Name: 成纤维细胞衍生的人类工程结缔组织用于筛查应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解成纤维细胞在特定机械条件下构建各向异性工程结缔组织的方法。该方案支持多达48种条件的平行比较，适用于纤维化疾病机制研究与药物筛选，具有良好的可重复性和灵活性。

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本工作由德国心脏病学会（DGK 研究奖学金，授予 GLS）和德国研究基金会（DFG，通过项目 IRTG 1816 支持 GLS 和 AD；项目编号 DFG 417880571 和 DFG TI 956/1-1 支持 MT；SFB 1002 TP C04 支持 MT 和 WHZ；SFB 1002 TP S01 支持 WHZ；EXC 2067/1-390729940J 支持 WHZ）资助。WHZ 还获得德国联邦教研部（BMBF，通过项目 IndiHEART）和 Leducq 基金会（20CVD04）的支持。MT、WHZ 和 SL 获得德国心血管研究中心（DZHK）的支持。

GLS 和 SL 起草了手稿。所有作者均参与了实验方案的制定并对手稿进行了修改。TM、MT 和 WHZ 是 myriamed GmbH 的科学顾问。WHZ 是 myriamed GmbH 的创始人及股东。

本方案描述了从原代人冠状纤维细胞（CF）生成ECT的方法，可用于研究这些细胞对其细胞外基质环境的力学影响，反之亦然。
成纤维细胞需要扩增以获得足够的细胞数量用于计划的ECT实验（0.75 × 106 细胞/ECT)。为了获得最佳的可重复性，建议在每次传代时，将冻存或组织来源的成纤维细胞在二维单层培养中预培养至标准化时长，达到约80%融合度后再用于ECT的制备（实验方案步骤3）。用于培养原代人CF单层细胞时&#160;特别建议对衍生的 ECT 使用适用于 CF 的商用培养基和补充剂（参见 材料表）。在标准的二维培养中，培养基中添加血清对于确保成纤维细胞（CF）的扩增至关重要。在三维培养（包括工程化角膜组织（ECT）的构建及后续培养）中，是否采用无血清或低血清条件，可根据所选成纤维细胞类型而定。然而，在利用成纤维细胞进行ECT构建时，建议至少在浇铸水凝胶中添加血清，以确保组织初始收缩的正常进行。
该操作步骤的一个局限性在于，为生成工程化心肌组织（ECT）而需在二维培养条件下扩...

