Name: 研究钝力损伤对成年斑马鱼影响的可扩展模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解利用改良Marmarou落重法在成年斑马鱼中建立钝力创伤性脑损伤模型的方法。该技术可研究神经再生机制及不同损伤严重程度的病理反应，为创伤性脑损伤研究提供可扩展的动物模型。

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作者感谢Hyde实验室成员的深入讨论，感谢圣母大学Freimann生命科学中心技术人员在斑马鱼饲养与管理方面的支持，以及圣母大学光学显微镜核心设施/NDIIF提供仪器使用及相关服务。本研究得到了圣母大学斑马鱼研究中心、圣母大学干细胞与再生医学中心的支持，并获得美国国立卫生研究院国家眼科研究所R01-EY018417（DRH）、美国国家科学基金会研究生研究基金项目（JTH）、圣母大学LTC Neil Hyland奖学金（JTH）、自由卫士奖学金（JTH）和Pat Tillman奖学金（JTH）的资助。

斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼设施中饲养和维护。本手稿中描述的方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 创伤性脑损伤模型
<ol>
	<li>向1 L系统水（1 L去离子反渗透水中加入60 mg Instant Ocean）中加入1 mL 2-苯氧基乙醇。</li>
	<li>准备一个充氧恢复水箱，内含2 L室温的系统水。</li>
	<li>选择所需质量的钢珠轴承以及所需长度和直径的钢/塑料管，测定能量和冲击力。 
	注意：导管的内径应确保钢珠能够通过，且不改变其运动路径或速度。
	<ol>
		<li>测定撞击时的动能： 
		<img alt="动能公式 KE=mgh，物理教育，能量转换解释" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
		其中， KE = 动能， m = 质量（单位：kg）， g = 重力， h = 从下落点到鱼的垂直高度（单位：m） 
		注意：此值提供以 J 为单位的动能。将该数值乘以 1,000 可换算为 mJ。 KE 基于一个加速运动的物体，即当滚珠轴承从静止位置下落时所发生的运动。</li>
		<li>使用长度为7.62 cm的钢/塑料管（末端距离斑马鱼颅骨板1.5 cm，总距离为9.1 cm）和一个质量为1.5 g（直径6.4 mm）的钢珠，诱导轻度创伤性脑损伤（miTBI）。该装置产生的动能为1.33 mJ。根据关键的创伤性脑损伤病理生理学标志物（如血管损伤、硬膜下/脑内血肿形成、神经元细胞死亡以及认知功能障碍）的实证评估，该损伤程度被确定为相当于轻度创伤性脑损伤（miTBI），且这些表型在严重程度依赖的方式下较好地重现了人类群体中所报道的结果。</li>
		<li>计算轻度创伤性脑损伤的动能 = <img alt="静态平衡公式，以毫焦耳为单位的功的计算，能量转换方程。" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>使用长度为 12.7 cm 的钢/塑料管（末端距离斑马鱼颅骨板上方 1.5 cm，总距离为 14.2 cm）和质量为 1.5 g（直径 6.4 mm）的钢珠，产生 2.08 mJ 动能，以制备中度创伤性脑损伤（moTBI）模型。</li>
		<li>计算动能 moTBI = <img alt="静力平衡公式；能量计算；物理方程；质量、重力、高度。" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"></li>
		<li>使用长度为7.62 cm的钢/塑料导管（导管末端距斑马鱼颅骨板上方1.5 cm，总距离为9.1 cm）和一个质量为3.3 g（直径8.38 mm）的钢珠，产生2.94 mJ的动能，以诱导重度创伤性脑损伤（sTBI）。</li>
		<li>计算动能 sTBI =  <img alt="静态平衡计算，公式展示势能转换为毫焦耳。" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>用油灰填满一个培养皿（图1，步骤1），并使用钝器（例如镊子的背部）将额外的油灰塑造成一个升高的平台（5 cm × 1.5 cm）图1，步骤 2）。
	<ol>
		<li>使用剃须刀片将升高的平台沿纵轴方向切成两个大致相等的半部分（图1，步骤3，红色虚线）。将两半部分组合成一个可容纳成年鱼体长的通道（图1，步骤 4）。使用额外的黏土构筑墙体，固定鱼体约 2/3 的部分，使头部保持暴露。</li>
		<li>在暴露的头部区域，垂直于器壁塑造一个小的支撑结构，以支撑头部，防止损伤时头部发生旋转或反冲图1，第4步。 
		注意：通道应足够深，以支撑鱼类呈背侧向上的体位，同时仍使头部能够高于周围的黏土。此外，头部支撑部分应贴合鱼类的自然曲度，支撑下颌和鳃部。</li>
		<li>确保落锤下落时不受通道侧壁的阻碍（图1，第4步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微型冲孔器和22号钢制薄板制作一个直径为3 mm的钢盘。每个钢盘可多次使用。</li>
	<li>将一条鱼放入含有50–100 mL 1:1000（1 mL/1 L，0.1%）2-苯氧基乙醇的烧杯中，麻醉至对尾部夹捏无反应。</li>
	<li>将鱼背侧朝上放置于通道内的黏土模具中，使其身体两侧固定，并在头部放置一个直径3 mm的22号钢制圆盘，使其中心对准预定的冲击点（图1，步骤 5）。
	<ol>
		<li>确保鱼体尽可能与目标面垂直对齐，以避免其头部向一侧倾斜，从而导致受力不均。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准铁架台和臂夹固定钢制/塑料管，使管底部位于斑马鱼头部上方1.5 cm处图1，步骤 6）。确保管路平直。
	<ol>
		<li>沿导管向下观察，确保导管位于钢板上方且已对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将钢珠（轻度和中度TBI使用1.5 g，重度TBI使用3.3 g）从预设高度（见步骤1.3.3-1.3.5）沿导管垂直下落，撞击位于目标神经解剖区域（如小脑）上方的钢制平板 图1，步骤5）以产生符合预期损伤程度的钝力型TBI。将受伤的鱼放入恢复缸中进行监测。 
	注意：根据损伤的严重程度，可能会出现死亡或强直-阵挛性癫痫发作。如果鱼类在创伤性脑损伤（TBI）后长时间无反应，可使用移液管或镊子进行尾部夹捏刺激，并评估其疼痛反应。</li>
</ol>
2. 成年斑马鱼脑外伤后癫痫发作的评分
<ol>
	<li>根据第1节所述的损伤方案对鱼类进行麻醉和损伤处理，并将受伤的鱼置于含有2 L系统水的充氧恢复缸中。</li>
	<li>将鱼放入恢复缸后，立即观察其是否出现创伤后癫痫发作的任何迹象。设定观察时间（例如1 h），并记录所有癫痫活动，包括癫痫评分（见下文描述）、每次癫痫发作的持续时间以及发生癫痫的鱼所占的百分比（图2A）。 
