tr><td>外科吻合器</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750546</td><td>应用缝合钉。</td></tr><tr><td>水循环加温垫</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>L1K018</td><td>用于术后恢复区，以维持无意识动物的体温。</td></tr><tr><td>加权钩</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于撑开手术切口。</td></tr><tr><td>液体创可贴</td><td>NewSkin</td><td>985838</td><td>术后沿缝线涂抹以促进伤口愈合</td></tr><tr><td>金属丝笼灯</td><td>ZooMed</td><td>LF10EC</td><td>帮助动物从麻醉中恢复并自然维持体温</td></tr></tbody></table>

使用双病毒载体通过联合脑部与脊柱手术靶向新生大鼠皮质脊髓束

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

成功克服制约新生大鼠研究的障碍，对于探究儿童脊髓损伤（SCI）与成人脊髓损伤在预后上的差异至关重要。此外，将治疗手段可靠地导入中枢神经系统（CNS）的目标细胞也具有挑战性，任何不准确的操作都可能影响研究或治疗的效果。本方案结合病毒载体技术与一种新型外科手术方法&#160;，可在出生后第5天精准地将基因治疗导入新生大鼠体内。在此过程中，一种经改造可进行逆向运输的病毒（retroAAV2-Cre）被注射至脊髓内皮质脊髓神经元轴突末梢处，并随后被逆向运输至胞体。随后，将携带双floxed&#160;反向插入序列（DIO）的、仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）病毒注射至脑部躯体运动皮层。这种双重感染技术可促进DREADD仅在共感染的皮质脊髓束（CST）神经元中表达。&#160;因此，同时向躯体运动皮层和颈段CST末梢进行共注射，是研究新生大鼠颈段SCI模型后化学遗传学调控恢复过程的有效方法。

成功注射并运输病毒载体后，应实现脊髓和运动皮层单侧神经元的转导。图4展示了在脑冠状切片的运动皮层中表达Cre依赖性DREADDs-mCherry的V层皮质脊髓束神经元，该切片同时接受了对侧脊柱注射rCre。切片经dsRed抗体染色。
<img alt="神经环路示踪示意图；病毒载体 AAV2-hM3Dq-mCherry 和 retroAAV2-scCre；脑-脊髓。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62698/62698fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：本方案所使用的双病毒注射方法示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62698/62698fi...

本方案展示了一种新方法，通过向新生大鼠出生后5至10天的体躯运动皮层注射顺向化学遗传修饰剂，并向颈段脊髓注射可逆向运输的Cre重组酶，实现对特定细胞亚群的基因治疗。

成功克服制约新生大鼠研究的障碍，对于研究儿科患者中观察到的结局差异至关重要……

这是首个成功实现新生大鼠皮质脊髓束共感染的实验方案。该方案为研究年轻哺乳动物中不同细胞亚群如何参与脊髓损伤后的功能恢复提供了精确的技术蓝图。与其他双病毒载体技术类似，该方法可使研究者精确转导特定的神经元亚群，进而评估多种化学遗传学技术在促进功能恢复中的有效性。对于不熟悉该技术的研究人员，我们预计其在定位正确的脊柱解剖结构时会遇到困难。因此，我们建议您持续频繁地计数椎体节段，并始终参考您的解剖标志。在确认新生 Sprague Dawley 大鼠麻醉深度后，用镊子在头皮顶部中线处按压，触摸矢状缝，以确定切口位置。绷紧皮肤以确保切口干净、平直且精确，从 I 线正上方开始，沿矢状缝平面做一厘米长的切口。接着，用镊子轻轻探查颅骨表面，仔细观察缝线走行以及镊子沿顶骨和额骨移动时产生的凹陷，以此确定前囟位置。通过在目标侧放置有重量的牵开钩以保持切口开放。使用棉签头和显微剪刀结合的方法清除腱膜，以充分暴露前囟，提高操作的准确性。确保冠状缝向外侧充分暴露，为后续注射提供大致的定位参考。使用显微剪刀，在前囟附近左侧额骨上剪除一块约3毫米×2毫米的骨片。使用棉签清除任何碎屑、脑脊液和血液。注射病毒时，将针头放置到位，并设置注射仪以每分钟 250 纳升的速度注入 1 微升病毒液。注射完成后，让针头在皮层中留置 3 分钟。按照与前囟相关的皮层位置，在其他坐标点重复注射，共完成三处注射，每处深度均为 0.6 毫米。注射完成后，缝合头皮，并将动物转移至另一手术台进行颈椎椎板切除术。用手指触诊颅底以确定切口位置。用拇指和食指施加张力，将皮肤绷紧。使用11号刀片，从颅底后方1至2毫米的中线处开始切口，并向后延伸1厘米，以暴露浅层肌肉。利用刀片的锋利尖端，沿浅层肌肉的中线轻轻进行一系列切割，以暴露脊髓腔和深层脊髓肌肉。然后使用一对镊子撑开肌肉，暴露手术视野。当深层脊柱肌肉暴露后，将牵开器插入手术窗口，并将手术窗口向两侧牵拉至7到8毫米宽，以获得无遮挡的脊柱视野。通过其显著向背侧突出的棘突以及包裹的大型圆顶状肌肉，辨认第二颈椎。使用骨刮匙的平边，轻轻向两侧刮除深层脊柱肌肉，以暴露第3至第7颈椎椎骨。从内侧开始，沿与椎板平行的方向向外侧刮除，以确保充分暴露，清晰分辨椎板结构。如有出血，使用棉签进行止血。以 C2 作为计数椎体节段的参考，使用显微剪刀小心地剪开 C6 和 C7 软骨板的侧缘。使用精细镊子小心移除已解剖的椎板部分，以暴露脊髓，确保脊髓暴露窗足够大，能够容纳所需的注射位点。将动物固定在立体定位颅骨夹持器中，并在其躯干下方放置卷起的纱布，以抬高其后躯。开始注射前，用棉签和Sugi三角轻轻擦拭脊髓窗区域，清除任何血液或脑脊液，注意避免损伤脊髓。此外，在脊髓窗两侧区域放置一小块可吸收棉，围绕窗口周围形成屏障，以防止持续出血或脑脊液渗漏堵塞注射部位。进行脊髓直接注射时，可通过识别脊髓动脉，利用玻璃注射针的尖端定位脊髓中线位置。接下来，将针头置于C5椎板后方中线附近位置，并以此作为参考点。然后，使用显微操作器将针头向右侧横向移动0.3毫米，并缓慢降低针头，直至其刚好接触脊髓表面。从此深度进针。进针至脊髓深部0.6毫米处。以每分钟250纳升的速度注射1微升携带Cre重组酶基因的逆行腺相关病毒2型。随后等待两分钟，使病毒扩散至脊髓组织，再缓慢撤出针头。此处展示的是在表达 Cre 依赖性 DREADDs 的脑冠状切片运动皮层中，第五层皮质脊髓束神经元的标记情况，该切片同时注射了 mCherry 并在对侧脊柱注射了逆行 Cre。能够靶向特定神经元群体将有助于阐明驱动功能恢复的细微机制，并为治疗发育中神经系统中的脊髓损伤提供更高的精确性。该方法为我们探索使用兴奋性 DREADDs 作为治疗幼年大鼠脊髓损伤手段的可行性奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用脑和脊柱联合手术用双病毒载体靶向新生大鼠的皮质脊髓束