研究纤维化疾病的主要障碍之一是缺乏能够反映成纤维细胞及其病理衍生物行为的代表性人类三维组织模型。由于分离的成纤维细胞在非顺应性二维基质上培养时会迅速转分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的肌成纤维细胞，因此标准的二维培养系统在研究纤维化过程方面并不理想1,2,3。因此，标准二维培养中的成纤维细胞并不能代表正常的“健康”组织表型3,4,5,6。尽管已有研究采用可变形基质来模拟非纤维化（10 kPa）和纤维化（35 kPa）的组织环境7，但这些模型缺乏第三维度，而这一维度在病理生理学中极为重要。组织工程技术为克服这一局限提供了可能，它允许在明确且可实验调控的细胞外基质（ECM）环境中培养成纤维细胞，例如通过调节细胞密度、ECM成分和ECM浓度，这些因素均可决定组织的生物力学特性。
已利用成纤维细胞构建了多种三维模型。其中，悬浮圆盘和微球是最早开发的模型，可证明胶原会以时间依赖的方式被重塑并发生收缩。成纤维细胞会对胶原纤维施加牵引力，这一过程可通过添加促纤维化因子（如转化生长因子-β1（TGF-β1））加以促进8,9,10,11,12,13,14,15,16。然而，自由悬浮培养体系无法实现可控的外部加载，因此这类模型会持续收缩或致密化。片状工程化组织的出现使得研究组织生物力学特性的稳态调控成为可能，尤其是通过单轴、双轴、多轴或循环应变测试进行分析17,18,19,20。这些模型已被用于研究细胞数量对组织刚度的影响，结果表明组织刚度与细胞骨架完整性及肌动球蛋白细胞骨架的收缩性呈正相关18,19。但需注意的是，由于力传感器夹持点和锚定点周围组织变形不均匀，力-应变转换较为复杂。这一固有局限可通过狗骨形或环形组织模型加以克服，后者在锚定点处提供一定的组织增强作用21,22,23。环形组织可通过将细胞-胶原水凝胶分配至环形模具中制备而成。随着水凝胶的收缩，组织在模具不可压缩的内杆周围形成，从而对抗进一步的组织收缩24,25,26,27。在完成初始且通常为最大程度的收缩后，组织还可转移至可调节的间隔装置中，以在设定的组织长度下进一步限制环形工程化组织（ECT）的收缩3,24,25,26,27,28,29,30。生物物理特性可在标准的水平或垂直应变-应力装置中，使用适当的载荷传感器在单向或动态应变条件下进行评估3。由于此类组织具有高度均匀的环形结构，并可通过杆状或钩状结构（锚定点和/或力传感器）固定，尽管在加载杆周围仍可能存在压缩区域，但该构型相比夹持方式可实现更均匀的应变分布3。此外，锚定的组织可诱导细胞呈现双极形态，细胞会沿受力方向伸长，适应组织内的力学环境，从而促进各向异性的牵引力生成31,32,33,34,35,36。我们此前曾应用大鼠和人源心肌成纤维细胞（CF）围绕单一刚性柱体构建环形ECT，并在功能性的应力-应变实验中开展过表达和功能缺失研究，使用病毒转导的成纤维细胞24,25,26以及药理学干预手段37。此外，我们还在ECT模型中识别出CF介导的纤维化存在性别差异27。
以下方案以商品化供应商提供的冷冻保存的原代人食管上皮细胞（参见材料表）为例，用于生成人食管类上皮组织（ECT）。该方法结合了环形组织的优势，以及一种简便快速生成宏观组织的方法，适用于设计用于平行高通量检测的48孔板平台。
重要的是，ECT 模型并不局限于特定类型的成纤维细胞，已有文献报道其应用于其他成纤维细胞的研究，例如皮肤成纤维细胞38,39。此外，来自患者活检组织的成纤维细胞同样适用，具体选择何种成纤维细胞最终取决于拟解决的科学问题。
本方案中用于生成工程化心肌组织（ECT）的平台是一种 commercially available 的48孔三维细胞/组织培养板（图1A）。本文描述了利用该48孔板在定义的几何形状和机械负荷条件下，制备、培养以及监测ECT形成与功能的方法。所形成的ECT由集成的柔性支柱固定，通过使用不同硬度（邵氏A硬度值36–89）的支柱可依据最终用途精细调节机械负荷，从而影响其弯曲刚度。推荐使用邵氏A硬度值为46的支柱。此外，本方案还可与先前报道的一种定制圆形模具兼容，该模具通过单根刚性杆固定ECT37。该模具的尺寸见图1B。
<img alt="微装置设计的横截面分析，含尺寸细节和组装示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图1"> 
图1：铸造模具的示意图。（A）带有两个柔性杆的铸造模具的技术图纸及尺寸。该模具由一段短壁限定的内周构成，短壁固定于模具主体上，并设有双层限位杆。柔性杆之间具有一定的自由水平间距，并在底部相连。该模具可容纳180 µL的浇铸体积。每个模具的培养孔至少可容纳600 µL的培养基。可使用不同材料组合来制造具有特定刚度的杆（例如TM5MED-TM9MED）。（B）带有单根刚性杆的环形模具的技术图纸及尺寸。这是一种具有不同几何结构和力学环境的替代模具，可用于ECT浇铸方案37。环形模具的组装方法借鉴自已发表的较大尺寸格式28,41。简而言之，该方法包括：（1）将聚四氟乙烯（PTFE）模具垫片（直径8 mm）压印到倒入玻璃培养皿（直径60 mm）中的聚二甲基硅氧烷（PDMS，硅胶）中；（2）在形成的中空腔内同心固定一个PDMS杆支架（直径1.5 mm），用于（3）固定可拆卸杆（直径4 mm的硅胶管）。由此形成的中空空间可容纳180 µL的浇铸体积。