	注意：癫痫发作可能在损伤后立即发生，也可能在创伤性脑损伤（TBI）后数小时或数天内发生。癫痫可能长期持续，单条鱼可发生多次癫痫。设定1小时或更长的观察时间，可较好地反映癫痫发生率的整体趋势。</li>
	<li>采用Mussulini18提出的成年斑马鱼癫痫表型评分标准对鱼类进行评分。 
	注意：若不使用追踪软件，难以客观评估低于3分的癫痫评分。因此，在未使用软件进行评估时，仅应记录评分等于或高于3分的癫痫事件。</li>
</ol>
3. 脑组织解剖
<ol>
	<li>在实验终点时，将鱼置于1:500（2 mL/1 L，0.2%）的2-苯氧乙醇溶液中实施安乐死，直至鳃部运动停止且对尾鳍夹捏无反应。</li>
	<li>用模型黏土填充培养皿，并制作一个小凹槽，用于在解剖过程中支撑鱼体。</li>
	<li>将鱼背面向上放置于黏土模具中。用一枚解剖针穿过鱼体中线、体长一半的位置，再用第二枚解剖针插入头部基部后约5 mm处。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用#5 Dumont镊子钝性切断视神经，并移除眼球（图2A）。</li>
	<li>调整鱼体方向，使头端（吻端）在通过显微镜观察时位于最远端（图2B）。 
	注意：以下步骤适用于右利手操作者。左利手操作者可根据镜像方向进行相应调整。</li>
	<li>使用#5镊子缓慢将镊子一端插入右侧顶骨板下方，以 deliberate 剪切动作向头端方向移动，移除右侧顶骨和额骨板（图2C）。
	<ol>
		<li>操作时保持镊子角度为45°或更低，以避免解剖过程中刺穿脑组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将鱼体顺时针旋转90˚。将#5镊子一端插入左侧顶骨板下方，采用相同的剪切动作移除左侧顶骨和额骨板，从而完全暴露脑的背侧表面（图2D，E）。</li>
	<li>使用#5镊子钝性切断上颌骨。若嗅球为感兴趣区域，则应保留并避免损伤。</li>
	<li>使用#5镊子移除右侧鳃盖骨、前鳃盖骨、间鳃盖骨和下鳃盖骨（图2F）。</li>
	<li>使用#5镊子钝性切除颅骨开口后端的肌肉组织，暴露脊髓。</li>
	<li>使用#5镊子钝性切断脊髓。小心将镊子插入脑下方，轻柔地将脑从颅腔中取出。 
	注意：切勿夹捏脑组织。应使用镊子“托住”脑组织，或从尾侧进行切除，并利用暴露的脊髓作为夹持点来操作脑组织。</li>
	<li>将取出的脑组织置于9份100%乙醇与1份37%甲醛的混合固定液中，在4°C条件下于摇床上过夜固定。</li>
</ol>
4. 斑马鱼脑部水肿研究
<ol>
	<li>根据第1节所述的损伤方案对鱼类进行麻醉和损伤处理，并将鱼放入恢复缸中，直至其开始自由游动。</li>
	<li>损伤后将鱼放回正常饲养环境中饲养1天。</li>
	<li>在规定时间结束后，用1:500的2-苯氧乙醇对鱼实施安乐死。</li>
	<li>根据第3节所述方案解剖整个脑或目标脑区，并立即将脑组织置于一个小称量舟中。 
	注意：转移脑组织时需小心操作，使用精细镊子轻轻放置，避免刺破或刮擦脑组织，以防组织丢失。</li>
	<li>在天平上另取一个干燥用的小称量舟，根据损伤组别和脑编号进行标记，并去皮归零。使用可精确测量至0.001 g的天平以获得准确读数。</li>
	<li>将脑组织转移至已去皮的干燥称量舟中，记录脑的湿重。调整脑的位置，使其平放在称量舟上，背侧朝上。</li>
	<li>将装有脑组织的干燥称量舟放入设定为60 °C的杂交炉中，干燥8小时。</li>
	<li>干燥后，脑组织可能粘附在称量舟上，难以取出并转移至另一个已去皮的小称量舟中。避免用镊子夹取，以免损坏干燥的脑组织并造成组织损失。建议将精细镊子闭合后，从脑腹侧开始，以向上舀取的动作小心转移。</li>
	<li>使用以下公式计算每个脑组织的含水量（图4）： 
	<img alt="含水量公式，% 含水量=(湿重-干重)/湿重*100，静态平衡。" src="/files/ftp_upload/62709/62709eq05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 5"></li>
</ol>
5. 标记神经轴上的细胞增殖及制备固定组织。
<ol>
	<li>在 2 mL 去离子水（ddH2O）中配制 10 mM 的 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）溶液。</li>
	<li>在损伤后所需时间点（采用第 1 节所述方案），每次麻醉 3 至 4 条鱼，使用 50–100 mL 的 1:1000（1 mL/1 L，0.1%）2-苯氧基乙醇，直至鱼对尾部夹捏无反应。</li>
	<li>在湿润的海绵上切开部分切口，逐条将鱼腹侧朝上放入切口中。</li>
	<li>使用 30 G 针头向鱼体内注射约 40 µL 的 10 mM EdU 溶液。将鱼放回盛有系统用水的暂养缸中。 
	注：可在不同时间点重复注射，以标记更多增殖细胞；若需超过 1 周的追踪期，则可能需要重复注射。</li>
	<li>按照第 3 节所述方法收集脑组织，将脑组织成组放入含 2 mL 固定液（9 份 100% 乙醇与 1 份 37% 甲醛混合）的 5 mL 玻璃小瓶中。在 4 °C 条件下，于摇床上固定脑组织。 
	注：使用摇床或振荡平台可防止脑组织沉底，避免全脑端脑卷曲。</li>
	<li>在用于固定的同一玻璃小瓶中，用梯度乙醇溶液（75%、50% 和 25%）进行再水化，每步洗涤 15 分钟，随后在含 5% 蔗糖的 PBS 溶液中，室温摇床上洗涤 1.5 小时。将脑组织置于玻璃小瓶中，在含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 摇床上过夜保存。</li>
	<li>将脑组织从 30% 蔗糖/PBS 溶液中取出，用镊子转移至 12 孔板中（每孔放置一个处理组），孔内预加 2:1 的包埋液（2 份组织冷冻介质与 1 份 30% 蔗糖/PBS 混合）。在 4 °C 摇床上孵育过夜。</li>
	<li>将脑组织转移至 12 孔板的下一排孔中，完全浸入 100% 组织冷冻介质（TFM）中，在 4 °C 条件下孵育 2–24 小时。</li>
	<li>使用冷冻切片机样品头，在干冰上将脑组织以所需方向包埋于 TFM 中。</li>
	<li>进行冷冻切片（厚度 16 μm），将切片收集于带正电荷的载玻片上。在载玻片加热器上干燥 1 小时，随后可置于 -80 °C 保存，或直接进行免疫组织化学染色。</li>
	<li>在载玻片上围绕组织切片区域建立疏水屏障，并在载玻片加热器上干燥 20 分钟。</li>
	<li>先用 PBS 快速洗涤 5 分钟，再用含 0.05% Tween 20 的 PBS 溶液洗涤两次，每次 10 分钟。</li>
	<li>使用 EdU 细胞增殖检测试剂盒，按照制造商说明书进行 EdU 检测。</li>