神经前体细胞移植是一种有前景的策略，可用于保护和/或替代脊髓损伤（SCI）及运动神经元病——肌萎缩侧索硬化症（ALS）中丧失或功能异常的颈段膈运动神经元。本文提供了在ALS和SCI啮齿类动物模型中，将细胞递送至颈段脊髓前角的实验方案。...

脊髓内细胞移植用于靶向治疗肌萎缩侧索硬化症和创伤性脊髓损伤中的颈段腹角

来源：Smit, R. D., et al．利用脑部与脊柱联合手术通过双病毒载体靶向新生大鼠皮质脊髓束．J. Vis. Exp.

向新生大鼠皮质脊髓神经元靶向递送病毒以研究脊髓损伤

来源：Keefe, K. M., 等．慢病毒载体直接注射揭示大鼠脊髓中的多条运动通路．J. Vis.

向大鼠脊髓注射病毒载体以进行逆行神经元示踪

本文描述了一种用于暴露新生大鼠腹侧颅骨的手术方法。利用该方法，可在麻醉的幼鼠脑干上进行开颅，以开展急性电生理记录和双光子显微成像实验。...

一种在新生啮齿类动物腹侧颅骨上制作颅骨开窗的方法

皮质脊髓束是主要的躯体感觉运动传导通路之一，可通过在啮齿类动物脑干中进行单侧损毁，以评估针对中枢神经系统的促进神经可塑性疗法。本方案描述了该手术操作（“锥体束切断术”）及术后评估方法。...

大鼠单侧皮质脊髓束锥体切断术用于评估促进神经可塑性疗法

采用自组装肽（SAP）和神经前体细胞（NPC）联合生长因子治疗颈段脊髓损伤，是一种促进神经再生与功能恢复的有前景的策略。本研究建立了颈段脊髓损伤的 contusion/compression 动脉瘤夹大鼠模型，并采用 SAP 注射联合 NPC...

神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用

我们描述了一种使用自制固定装置进行立体定位手术的方案，用于将试剂微量注射到新生小鼠脑的纹状体中。该技术可实现对新生小鼠脑特定区域神经元细胞的遗传操作。...

新生小鼠脑纹状体细胞基因操作的立体定位手术

本方案演示了将一种可逆向运输的病毒载体注射到大鼠脊髓组织中的操作。该载体在突触处被摄取，并逆向运输至靶神经元的胞体。此模型适用于重要脊髓通路的逆向示踪，或用于基因治疗应用中对特定细胞的靶向递送。...

直接注射慢病毒载体突出显示大鼠脊髓中的多条运动通路

本研究阐述了选择性脊柱操作对脑性瘫痪幼鼠生长发育的影响，重点介绍了具体操作步骤和标准化方案。通过体质量测量、转棒实验、足错步评分、其他行为学测试以及生长激素检测来评估该方案的效果。...

利用选择性脊柱操作促进脑性瘫痪幼鼠的发育与生长

本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。...

通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

学习利用双病毒载体技术靶向新生大鼠皮质脊髓束进行基因治疗的方法。该方案通过精准手术操作实现特定神经元亚群的转导，为研究脊髓损伤后的神经修复机制提供重要工具。

使用双病毒载体通过联合脑部与脊柱手术靶向新生大鼠皮质脊髓束

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