Name: 人性化调解员发布分析作为过敏原效力的读出 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学习使用大鼠嗜碱性白血病细胞系进行介质释放分析，模拟I型过敏反应中嗜碱性粒细胞脱颗粒过程。该方法灵敏度高、重复性好，可用于评估过敏原反应性和交叉反应性，为免疫治疗研究提供可靠工具。

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作者谨此感谢德国兰根保罗·埃尔利希研究所分子过敏学系的Stefan Vieths教授博士，感谢他提供人源化/FcεRI转染的RBL细胞，并同意撰写本研究方法论文。我们感谢Fatima Ferreira教授博士提供的宝贵反馈意见。我们还感谢荷兰阿姆斯特丹阿姆斯特丹大学医学中心（AMC院区）实验免疫学系的Ronald van Ree教授博士和Jaap Akkerdaas博士博士，感谢他们同意发表本方法论文中提供的代表性数据，这些数据是在BM4SIT——过敏创新项目（www.BM4SIT.eu）研究过程中产生的。作者的工作得到了奥地利科学基金（项目P32189）、萨尔茨堡大学重点研究项目“过敏-癌症-生物纳米研究中心”、奥地利科学基金资助的博士项目“癌症与过敏中的免疫学-ICA”（FWF W01213）以及欧盟第七框架计划FP7的BM4SIT项目（资助编号601763）的支持。

使用桦树花粉过敏患者血清的伦理批准已由荷兰伦理委员会批准（批准编号：NL65758.018.18）。
1. 安全规程
<ol>
	<li>实验第一天需在生物安全二级工作台（生物安全等级2）中进行无菌操作。遵循所在机构关于人血清使用的安全指南。</li>
</ol>
2. 人血清中补体的灭活
<ol>
	<li>从细胞培养瓶中收获高密度的 P3X63Ag8.653 细胞（以下简称 Ag8 细胞），并将其转移至离心管中。
	<ol>
		<li>使用以下培养基培养这些细胞：改良 Eagle 培养基（血清浓度降低），含 1% 青霉素-链霉素（100 单位青霉素，0.1 mg/mL 链霉素），5% 热灭活胎牛/牛血清（FCSi）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以 250 × g 离心 Ag8 细胞 5 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 huRBL 培养基中，终浓度约为 1 × 106 个细胞/mL（MEM 培养基 Eagle 改良型，含 Alpha 修改成分，4 mM L-谷氨酰胺，5% FCSi，1% G418（100% 储存液：10 g/125 mL dH2O））。 
	注：Ag8 细胞应定期传代培养，以备后续使用。</li>
	<li>用 Ag8 细胞悬液将人血清按 1:10 比例稀释。检测中的最终血清稀释比例为 1:20。 
	注：对于特异性 IgE 含量较低的血清，可使用 1:5 稀释（最终稀释比例为 1:10）。</li>
	<li>在 37 °C、5%–7% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
</ol>
3. 人源RBL细胞的收获与接种
<ol>
	<li>小心地从 T-75 细胞培养瓶中吸出培养基，避免接触人肾小球足细胞（huRBL 细胞为贴壁细胞）。确保细胞融合度在 50%–90% 左右。 
	注意：根据细胞融合情况，一个高密度 T-75 培养瓶的细胞通常足够接种一至两个 96 孔板。</li>
	<li>用 10 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗细胞两次。添加 DPBS 时应加在培养瓶的对侧，不要直接加在细胞上。</li>
	<li>吸除 DPBS，加入 5 mL 预热的 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶/0.02% EDTA，溶于 DPBS 中），用于解离细胞。</li>
	<li>将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶使细胞脱落。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，并用 huRBL 培养基或 DPBS 补充体积，以稀释胰蛋白酶-EDTA。</li>
	<li>在室温下以 250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀用 5 mL huRBL 培养基重悬，用于细胞计数。</li>
	<li>进行细胞计数，并用 huRBL 培养基稀释至终浓度为 2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>取无菌 96 孔板，每孔加入 50 µL huRBL 细胞悬液，相当于每孔接种 1 × 105 个细胞。</li>
