用于筛选应用的成纤维细胞来源人源化工程化结缔组织

该方案允许成纤维细胞在定义的力学条件下构建并组织其自身的微环境，从而形成具有各向异性、刚度及基质成分均类似于细胞天然环境的组织。该方法可平行比较多达48种不同条件。

该方法对所使用的细胞类型和培养条件具有良好的适应性。由于仅需使用少数明确的组分，因此可在不同实验室之间重复。通过添加促纤维化因子或抗纤维化药物，本方案可用于研究各类纤维化疾病的潜在机制及治疗方法。

演示该实验步骤的是我们实验室的博士生 Alisa Degrave 和我本人。首先，将冻存的心脏成纤维细胞置于37摄氏度水浴中解冻约两分钟，直至冻存管中仅剩少量冰晶。接着，使用2毫升血清移液管将细胞悬液逐滴转移至含有10毫升成纤维细胞生长培养基的无菌离心管中。

为获得最佳的细胞回收效果，用一毫升 FGM 冲洗冻存管，并将其转移至离心管中。轻柔重悬细胞后，转移至细胞培养瓶中。每隔一天更换一次 FGM，持续五天，或直至细胞达到 80% 汇合度。

吸出培养细胞的培养基后，用6 mL PBS洗涤细胞并吸出；然后向细胞中加入6 mL细胞解离试剂，孵育至显微镜下可见细胞脱落。向含有已解离细胞的细胞解离试剂中加入6至12 mL FGM，以中和酶活性。使用10 mL血清移液管轻柔吹打4至8次，确保形成单细胞悬液，并将细胞转移至新的50 mL收集管中。

根据制造商说明，使用自动细胞计数仪检测细胞得率，并将细胞离心成团。离心后，吸除上清液，轻弹离心管以松动细胞沉淀，再用 FGM 重悬细胞。接着，将细胞悬液通过 40 微米孔径的细胞滤网过滤，然后使用自动细胞计数仪通过电流排斥法评估细胞数量和活力，以确保在进行工程化结缔组织（ECT）制备前获得可靠的细胞数量。

为准备 ECT，将细胞悬液用 FGM 调整至每毫升含 890 万个细胞，温度控制在 20 至 25 摄氏度，并将细胞置于冰上。将含有 ECT 水凝胶混合物各组分的其他所有试管转移至冰上，并预先将一个空的 50 毫升离心管冷却，以备配制混合物。开始配制 ECT 水凝胶混合物时，将文中所述组分依次加入已预冷的 50 毫升离心管中，注意避免产生气泡。

首先，使用带宽口吸头的移液管将酸溶性I型胶原蛋白水凝胶移入血清学移液管中。通过加入DMEM并轻轻旋转管子以充分混匀，调节胶原蛋白溶液的盐含量。为中和pH值，在旋转管子的同时加入0.2摩尔氢氧化钠，并通过观察酚红指示剂变为红色来确认中和完成。

然后在轻轻旋动离心管的同时，将细胞悬液逐滴加入。使用带有宽口吸头的血清移液管轻柔地吹打一次，以混匀悬液，避免产生气泡并尽量减少剪切力。再轻轻旋动离心管10次，确保充分混匀。

在整个成型过程中，将装有 ECT 水凝胶混合物的离心管置于冰上。用一毫升移液器吸头蘸取少量 ECT 水凝胶混合物，然后将 180 微升水凝胶混合物均匀分配至 48 孔成型板的每个模具中，避免施加过大的剪切力，以免影响胶原基质组装的完整性，并确保整个板在 15 至 20 分钟内完成操作。确保模具内形成完整的环状结构，因为 ECT 混合物分布不连续将阻碍完整 ECT 环的形成。

避免将液体吸入内孔或在移液过程中产生气泡，以确保形成均匀的ECT水凝胶，从而实现均一且具有功能的组织构建。将48孔成胶板小心放入细胞培养孵箱中，使ECT水凝胶混合物重组15至30分钟。孵育后，混合物呈现凝胶状且不透明。

沿孔壁轻轻加入 600 µL 37°C 温育的 FGM，避免 ECT 从底部脱落。每天更换 500 µL FGM，直至进行分析。在预定的时间点，使用体视显微镜记录 ECT 顶部和侧面的显微图像。

使用图像处理程序进行线扫描分析。设定标尺，利用直线工具在每个成像平面的每条臂上至少六个位置处追踪并测量ECT的直径。将48孔浇铸板置于配备高分辨率黑白图像传感器和近紫外光源的面阵扫描相机记录装置下，在固定距离处进行成像。

通过荧光染料对极尖进行自动检测，以最大化对比度。使用自动化分析方法，将每日记录的图像导入软件，检测暗背景下高对比度的亮像素，或使用图像处理程序，测量两极之间的距离。从固定极上取下ECT，并插入转移钩和ECT环。

然后将 ECT 转移至两个钩子上，钩子分别夹在配备有 37 摄氏度恒温 PBS 器官浴的拉伸动态力学介电仪的固定臂和换能器臂上。通过将介电仪设定为每秒约等于钩子间初始距离 1% 的恒定线性速率，施加单轴拉伸。对于典型的 ECT 尺寸，可采用 0.03 毫米每秒的恒定拉伸速率。

撕裂换能器的受力并开始拉伸。在通过横截面积对测得的力进行归一化后，持续记录直至ECT断裂，并绘制应力-应变曲线以确定不同的生物力学参数。在组织开始发生微裂之前，弹性区域的上限对应于屈服点，其应变值可作为衡量组织弹性的指标。

塑性区域位于屈服点与断裂点之间。断裂点对应于组织破裂时应力的突然下降，由此定义了极限应变，该应变是衡量组织延展性的指标。第三个测量点对应于最大强度，即组织在拉伸过程中不断裂所能承受的最高应力。

曲线下的面积所对应的韧性和强度分别表示组织在屈服点和断裂点之前吸收的能量。对于每条获得的曲线，弹性区域线性部分的斜率对应于杨氏模量，也称为弹性模量。它是衡量组织刚度的一种力学特性。

根据本方案，在对照条件及胎牛血清（FCS）存在下，ECT 的致密化和收缩在成模数小时后开始，并在第 5 天显著增强。当 ECT 经肌动蛋白聚合抑制剂 Latrunculin A 处理后，其致密化程度降低，表现为横截面积显著大于对照组。在培养的五天内对组织的收缩情况进行了评估。

在没有海棉肌抑素A的情况下，收缩程度逐渐增加，到第5天时达到约40%的收缩。然而，在存在海棉肌抑素A的情况下，组织收缩受到抑制，最大收缩程度仅为约20%。抑制肌动蛋白聚合导致组织刚度较对照组显著降低约50%。

这些结果表明，肌动蛋白细胞骨架的完整性对于工程化结缔组织的致密化、收缩和刚性化至关重要。选择可靠且高质量的胶原蛋白溶液，并确保使用高活力的单细胞悬液来重建工程化结缔组织，具有重要意义。