每个玻璃培养皿可容纳多个压印模具（图中示例为5个模具），最多可容纳5 mL培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>细胞培养试剂：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase 溶液</td><td>Merk Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>解离试剂 &amp;ndash; TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）粉末</td><td>Gibco</td><td>12100061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS），pH 7.2，无 Ca²⁺，无 Mg²⁺</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 成纤维细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>FBM&amp;nbsp;成纤维细胞生长基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 成纤维细胞生长培养基-2 SingleQuots，&amp;nbsp;补充剂与生长因子</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长培养基 3 套件</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞基础培养基 3</td><td>PromoCell</td><td>C-23230</td><td></td></tr><tr><td>生长培养基 3 补充剂套装</td><td>PromoCell</td><td>C-39350</td><td></td></tr><tr><td>青霉素（10000 U/mL）/ 链霉素（10000 &amp;mu;L/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液（NaOH）1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770-100ML</td><td></td></tr><tr><td>细胞来源：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自心室的正常人源心脏成纤维细胞（NHCF-V）</td><td>Lonza</td><td>CC-2904</td><td></td></tr><tr><td>人源心脏成纤维细胞（HCF-c）</td><td>PromoCell</td><td>C-12375</td><td></td></tr><tr><td>人源心脏成纤维细胞（HCF-p）</td><td>PromoCell</td><td>C-12377</td><td></td></tr><tr><td>原代人源包皮成纤维细胞-1（HFF-1）</td><td>ATCC</td><td>SCRC- 1041</td><td></td></tr><tr><td>胶原来源：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原（牛源），溶于 0.01 M HCl</td><td>LLC Collagen Solutions</td><td>FS22024</td><td>6-7 mg/mL</td></tr><tr><td>I 型胶原（大鼠尾源），溶于 0.02 M HCl</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>~4 mg/mL</td></tr><tr><td>药物：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin-A（Lat-A）</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td></td></tr><tr><td>塑料器皿：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用塑料器皿</td><td>Sarstedt 和 Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼龙网细胞滤筛（孔径 40 &amp;mu;m）</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>myrPlate-uniform</td><td>myriamed GmbH</td><td>TM5 med</td><td></td></tr><tr><td>宽口无菌移液管（10 mL）</td><td>Corning</td><td>07-200-619</td><td></td></tr><tr><td>专用仪器：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于 1/2&amp;Prime; 探测器的双远心 CORE 镜头</td><td>OptoEngineering</td><td>TCCR12096</td><td></td></tr><tr><td>面阵扫描相机 Basler ace acA4024</td><td>Basler</td><td>107404</td><td></td></tr></tbody></table>