</ol>
4. 人源化RBL细胞的被动致敏
<ol>
	<li>将预孵育的 Ag8/血清悬浮液在 250 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>取 50 µL 离心后的 Ag8/血清悬浮液，加入含 huRBL 细胞的各孔中，注意不要扰动 Ag8 细胞沉淀。
	<ol>
		<li>设置无抗原对照孔，即致敏但未刺激的细胞（不添加抗原），用于指示底部信号平台/背景值。背景对照孔和最大裂解对照孔无需用血清致敏。在这些对照孔中加入 50 µL huRBL 培养基代替。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖上培养板盖，于 37 °C、5%–7% CO2 条件下过夜孵育。</li>
</ol>
5. 抗原刺激的脱颗粒与介质释放
<ol>
	<li>提前在1x Tyrode缓冲液（9.5 g/L Tyrode盐，0.1%牛血清白蛋白（BSA），0.5 g/L碳酸氢钠（NaHCO3）溶于dH2O中）中配制抗原稀释液。每孔需加入最终体积100 µL。 
	注意：并非所有来源于天然或重组表达的变应原在1x Tyrode缓冲液中均稳定。因此，在进行检测前应在1x Tyrode缓冲液中进行稳定性测试。或者，可将1x Tyrode缓冲液用重水（D2O）稀释，以提高检测的信噪比。</li>
	<li>在反应管中对目标抗原进行8个梯度的1:10系列稀释，起始浓度为10 µg/mL或1 µg/mL的蛋白。 
	注意：务必预先测试该稀释系列。或者，可根据需要调整稀释比例（如1:5、1:20或1:30），以覆盖完整的释放曲线。此外，起始浓度可根据实验设计进行调整。</li>
	<li>洗涤接种于96孔板上的huRBL细胞时，先小心吸出含血清的细胞培养基，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除残留液体。</li>
	<li>每孔加入200 µL 1x Tyrode缓冲液洗涤细胞，所有孔均需同样处理。 
	注意：添加洗涤液时应缓慢，避免扰动细胞。</li>
	<li>静置约30秒，共重复洗涤三次。</li>
	<li>最后一次加入洗涤液后，将液体保留在孔中，直至准备加入抗原稀释液。 
	注意：避免细胞暴露于空气中过久。</li>
	<li>向每孔已致敏的huRBL细胞中转移100 µL抗原溶液。 
	注意：若需同时分析多个不同参数，可先将稀释系列的各单个样本转移至另一块非结合型96孔板中（布局与huRBL细胞板一致），随后使用多通道移液器直接将其转移至huRBL细胞板上。此方法可避免细胞长时间暴露于空气中，从而防止检测性能下降（信号降低或无信号）。</li>
	<li>向对照孔（最大裂解孔和未致敏背景孔）中各加入100 µL 1x Tyrode缓冲液。这些对照孔不添加抗原刺激。
	<ol>
		<li>此外，在稀释系列中已致敏但不加抗原的孔中也加入100 µL 1x Tyrode缓冲液，以便在数据分析时考虑致敏细胞的抗原非依赖性自发释放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将huRBL细胞在37 °C、5%-7% CO2条件下孵育1小时。</li>
</ol>
6. 荧光法测定β-己糖胺酶活性
<ol>
	<li>在最大裂解对照孔中每孔加入 10 µL 的 10% Triton X-100，充分混匀，以彻底裂解细胞，实现 β-己糖胺酶的 100% 释放。</li>
	<li>将 50 µL 底物溶液加入一个新的非结合型 96 孔板中。配制一份 96 孔板所需的底物溶液：5 mL 的 0.1 M 柠檬酸检测缓冲液（pH 4.5）和 80 µL 的 10 mM 4-甲基伞形基-N-乙酰-β-D-葡糖胺。</li>
	<li>将所有孔中的 50 µL 细胞上清液转移至含有底物溶液的新板中。 
	注意：从 huRBL 板中吸取上清液时应小心操作，避免扰动 huRBL 细胞。</li>
	<li>将含有底物溶液和细胞上清液的板在 37 °C 下孵育 1 小时，以完成荧光底物的转化。 
	注意：保留 huRBL 板用于细胞活力检测。</li>
	<li>每孔加入 100 µL 终止液（15 g/L 甘氨酸，11.7 g/L NaCl 溶于 dH2O 中，pH 10.7）。</li>
	<li>使用酶标仪在 360 nm 激发波长和 465 nm 发射波长下测定荧光强度。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>对于释放率的百分比基本计算，可使用任意电子表格软件。</li>
	<li>对于背景扣除/基线消除，从所有其他孔中减去背景孔的平均值。</li>
	<li>计算最大裂解孔的均值，并将稀释系列的数据表示为百分比。通过此方法，可将数据表达为相对于细胞裂解所引起的最大酶释放量归一化后的细胞释放百分比。</li>