	<li>分析载玻片，使用正置荧光显微镜或共聚焦显微镜对荧光标记的 EdU 阳性细胞进行定量分析。至少需使用 40 倍物镜，以清晰分辨单个细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+Report+of+Traumatic+Brain+Injury-related+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations%2C+and+Deaths-United+States%2C+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%2C+U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services%22%5BJournal%5D)">Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014.</a> Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).</li>
<li>Galgano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+current+treatment+strategies+and+future+endeavors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors.</a> Cell transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).</li>
<li>Santiago, L. A., Oh, B. C., Dash, P. K., Holcomb, J. B., Wade, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+comparison+of+penetrating+and+blunt+traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+injury%22%5BJournal%5D)">A clinical comparison of penetrating and blunt traumatic brain injuries.</a> Brain injury. 26 (2), 107-125 (2012).</li>
<li>Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergency+department+evaluation+of+traumatic+brain+injury+in+the+United+States%2C+2009-2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Head+Trauma+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010.</a> The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31 (6), 379-387 (2016).</li>
<li>Faul, M., Xu, L., Wald, M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+Brain+Injury+in+the+United+States%3A+Emergency+Department+Visits%2C+Hospitalizations+and+Deaths%22">Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits, Hospitalizations and Deaths</a>. , (2010).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch3+and+DeltaB+maintain+M%C3%BCller+glia+quiescence+and+act+as+negative+regulators+of+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Glia. 69 (3), 546-566 (2021).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLoS Biology. 17 (2), 3000159(2019).</li>
<li>Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+zinc+sulfate+results+in+differential+effects+on+olfactory+sensory+neuron+subtypes+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445(2016).</li>
<li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li>
<li>Becker, C., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Alyenbawwi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizures+are+a+druggable+mechanistic+link+between+TBI+and+subsequent+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Seizures are a druggable mechanistic link between TBI and subsequent tauopathy.</a> eLife. 10, 58744(2021).</li>
<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelia-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelia-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>McCutcheon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+traumatic+brain+injury+in+adult+zebrafish+demonstrates+response+to+injury+and+treatment+comparable+with+mammalian+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A novel model of traumatic brain injury in adult zebrafish demonstrates response to injury and treatment comparable with mammalian models.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (7), 1382-1393 (2017).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marmarou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+diffuse+brain+injury+in+rats.+Part+I%3A+Pathophysiology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics.</a> Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).</li>