用于筛选应用的成纤维细胞来源人源化工程化结缔组织

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

成纤维细胞是表型高度动态的细胞，可在生化和生物力学刺激下迅速转分化为肌成纤维细胞。目前对包括心脏纤维化在内的纤维化过程的理解仍然有限，这阻碍了新型抗纤维化疗法的开发。可控且可靠的人源模型系统对于深入理解纤维化病理至关重要。本研究提供了一种高度可重复且可扩展的实验方案，可在48孔铸造板中构建工程化结缔组织（ECT），以促进在三维（3D）环境中对成纤维细胞及其纤维化组织病理生理学的研究。ECT在具有可调刚度的支柱周围形成，从而可在定义的生物力学负荷条件下进行研究。在特定的加载条件下，可研究由细胞-基质相互作用调控的表型适应性变化。采用48孔板格式可实现平行测试，并可对多个参数进行时间过程分析，例如组织压缩和对抗负荷的收缩能力。基于这些参数，可进一步研究组织刚度和弹性等生物力学特性。

在最初的24小时内，ECT的致密化程度可达初始细胞-胶原蛋白水凝胶体积的约95%。在对照条件以及含FCS条件下，组织的致密化和收缩通常在成模后数小时开始，并显著持续增加至第5天（图5A）。支柱偏转程度在随后的15天内可能进一步增加（最长测试时间为20天）。支柱偏转的幅度取决于细胞类型、细胞状态以及细胞和组织培养条件。通常在培养第5天测量生物力学特性，但也可选择其他时间点。作为ECT模型适用性的一个示例，本文展示了该方案如何有助于研究肌动蛋白细胞骨架完整性对组织功能的影响。ECT在48孔成模板中制备，并用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A（Lat-A，7 ng/mL）处理。处理后ECT的致密化程度降低，表现为与对照组相比，横截面积（CSA）显著增加1.7倍（图8A，B）。此外，在5天培养期间评估了组织的收缩情况。在无药物处理时，组织收缩逐渐增加至第5天，达到约40%的收缩率。而Lat-A处理影响了组织收缩，最大收缩率仅为约20%（图8A...