	<li>完整的剂量-反应介质释放曲线最好以XY图表示，其中X轴为抗原浓度的对数，Y轴为介质释放百分比。</li>
	<li>将无抗原对照的数值作为虚线添加，以指示背景或底部平台值。 
	注意：可使用此归一化策略比较多个经相似处理的血清样本。为进行直接比较，建议进一步计算半最大释放量，即达到半最大释放所需的抗原浓度（单位为 ng/mL），该值定义为每条曲线最大值与最小值的平均值。通过将半最大释放值插入对数回归线进行插值，计算刺激半最大释放所需的抗原浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的基于huRBL细胞的介质释放检测法是一种稳健且易于在任何实验室中实施的方法。唯一的要求是细胞必须在无菌条件下培养。该检测用于评估过敏原或致敏来源引发患者IgE交联及嗜碱性粒细胞脱颗粒的可能性17。只要能获得含有针对目标过敏原的高浓度特异性IgE的患者血清，该方法便可轻松适用于任何过敏原或致敏来源。建议在进行介质释放检测的同时开展细胞活力检测，以排除可能影响检测性能的潜在细胞毒性效应。这些效应可能源于血清补体灭活不完全，或其他来源于血清的细胞毒性作用。甚至抗原本身（例如因其蛋白水解或酶活性）也可能对huRBL细胞造成损伤。我们通常采用MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）细胞活力检测法来评估潜在的细胞毒性效应。该检测可在收集并转移细胞上清液后（见方案第6.3步），利用剩余的huRBL细胞轻松完成。与ELISA和蛋白质印迹等其他免疫化学方法（这些方法通过过敏原-IgE结合来评估单一过敏原或复杂提取物的致敏潜力）相比，本检测不仅能检测IgE与过敏原的结合，还能评估人IgE和过敏原在引发IgE介导的嗜碱性粒细胞脱颗粒方面的功能性18。因此，该方法可借助患者血清在体外条件下辅助研究过敏症状的严重程度。ex vivo 该检测相比传统的被动皮肤过敏反应试验具有更高的重复性和效率，因其采用RBL-2H3细胞，这类细胞相对易于操作，且结果变异性较肥大细胞或人嗜碱性粒细胞等原代细胞更小19,20。此外，该检测能较好地反映过敏原的生物活性，并可准确估算给定复杂样品中的总过敏原含量3。如需对方案中某些步骤进行故障排查，请参见表1。
关于该版本介质释放试验的适用性，其主要被用于研究目的，同时也用于基于生物活性的变应原提取物的标准化。这包括对不同批次的皮肤点刺试验（SPT）溶液、激发试验溶液以及用于变应原特异性免疫治疗的提取物进行分析；已有研究涉及花粉、猫皮屑、屋尘螨和花生提取物，以及蜂毒3,17,21。该技术尤其适用于食物过敏的诊断，因为它能够检测复杂食品（如花生、牛奶、小麦和鸡蛋）中极微量的变应原成分22。在此方面，该方法也被报道为评估动物源性食物变应原（如原肌球蛋白）致敏性的有效工具，并有助于区分强效变应原与非变应原23。作为研究工具，该试验可用于研究食品加工的影响，以及配体与变应原结合对其致敏性的影响24,25。例如，已有研究表明，Bet v 1 与配体的结合并不影响变应原-IgE 的交联，但会增强其热稳定性和蛋白水解稳定性25。该试验可用于比较患者对主要和次要变应原的反应性，也可用于研究变应原同源物和亚型之间的交叉反应性，如本示例中使用 Bet v 1 和同源食物变应原 Cor a 1 所示（图3）。关于变应原亚型，介质释放试验已被用于鉴定豚草花粉（Ambrosia artemisiifolia）中IgE反应性最强的主要变应原Amb a 1.01。相比之下，豚草花粉提取物中鉴定出的另外两种亚型Amb a 1.02和Amb a 1.03对患者IgE的反应性较低26。
近年来，该检测方法已被用于研究潜在的抗过敏化合物以及变应原的新型低致敏性变体，有助于筛选适用于变应原特异性免疫治疗的候选物质27,28。另一种新方法是利用该检测来监测变应原特异性免疫治疗过程中的疗效。在这方面，我们的研究团队开发了一种人源化RBL（huRBL）检测抑制系统，其结果与变应原特异性免疫治疗期间患者症状评分的降低具有良好相关性29。该检测还被提议用于研究TGFβ1对变应原诱导的IgE介导脱颗粒反应的免疫抑制作用30。
该检测方法的局限性在于，尽管人源RBL（huRBL）细胞具有某些肥大细胞或嗜碱性粒细胞的特征，但并不能完全模拟这些效应细胞的天然功能。例如，肥大细胞广泛表达模式识别受体Toll样受体4（TLR4），该受体在病原体识别中起关键作用，而RBL-2H3细胞则完全缺乏TLR4的表达31。由于这种功能上的差异，在解读实验数据时需始终注意该检测方法无法完全再现真实生理情况。此外，由于huRBL细胞属于癌变的嗜碱性细胞，培养条件的变化或长期培养可能导致表型差异，从而引起不同实验室之间结果的不一致20。另一个需要考虑的因素是在方法优化过程中对过敏原浓度的选择，因为高浓度的过敏原可能因含有大量蛋白酶或内毒素而引发非IgE介导的脱颗粒反应18。其他局限性还包括依赖于特异性IgE水平相对较高的人血清（RAST 5–6级），以及需要细胞培养系统，这仍是将该技术应用于日常临床实践所必须克服的障碍。