<li>Mussulini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizures+induced+by+pentylenetetrazole+in+the+adult+zebrafish%3A+a+detailed+behavioral+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Seizures induced by pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization.</a> PloS One. 8 (1), 54515(2013).</li>
<li>Kalueff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li>
<li>Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+traumatic+brain+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of traumatic brain injuries.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).</li>
<li>Amamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+axolotls+can+regenerate+original+neuronal+diversity+in+response+to+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Adult axolotls can regenerate original neuronal diversity in response to brain injury.</a> eLife. 5, 13998(2016).</li>
<li>Yamamoto, S., Levin, H., Prough, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild%2C+moderate+and+severe%3A+terminology+implications+for+clinical+and+experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mild, moderate and severe: terminology implications for clinical and experimental traumatic brain injury.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (6), 672-680 (2008).</li>
<li>Lund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury%2C+acute+phase+course+and+deviations+in+physiological+variables%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Trauma+Resuscitation+and+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury, acute phase course and deviations in physiological variables: an observational study.</a> Scandinavian Journal of Trauma Resuscitation and Emergency Medicine. 24, 77(2016).</li>
<li>Levin, H., Arrastia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis%2C+prognosis%2C+and+clinical+management+of+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury.</a> The Lancet Neurology. 14 (5), 506-517 (2015).</li>
<li>Ruff, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+diagnosing+a+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+National+Academy+of+Neuropsychology+education+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Clinical+Neuropsychology%3A+The+Official+Journal+of+the+National+Academy+of+Neuropsychologists%22%5BJournal%5D)">Recommendations for diagnosing a mild traumatic brain injury: a National Academy of Neuropsychology education paper.</a> Archives of Clinical Neuropsychology: The Official Journal of the National Academy of Neuropsychologists. 24 (1), 3-10 (2009).</li>
<li>Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in fish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (7), 019018(2016).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Muller+glia+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons.</a> Annual Review of Visual Science. 6, 171-193 (2020).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

