人源化介质释放检测作为过敏原效力的读出方法

该检测是一种重要的研究工具，可用于模拟由患者IgE与过敏原交联所诱导的嗜碱性粒细胞脱颗粒过程。因此，该检测可用于模拟Ⅰ型过敏反应。该检测具有稳健性、可重复性，并可根据需要进行调整。

此外，该方法具有高灵敏度，即使使用少量重组或纯化的过敏原，甚至复杂的过敏原提取物也可进行检测。该方法通过分析患者IgE对过敏原的反应性，用于过敏症的诊断。同时，该方法也适用于分析交叉反应性以及监测变应原特异性免疫治疗（AIT）的疗效。

从细胞培养瓶中收集 Ag8 细胞，并将细胞转移至离心管中。在室温下以 250 × g 离心五分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，用人源化 RBL 细胞培养基重悬细胞沉淀，调整细胞终浓度约为每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。

将人血清在Ag8细胞悬液中按1:10稀释，使检测中的最终血清稀释度为1:20，在37摄氏度及5%至7%二氧化碳条件下孵育一小时。当人源化RBL细胞达到50%至90%汇合度时，小心地从T-75细胞培养瓶中吸出培养基，注意不要触碰已贴壁的人源化RBL细胞。通过向培养瓶的对侧加入10毫升DPBS进行两次洗涤，避免直接加到细胞上。

吸去DPBS，加入5毫升预热的1×胰蛋白酶-EDTA溶液以使细胞脱离，于37°C孵育5分钟。轻轻拍打培养瓶使细胞脱落。将细胞悬液转移至15毫米离心管中，并用含人源化RBL细胞培养基或DPBS补满离心管，以稀释胰蛋白酶-EDTA。

在室温下以250 × g离心细胞5分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于5 mL人源化RBL细胞培养基中用于细胞计数。计数后，用人源化RBL细胞培养基稀释细胞，使其最终浓度为每毫升2 × 10⁶个细胞。

每孔加入 50 µL 人源化 RBL 细胞悬液，相当于每孔 1 × 10⁵ 个细胞，置于无菌 96 孔板中。离心预孵育的 Ag8 血清悬液，并将 50 µL 离心后的 Ag8 血清悬液转移至各含有人源化 RBL 细胞的孔中，注意不要扰动 Ag8 细胞沉淀。使用未加抗原的致敏未刺激细胞作为空白抗原对照，以指示最低信号平台或背景值，且背景对照孔和最大裂解对照孔无需进行致敏处理。

将培养板盖上盖子，在37摄氏度及5%至7%二氧化碳条件下过夜孵育。吸去含有细胞培养基的血清，将培养板倒置并在吸水纸上轻拍以排空培养板，用于洗涤人源化RBL细胞。每次加入200微升Tyrode缓冲液，每孔洗涤三次，前两次洗涤每次孵育约30秒。

第三次加入 Tyrode 缓冲液后，吸去缓冲液，并将溶液保留在孔中，直至准备加入抗原稀释液。向每孔含有预致敏人源化 RBL 细胞的孔中转移 100 微升抗原溶液，但不要用抗原刺激最大裂解孔和非致敏背景孔中的细胞。在最大裂解对照孔、非致敏背景对照孔以及致敏无抗原孔中各加入 100 微升 Tyrode 缓冲液。

将细胞在37摄氏度及5%至7%二氧化碳条件下孵育1小时。向最大裂解对照孔中每孔加入10微升10%曲拉通X-100，充分混匀，以实现细胞完全裂解，使β-己糖胺酶100%释放。向一个新的非吸附型96孔板中每孔加入50微升底物溶液。

从含有人源化RBL细胞的培养板孔中转移50微升上清液至含有底物溶液的新板中，在37摄氏度孵育1小时，以使荧光底物发生转化。每孔加入100微升终止液，并按照文本稿件中的描述测定荧光信号。在β-己糖胺酶活性检测中获得的钟形曲线表明，由于过敏原过量，免疫球蛋白E的抗原表位呈单价结合，从而在高抗原浓度下抑制了过敏原与免疫球蛋白E的交联。

使用线性回归分析计算引起半数最大介质释放所需的抗原浓度。通过细胞活力检测排除致敏血清或刺激所用抗原可能产生的细胞毒性作用。在β-己糖胺酶活性检测中使用了五种不同的人血清，其中来自桦树花粉过敏患者的五份血清中有四份对Bet v 1刺激产生反应，表明Bet v 1是一种可引发免疫球蛋白E介导过敏症状的有效过敏原。

评估了免疫球蛋白E对同源过敏原的交叉反应性。两名患者均对Bet v 1产生反应，但患者二还对Cor a 1产生反应。该结果表明患者二体内针对与Bet v 1同源的食物过敏原Cor a 1的交叉反应性免疫球蛋白E水平较高。

通过与野生型对应物进行比较，评估了过敏原突变变体的低致敏性。与野生型过敏原相比，Bet v 1 折叠变体的释放曲线向更高抗原浓度方向偏移，导致引发半最大释放所需的抗原浓度显著升高，这表明该突变体致敏性更低，因此可作为过敏原特异性免疫治疗的候选分子。在加入抗原稀释液之前，切勿将细胞脱离洗涤液，以避免细胞干燥，否则将导致检测性能下降。

该检测可用于多种不同应用，包括基于生物活性对变应原产品进行标准化，例如用于皮肤点刺试验的溶液或用于变应原特异性免疫治疗的提取物。