除了这些局限性之外，huRBL 检测是一种用于过敏性疾病诊断和治疗的有价值的研究工具，可广泛应用于多种研究领域。

I型超敏反应以产生针对特定抗原的免疫球蛋白E（IgE）为特征，影响全球近三分之一的人口。此类反应与多种过敏表现相关，例如哮喘和变应性鼻结膜炎，甚至可能引发全身性危及生命的反应。1。与 体内 检测、免疫化学方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA））仅适用于研究抗体的靶向结合，但无法反映可引发即刻型超敏反应的蛋白质的功能特性。将过敏原固定在固相载体（如ELISA板）上可能导致其结构完整性改变，并破坏与过敏相关的表位。2即使是皮肤点刺试验（SPT）——用于确认对特定过敏原致敏的最常用工具——在检测症状性IgE介导的食物过敏或过敏原可获得性方面也存在局限性。3,4为了找到一种伦理、高特异性、高灵敏度且成本效益高的方法来检测变应原引发I型超敏反应的生物活性，已建立了所谓的介质释放试验。
这些检测方法的原理依赖于致敏阶段之后发生的事件，以及IgE与效应细胞（如肥大细胞和嗜碱性粒细胞）表面表达的高亲和力受体α链结合的能力。IgE主要由黏膜相关淋巴组织中的浆细胞产生。尽管IgE在血液中含量最低（在非特应性个体中约为0.05%），但其具有极高的生物学活性，是引起过敏症状的主要原因。当IgE与其效应细胞表面受体结合后，其半衰期可从2–3天延长至数周甚至数月。当抗原与两个受体结合的IgE分子的可变区结合时，会引发IgE分子的交联，进而激活效应细胞内的下游信号级联反应，导致脱颗粒并释放多种促炎介质，如组胺、丝氨酸蛋白酶（例如类胰蛋白酶）和前列腺素，从而引起血管扩张5,6,7。白细胞介素4（IL-4）和IL-13等细胞因子的分泌则维持了炎症性辅助T细胞2（Th2）反应，并促进B细胞类别转换为产生IgE的浆细胞5,8,9。另一方面，释放的血栓素引起支气管收缩，而白三烯则刺激平滑肌收缩和血管渗漏，在气道炎症中发挥关键作用，导致哮喘或过敏性鼻炎10,11。
尽管存在一些主要缺陷，但针对上述大多数介质的分析研究工具已经建立。类胰蛋白酶检测是通过肥大细胞活化来评估全身性过敏反应的合适临床方法，但其在过敏诊断中的敏感性和特异性与SPT等金标准方法相比仍不够准确。另一方面，半胱氨酰白三烯检测无法用于诊断对β-内酰胺类抗生素或非甾体抗炎药的过敏反应12。组胺作为过敏反应中释放的主要介质，其检测方法早在20世纪60年代就已建立。组胺一旦释放到外周血中，会立即被组胺-N-甲基转移酶降解，血浆半衰期仅有数分钟，这使得其检测极具挑战性13。除了稳定性差之外，研究还表明，组胺监测在药物过敏、商品化食物蛋白以及黄蜂毒液过敏中的敏感性和特异性均较低12。
体外效应细胞系模型已被引入，作为从过敏患者中分离和培养嗜碱性粒细胞以进行释放试验的劳动密集型方法的替代方案。因此，已建立基于大鼠嗜碱性白血病（RBL）细胞系RBL-2H3的检测方法3。由于该细胞系无法结合人IgE，首先将其转染表达人IgE质膜受体（FcεRI）的α、β和γ亚基。已构建多个克隆，并对其人源α亚基的表达水平和均一性进行测试，其中克隆RBL-30/25被确定为最适用于体外检测的候选株。通过钙流测定法检测转染克隆受体激活后诱导的信号级联反应。以溶酶体酶β-己糖胺酶作为脱颗粒的指标和组胺释放的替代标志物，其具有显著更高的稳定性优势14。利用RBL-30/25细胞进行的介质释放可高达100%，因此被用于检测来自过敏患者的血清样本。该检测方法已用于评估致敏细胞经商业化变应原提取物刺激后的介质释放情况。研究发现，不同厂家生产的变应原提取物在组成上存在巨大差异（总蛋白含量差异可达60倍），而这些提取物常被用于诊断（如皮肤点刺试验SPT）或治疗目的3,15,16。
本文详细描述了利用过敏供体血清进行介质释放试验的RBL检测方案。在被动致敏过程中，血清中的IgE被嗜碱性细胞表面表达的高亲和力FcεR1受体捕获。抗原刺激后，与抗原特异结合的IgE发生交联，从而触发细胞脱颗粒并释放介质β-己糖胺酶。随后使用适当的底物测定β-己糖胺酶的活性。本实验采用huRBL-2H3细胞，并在以下方案中简称为huRBL。该方案包含一个标准抗原稀释系列，共8个稀释步骤，按1:10逐级稀释，过敏原浓度范围从1 µg/mL至0.1 pg/mL。

<table><tbody><tr><td>4-甲基伞形酰基-N-乙酰-&amp;beta;-D-葡糖胺</td><td>西格玛</td><td>M2133</td><td></td></tr><tr><td>用于 huRBL 细胞的 96 孔板（Nunc MicroWell 96 孔，Nunclon Delta 处理，平底微孔板）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>用于底物溶液和细胞上清液的 96 孔板（Greiner Bio-One 未处理 96 