对神经创伤及相关继发性病变的研究长期以来主要集中于传统的非再生性啮齿类动物模型20。直到最近，才有一些研究将多种中枢神经系统损伤形式应用于具有再生能力的模型9,11,13,14,21。尽管这些研究提供了有价值的见解，但其局限性在于所采用的损伤方式在人类群体中并不常见（如穿透性创伤、化学消融、爆炸伤），和/或损伤程度难以量化，因此无法充分反映人类群体中与严重程度相关的病理异质性22,23,24,25。本文提出一种损伤...

创伤性脑损伤（TBI）是全球性的健康危机，也是导致死亡和残疾的主要原因。在美国，每年约有290万人经历一次TBI，2006年至2014年间，由TBI或TBI后遗症导致的死亡率上升了50%以上1。然而，由于损伤机制（MOI）的不同，TBI在病因、病理和临床表现上存在显著差异，而损伤机制也影响着治疗策略和预后判断2。尽管TBI可由多种损伤机制引起，但主要分为穿透性损伤和钝性损伤两类。穿透性损伤占TBI的较小比例，通常造成严重的局灶性损伤，局限于受刺入及周围脑区3。相比之下，钝性TBI在普通人群中更为常见，严重程度涵盖轻度、中度和重度，造成弥散性、异质性和全局性的脑损伤，影响多个脑区1,4,5。
斑马鱼（Danio rerio）已被用于研究涵盖中枢神经系统（CNS）的多种神经损伤6,7,8,9。与哺乳动物不同，斑马鱼具有天然且强大的再生能力，可修复中枢神经系统损伤10。目前的斑马鱼创伤模型采用多种损伤方法，包括穿刺、切除、化学损伤或压力波11,12,13,14,15,16。然而，这些方法所采用的损伤机制在人类群体中极为罕见，无法在不同损伤严重程度之间进行扩展，也无法反映钝力性创伤性脑损伤（TBI）后所报道的病理异质性及严重程度依赖性的继发性病变。这些因素限制了斑马鱼模型在理解人类群体中最常见的TBI类型（轻度钝力损伤）相关病理机制方面的应用。
我们旨在建立一种快速且可扩展的钝性创伤性脑损伤（TBI）斑马鱼模型，以提供研究损伤病理、TBI 继发性病变进展以及固有再生反应的新途径。我们改进了常用的大鼠 Marmarou17 自由落体打击法，并将其应用于成年斑马鱼。该模型可产生从轻度、中度到重度的可重复性损伤程度。该模型还能以损伤程度依赖的方式再现人类 TBI 病理的多个方面，包括癫痫发作、水肿、硬膜下和脑内血肿、神经元细胞死亡以及认知功能障碍（如学习和记忆能力受损）。损伤数天后，病理变化和功能缺陷逐渐消退，恢复至接近未损伤对照组的水平。此外，该斑马鱼模型在神经轴上表现出与损伤严重程度相关的显著细胞增殖和神经元再生反应。
本文详细介绍了钝性创伤的建立与诱导、创伤后癫痫发作的评分、血管损伤的评估、脑组织切片的制备方法、脑水肿定量分析的技术，以及对损伤后细胞增殖反应的深入理解。