本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。

成纤维细胞是表型高度动态的细胞，可迅速对生化和生物力学信号产生响应，转分化为肌成纤维细胞……

该方案允许成纤维细胞在定义的力学条件下构建并组织其自身的微环境，从而形成具有各向异性、刚度及基质成分均类似于细胞天然环境的组织。该方法可平行比较多达48种不同条件。该方法对所使用的细胞类型和培养条件具有良好的适应性。由于仅需使用少数明确的组分，因此可在不同实验室之间重复。通过添加促纤维化因子或抗纤维化药物，本方案可用于研究各类纤维化疾病的潜在机制及治疗方法。演示该实验步骤的是我们实验室的博士生 Alisa Degrave 和我本人。首先，将冻存的心脏成纤维细胞置于37摄氏度水浴中解冻约两分钟，直至冻存管中仅剩少量冰晶。接着，使用2毫升血清移液管将细胞悬液逐滴转移至含有10毫升成纤维细胞生长培养基的无菌离心管中。为获得最佳的细胞回收效果，用一毫升 FGM 冲洗冻存管，并将其转移至离心管中。轻柔重悬细胞后，转移至细胞培养瓶中。每隔一天更换一次 FGM，持续五天，或直至细胞达到 80% 汇合度。吸出培养细胞的培养基后，用6 mL PBS洗涤细胞并吸出；然后向细胞中加入6 mL细胞解离试剂，孵育至显微镜下可见细胞脱落。向含有已解离细胞的细胞解离试剂中加入6至12 mL FGM，以中和酶活性。使用10 mL血清移液管轻柔吹打4至8次，确保形成单细胞悬液，并将细胞转移至新的50 mL收集管中。根据制造商说明，使用自动细胞计数仪检测细胞得率，并将细胞离心成团。离心后，吸除上清液，轻弹离心管以松动细胞沉淀，再用 FGM 重悬细胞。接着，将细胞悬液通过 40 微米孔径的细胞滤网过滤，然后使用自动细胞计数仪通过电流排斥法评估细胞数量和活力，以确保在进行工程化结缔组织（ECT）制备前获得可靠的细胞数量。为准备 ECT，将细胞悬液用 FGM 调整至每毫升含 890 万个细胞，温度控制在 20 至 25 摄氏度，并将细胞置于冰上。将含有 ECT 水凝胶混合物各组分的其他所有试管转移至冰上，并预先将一个空的 50 毫升离心管冷却，以备配制混合物。开始配制 ECT 水凝胶混合物时，将文中所述组分依次加入已预冷的 50 毫升离心管中，注意避免产生气泡。首先，使用带宽口吸头的移液管将酸溶性I型胶原蛋白水凝胶移入血清学移液管中。通过加入DMEM并轻轻旋转管子以充分混匀，调节胶原蛋白溶液的盐含量。为中和pH值，在旋转管子的同时加入0.2摩尔氢氧化钠，并通过观察酚红指示剂变为红色来确认中和完成。然后在轻轻旋动离心管的同时，将细胞悬液逐滴加入。使用带有宽口吸头的血清移液管轻柔地吹打一次，以混匀悬液，避免产生气泡并尽量减少剪切力。再轻轻旋动离心管10次，确保充分混匀。在整个成型过程中，将装有 ECT 水凝胶混合物的离心管置于冰上。用一毫升移液器吸头蘸取少量 ECT 水凝胶混合物，然后将 180 微升水凝胶混合物均匀分配至 48 孔成型板的每个模具中，避免施加过大的剪切力，以免影响胶原基质组装的完整性，并确保整个板在 15 至 20 分钟内完成操作。确保模具内形成完整的环状结构，因为 ECT 混合物分布不连续将阻碍完整 ECT 环的形成。避免将液体吸入内孔或在移液过程中产生气泡，以确保形成均匀的ECT水凝胶，从而实现均一且具有功能的组织构建。将48孔成胶板小心放入细胞培养孵箱中，使ECT水凝胶混合物重组15至30分钟。孵育后，混合物呈现凝胶状且不透明。 沿孔壁轻轻加入 600 µL 37°C 温育的 FGM，避免 ECT 从底部脱落。每天更换 500 µL FGM，直至进行分析。在预定的时间点，使用体视显微镜记录 ECT 顶部和侧面的显微图像。使用图像处理程序进行线扫描分析。设定标尺，利用直线工具在每个成像平面的每条臂上至少六个位置处追踪并测量ECT的直径。将48孔浇铸板置于配备高分辨率黑白图像传感器和近紫外光源的面阵扫描相机记录装置下，在固定距离处进行成像。通过荧光染料对极尖进行自动检测，以最大化对比度。使用自动化分析方法，将每日记录的图像导入软件，检测暗背景下高对比度的亮像素，或使用图像处理程序，测量两极之间的距离。从固定极上取下ECT，并插入转移钩和ECT环。然后将 ECT 转移至两个钩子上，钩子分别夹在配备有 37 摄氏度恒温 PBS 器官浴的拉伸动态力学介电仪的固定臂和换能器臂上。通过将介电仪设定为每秒约等于钩子间初始距离 1% 的恒定线性速率，施加单轴拉伸。对于典型的 ECT 尺寸，可采用 0.03 毫米每秒的恒定拉伸速率。撕裂换能器的受力并开始拉伸。在通过横截面积对测得的力进行归一化后，持续记录直至ECT断裂，并绘制应力-应变曲线以确定不同的生物力学参数。在组织开始发生微裂之前，弹性区域的上限对应于屈服点，其应变值可作为衡量组织弹性的指标。塑性区域位于屈服点与断裂点之间。断裂点对应于组织破裂时应力的突然下降，由此定义了极限应变，该应变是衡量组织延展性的指标。第三个测量点对应于最大强度，即组织在拉伸过程中不断裂所能承受的最高应力。曲线下的面积所对应的韧性和强度分别表示组织在屈服点和断裂点之前吸收的能量。对于每条获得的曲线，弹性区域线性部分的斜率对应于杨氏模量，也称为弹性模量。它是衡量组织刚度的一种力学特性。根据本方案，在对照条件及胎牛血清（FCS）存在下，ECT 的致密化和收缩在成模数小时后开始，并在第 5 天显著增强。当 ECT 经肌动蛋白聚合抑制剂 Latrunculin A 处理后，其致密化程度降低，表现为横截面积显著大于对照组。在培养的五天内对组织的收缩情况进行了评估。在没有海棉肌抑素A的情况下，收缩程度逐渐增加，到第5天时达到约40%的收缩。然而，在存在海棉肌抑素A的情况下，组织收缩受到抑制，最大收缩程度仅为约20%。抑制肌动蛋白聚合导致组织刚度较对照组显著降低约50%。这些结果表明，肌动蛋白细胞骨架的完整性对于工程化结缔组织的致密化、收缩和刚性化至关重要。选择可靠且高质量的胶原蛋白溶液，并确保使用高活力的单细胞悬液来重建工程化结缔组织，具有重要意义。

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