孔微孔板）</td><td>费舍科学</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>西格玛</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Applichem</td><td>131018</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS，不含钙和镁）</td><td>西格玛</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>西格玛</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Applichem</td><td>A3707</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛/牛血清（FCSi）</td><td>西格玛</td><td>F0804</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>西格玛</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>含α改良的伊格尔最低必需培养基，含核糖核苷、脱氧核糖核苷和碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺，液体，无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>西格玛</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 减血清培养基，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>吉布科/赛默飞世尔科技</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10K 单位青霉素&amp;nbsp;，10 mg/mL 链霉素）</td><td>西格玛</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO3）</td><td>Applichem</td><td>131638</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>西格玛</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>西格玛</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s 盐</td><td>西格玛</td><td>T2145</td><td></td></tr></tbody></table>

人源化介质释放检测作为过敏原效力的读出方法

Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency

中介体释放检测分析 体外 免疫球蛋白E（IgE）介导的效应细胞（如肥大细胞和嗜碱性粒细胞）在系列稀释的疑似过敏原刺激下发生脱颗粒并释放介质。因此，这些检测方法是一种重要的工具，可模拟该过程 体内 脱颗粒过程，该过程在致敏患者接触变应原或进行皮肤点刺试验时发生。此外，这些检测通常用于研究蛋白质的致敏潜力以及患者血清的反应性。本文中，我们描述了一种简单的两日实验方案，采用经转染并人源化表达人高亲和力IgE膜表面受体（FcεRI）的永生化大鼠嗜碱性白血病细胞系。该版本的介质释放检测具有稳健、灵敏且可重复的特点 体外 无需将抗原固定于固相基质的基于细胞的检测系统。该实验方案包括以下步骤：（1）人血清补体灭活，（2）细胞的收集、接种与被动致敏，（3）用抗原刺激以诱导介质释放，（4）测定β-己糖胺酶活性，作为组胺等释放的炎症介质的替代指标。该检测方法可用于评估过敏原-IgE交联诱导细胞脱颗粒的能力，适用于标准化过敏原提取物，比较患者对主要或次要过敏原及过敏原提取物（如花粉、猫皮屑等）的反应性，研究过敏原同源物、异构体和构象变体（如低致敏性）的活性强度，以及配体对过敏原活性的影响。一项较新的应用是利用该检测监测变应原免疫治疗过程中的疗效。

基于huRBL细胞的介质释放实验（图1A和B）呈现出钟形剂量-反应曲线（图1C）。为简化数据表示，可通过线性回归计算引发半最大介质释放所需的抗原浓度（图1D）。通过细胞活力实验排除致敏血清或刺激所用抗原可能引起的细胞毒性效应（图1E）。该实验可用于检测不同血清对特定抗原的反应性。在本例中，来自桦树花粉过敏患者的5份血清中有4份对Bet v 1刺激产生反应。血清#1表现出最高的介质释放水平（图2）。血清#5对Bet v 1刺激无反应，因此可能对其他桦树花粉过敏原（如Bet v 2，profilin）产生反应。这些数据表明，Bet v 1是一种强效过敏原，可引发IgE介导的过敏症状。利用huRBL实验，可评估IgE对同源过敏原的交叉反应性（图3）。在此例中，两名桦树花粉过敏患者均对Bet v 1产生良好反应，但仅有患者#2对榛子中的Bet v 1同源食物过敏原Cor a 1产生反应。根据这些数据，患者#2体内Cor a 1交叉反应性IgE水平很可能高于患者#1，因此在食用榛子后更易出现口腔过敏症状。甚至可利用该实验分析并比较过敏原突变体（低致敏性）与其野生型对应物的特性（图4）。在所提供的示例中，与野生型过敏原相比，折叠突变体的释放曲线向更高抗原浓度方向偏移，导致引发半最大释放所需的抗原浓度显著升高（图4B）。这些数据表明，所构建的突变体/折叠变体相较于野生型蛋白致敏性更低。其引发IgE介导脱颗粒的能力减弱，凸显了该折叠变体的低致敏特性。基于该实验结果，该折叠变体是用于过敏原特异性免疫治疗的一个有前景的候选分子，因其在治疗过程中可能引起较少的IgE相关不良反应。
<img alt="Bet v1浓度对介质释放和细胞活力的显微镜图像和图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：人源化RBL细胞及IgE-变应原交联诱导的β-己糖胺酶释放的典型钟形曲线。 RBL细胞贴附于培养瓶，呈现杆状，因其正在尝试贴壁（A）。细胞收获时理想的汇合度不应超过90%（B）。图中分别显示40倍和10倍放大下的细胞形态。细胞经对重组桦树花粉主要变应原Bet v 1（rBet v 1）有反应的桦树花粉过敏患者人血清致敏后进行激发（C）。以细胞上清液中β-己糖胺酶活性作为介质释放的替代指标进行测定。钟形曲线的形成是由于变应原过量时，IgE上的抗原表位呈单价结合，从而在高抗原浓度下竞争性抑制了变应原-IgE的交联。另一种解释是，在抗原过量存在下，细胞内信号通路受到抑制，导致高抗原浓度时释放量降低。为确定获得半最大释放量所需的变应原浓度，采用基于实验值的对数回归线，该实验值代表介质释放曲线斜率的线性部分（D）。红色虚线表示用于计算的对数回归线，回归线公式以红色显示。半最大释放量定义为：半最大释放量 =（最小释放值 + 最大释放值）/ 2。本示例中，计算得到的半最大释放量为20.6%。本实验所用代表性人血清以1:20稀释后与huRBL细胞共孵育，刺激所用抗原浓度范围为100 µg/mL至0.004 pg/mL的Bet v 1。在抗原刺激后，对剩余细胞进行细胞活力检测（本例为MTT法），以评估致敏血清及抗原稀释度对细胞活力和细胞数量的影响（E）。未处理的背景细胞和裂解细胞（最大裂解）以虚线表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同浓度 Bet v 1 对介质释放的影响曲线；五条血清反应曲线；过敏检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：五份不同人血清中β-己糖胺酶释放百分率的代表性曲线。将相同浓度梯度的重组Bet v 1抗原与经不同桦树花粉致敏个体血清致敏的huRBL细胞共同孵育。不同患者之间的释放百分率存在明显差异，与各自症状的严重程度相对应。请注意，患者#5对主要桦树花粉过敏原Bet v 1无反应性。获得这五条介质释放曲线所用的五份人血清在与huRBL细胞孵育前均等比稀释至1:20。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同抗原浓度下的介质释放量对比图；患者对桦树花粉蛋白 Bet v 1 和榛子过敏原 Cor a 1 的过敏反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：桦树花粉致敏患者血清中提取的 IgE 与同源榛子过敏原 Cor a 1 的交叉反应性。 两名代表性桦树花粉致敏患者的血清对 Bet v 1 均表现出强烈反应，同时对同源过敏原 Cor a 1 也有一定程度的反应。患者 2 对 Cor a 1 的反应显著，因此在摄入榛子后很可能出现口腔过敏综合征症状；而患者 1 的介质释放几乎可忽略不计。虚线代表无抗原对照组，即使用人血清致敏但未用过敏原刺激的细胞，用于指示信号基线/背景值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="介体释放与抗原浓度关系图及箱形图；rBet v 1 研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62702/62702fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：rBet v 1 野生型与低致敏性折叠变体的释放百分比比较。 使用一名对桦树花粉致敏个体的相同血清，分别与 rBet v 1 野生型（wt）及主要桦树花粉过敏原的一种低致敏性折叠变体共同孵育（A）。尽管两种抗原均引起介体释放，但在达到相同释放百分比时，折叠变体相较于野生型 rBet v 1 明显向更高抗原浓度方向偏移。比较不同抗原释放百分比差异的常用方法是计算达到半最大释放所需抗原浓度（B）。该方法通常在生物学重复中进行（即在不同人源血清中检测每种过敏原的相同抗原浓度范围）。通常，为得出具有显著性的结论，介体释放实验需使用至少 8 至 10 名不同患者的血清。此处以 4 份不同血清的结果作为示例绘图。统计分析采用配对 t-检验。*p ≤ 0.05；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001；****p ≤ 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62702/62702fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" fo:text-align="left">
	<tbody>
		<tr>
			<td>可能遇到的问题及解决方案</td>
			<td>解决方法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">由于细胞反应性改变导致的实验间变异</td>
			<td>确保细胞传代次数不超过20至30代。在早期传代时制备冻存细胞，用于后续实验。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>应优先依赖生物学重复（使用不同血清）而非技术重复。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血清中特异性IgE水平较低</td>
			<td>可使用较低的最终血清稀释倍数（例如1:10）代替1:20。相反，对于含有较高水平特异性IgE的血清，可进一步稀释（1:30或1:40）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞数量不足以完成实验</td>
			<td>确保T-75培养瓶中的细胞融合度在50%-90%左右。增加培养瓶数量进行传代。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血清的细胞毒性效应，例如补体未完全灭活所致</td>
			<td>除介质释放实验外，同时进行细胞活力检测。提高Ag8浓度以避免补体未完全灭活。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>信号过低</td>
			<td>通过将1×Tyrode缓冲液用重水（D2O）代替去离子水（dH2O）稀释，或使用对目标过敏原具有更高特异性IgE水平的血清，以提高实验的信噪比。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过敏原在Tyrode缓冲液中不稳定（例如出现沉淀）</td>
			<td>在实验前对1×Tyrode缓冲液中的过敏原进行稳定性测试。不建议替换Tyrode缓冲液。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>难以确定相应过敏原的合适起始浓度</td>
			<td>调整稀释梯度以覆盖完整的释放曲线（增加稀释步骤，使用1:20稀释代替1:10）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>实验表现不佳，表现为信号低或无信号</td>
			<td>避免血清或抗原刺激引起的细胞毒性效应（如酶类过敏原）。小心清洗和浸泡细胞，避免长时间暴露于空气中，防止细胞干燥。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>如何判断是否已达到底部信号平台？</td>
			<td>在实验板中加入“无抗原”对照组。这些是已致敏但仅用1×Tyrode缓冲液刺激、未加过敏原的细胞。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>除了最大裂解孔外，是否还需要阳性对照？</td>
			<td>可额外使用已知能引起脱颗粒的血清与抗原组合，或使用抗-FcεR1抗体作为阳性对照。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>需要多少孔？</td>
			<td>这取决于您的滴定系列、待分析抗原和血清的数量。根据将要测试的血清/抗原数量规划96孔板的布局。不要忘记加入“无抗原对照”、背景细胞（未致敏且未刺激）以及最大裂解孔。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>应测试多少份血清？是否需要重复？</td>
			<td>尽管该实验较为稳健，但由于细胞反应性的变化仍可能存在实验间变异。因此，建议优先采用生物学重复（使用不同血清）而非技术重复。分析过敏原时，至少测试八份不同的血清即可；但如图4B所示，使用更少的血清也能获得显著结果。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：故障排除。

本文介绍了使用转染了人IgE受体的大鼠嗜碱性白血病细胞系进行的介质释放试验，以模拟在I型过敏反应中通常观察到的效应细胞脱颗粒过程。该方法以高度敏感、可重复且可定制的方式研究过敏原的生物活性。

中介物释放检测法用于分析效应细胞（如肥大细胞）在体外由免疫球蛋白E（IgE）介导的脱颗粒及介质分泌过程。

该检测是一种重要的研究工具，可用于模拟由患者IgE与过敏原交联所诱导的嗜碱性粒细胞脱颗粒过程。因此，该检测可用于模拟Ⅰ型过敏反应。该检测具有稳健性、可重复性，并可根据需要进行调整。此外，该方法具有高灵敏度，即使使用少量重组或纯化的过敏原，甚至复杂的过敏原提取物也可进行检测。该方法通过分析患者IgE对过敏原的反应性，用于过敏症的诊断。同时，该方法也适用于分析交叉反应性以及监测变应原特异性免疫治疗（AIT）的疗效。从细胞培养瓶中收集 Ag8 细胞，并将细胞转移至离心管中。在室温下以 250 × g 离心五分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，用人源化 RBL 细胞培养基重悬细胞沉淀，调整细胞终浓度约为每毫升 1 × 10⁶ 个细胞。将人血清在Ag8细胞悬液中按1:10稀释，使检测中的最终血清稀释度为1:20，在37摄氏度及5%至7%二氧化碳条件下孵育一小时。当人源化RBL细胞达到50%至90%汇合度时，小心地从T-75细胞培养瓶中吸出培养基，注意不要触碰已贴壁的人源化RBL细胞。通过向培养瓶的对侧加入10毫升DPBS进行两次洗涤，避免直接加到细胞上。吸去DPBS，加入5毫升预热的1×胰蛋白酶-EDTA溶液以使细胞脱离，于37°C孵育5分钟。轻轻拍打培养瓶使细胞脱落。将细胞悬液转移至15毫米离心管中，并用含人源化RBL细胞培养基或DPBS补满离心管，以稀释胰蛋白酶-EDTA。在室温下以250 × g离心细胞5分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于5 mL人源化RBL细胞培养基中用于细胞计数。计数后，用人源化RBL细胞培养基稀释细胞，使其最终浓度为每毫升2 × 10⁶个细胞。每孔加入 50 µL 人源化 RBL 细胞悬液，相当于每孔 1 × 10⁵ 个细胞，置于无菌 96 孔板中。离心预孵育的 Ag8 血清悬液，并将 50 µL 离心后的 Ag8 血清悬液转移至各含有人源化 RBL 细胞的孔中，注意不要扰动 Ag8 细胞沉淀。使用未加抗原的致敏未刺激细胞作为空白抗原对照，以指示最低信号平台或背景值，且背景对照孔和最大裂解对照孔无需进行致敏处理。将培养板盖上盖子，在37摄氏度及5%至7%二氧化碳条件下过夜孵育。吸去含有细胞培养基的血清，将培养板倒置并在吸水纸上轻拍以排空培养板，用于洗涤人源化RBL细胞。每次加入200微升Tyrode缓冲液，每孔洗涤三次，前两次洗涤每次孵育约30秒。第三次加入 Tyrode 缓冲液后，吸去缓冲液，并将溶液保留在孔中，直至准备加入抗原稀释液。向每孔含有预致敏人源化 RBL 细胞的孔中转移 100 微升抗原溶液，但不要用抗原刺激最大裂解孔和非致敏背景孔中的细胞。在最大裂解对照孔、非致敏背景对照孔以及致敏无抗原孔中各加入 100 微升 Tyrode 缓冲液。将细胞在37摄氏度及5%至7%二氧化碳条件下孵育1小时。向最大裂解对照孔中每孔加入10微升10%曲拉通X-100，充分混匀，以实现细胞完全裂解，使β-己糖胺酶100%释放。向一个新的非吸附型96孔板中每孔加入50微升底物溶液。从含有人源化RBL细胞的培养板孔中转移50微升上清液至含有底物溶液的新板中，在37摄氏度孵育1小时，以使荧光底物发生转化。每孔加入100微升终止液，并按照文本稿件中的描述测定荧光信号。在β-己糖胺酶活性检测中获得的钟形曲线表明，由于过敏原过量，免疫球蛋白E的抗原表位呈单价结合，从而在高抗原浓度下抑制了过敏原与免疫球蛋白E的交联。使用线性回归分析计算引起半数最大介质释放所需的抗原浓度。通过细胞活力检测排除致敏血清或刺激所用抗原可能产生的细胞毒性作用。在β-己糖胺酶活性检测中使用了五种不同的人血清，其中来自桦树花粉过敏患者的五份血清中有四份对Bet v 1刺激产生反应，表明Bet v 1是一种可引发免疫球蛋白E介导过敏症状的有效过敏原。评估了免疫球蛋白E对同源过敏原的交叉反应性。两名患者均对Bet v 1产生反应，但患者二还对Cor a 1产生反应。该结果表明患者二体内针对与Bet v 1同源的食物过敏原Cor a 1的交叉反应性免疫球蛋白E水平较高。通过与野生型对应物进行比较，评估了过敏原突变变体的低致敏性。与野生型过敏原相比，Bet v 1 折叠变体的释放曲线向更高抗原浓度方向偏移，导致引发半最大释放所需的抗原浓度显著升高，这表明该突变体致敏性更低，因此可作为过敏原特异性免疫治疗的候选分子。在加入抗原稀释液之前，切勿将细胞脱离洗涤液，以避免细胞干燥，否则将导致检测性能下降。该检测可用于多种不同应用，包括基于生物活性对变应原产品进行标准化，例如用于皮肤点刺试验的溶液或用于变应原特异性免疫治疗的提取物。

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