<table><tbody><tr><td>2-苯氧基乙醇</td><td>Sigma Alderich</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>#00 号霰弹</td><td>Remington</td><td>RMS23770</td><td>用于中度创伤性脑损伤（sTBI）的 3.3g 重物</td></tr><tr><td>#3 号霰弹</td><td>Remington</td><td>RMS23776</td><td>用于轻度/中度创伤性脑损伤（miTBI/moTBI）的 1.5g 重物</td></tr><tr><td>#5 Dumont 镊子</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>5-乙炔基-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷</td><td>Life Technologies</td><td>A10044</td><td>EdU</td></tr><tr><td>5 ml 玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>66011-063</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne 12 孔板</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 人工海水</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Super Frost 带正电荷载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen 液体阻断笔</td><td>Ted Pella</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>组织冷冻介质</td><td>VWR</td><td>15148-031</td><td></td></tr></tbody></table>

一种可扩展的模型用于研究钝力损伤对成年斑马鱼的影响

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

钝性创伤性脑损伤（TBI）是最常见的头部外伤形式，其严重程度不一，并导致复杂且异质性的继发性损伤效应。尽管在人类中尚无机制能够替代或再生TBI后丢失的神经元，斑马鱼却具备在整个身体包括大脑中再生神经元的能力。为了研究斑马鱼在遭受钝性TBI后表现出的病理特征，并探索其后续神经再生反应的潜在机制，我们对常用于啮齿类动物的Marmarou落锤装置进行了改良，使其适用于成年斑马鱼。我们这一简单的钝性TBI模型具有可调节性，可诱导轻度、中度或重度TBI，并重现了人类TBI后多种表型特征，如接触性与创伤后癫痫发作、脑水肿、硬膜下及脑内血肿以及认知功能障碍，这些表型均随损伤严重程度而变化。TBI的继发性病变在损伤后数分钟内开始出现，但在伤后7天内逐渐消退并恢复至接近未损伤对照组水平。再生过程最早在损伤后48小时（hpi）启动，细胞增殖高峰出现在60 hpi。因此，我们的斑马鱼钝性TBI模型可产生与人类TBI相似的典型原发性和继发性损伤病理，为研究疾病的发生发展过程以及斑马鱼特有的神经元再生机制提供了有效平台。

制备损伤诱导装置可为成年斑马鱼提供一种快速且简便的可调节钝力性创伤性脑损伤（TBI）造模方法。该损伤模型的分级严重程度提供了若干易于识别的损伤成功指标，其中血管损伤是最容易观察且最显著的病理特征之一（图3）。所使用的斑马鱼品系可能影响该指标的识别难易程度。使用野生型AB鱼（WTAB，图3A–D）时，由于体表色素沉着，轻度TBI（miTBI）或中度TBI（moTBI）与未损伤对照鱼之间的血管损伤较难区分（图3A–C）。损伤后，miTBI鱼仅表现出轻微的体表擦伤（图3B），而moTBI鱼则出现有限的脑出血（图3C）。尽管重度TBI（sTBI）仍具一定挑战性，但其损伤程度通常较为明显（<strong class="xfig"...

我们改进了Marmarou落锤模型，用于成年斑马鱼，以研究钝力性创伤性脑损伤（TBI）后多种病理变化以及继发性神经元再生的潜在机制。该钝力性TBI模型具有可扩展性，可诱导轻度、中度或重度TBI，并重现了人类TBI中观察到的损伤异质性。

钝性外力所致的创伤性脑损伤（TBI）是最常见的头部创伤类型，其严重程度不一，可导致复杂且多样的病理生理变化。

本方案提供了一种简单、快速且可重复的方法，用于在成年斑马鱼中诱导可扩展的钝力性创伤性脑损伤。经历此种钝力性创伤性脑损伤的成年斑马鱼表现出许多与遭受钝力性TBI的人类相似的特征。本次实验操作将由本实验室的两名博士生James Hentig先生和Kaylee Cloghessy女士进行演示。首先，在培养皿中填满建模用黏土。然后用手指或镊子背面，用额外的建模黏土制作一个抬高的平台。使用剃须刀片沿长度方向将抬高的平台分成大致相等的两部分。将两部分塑造成一个通道，使其能够容纳一条成年鱼的长度。使用额外的黏土构建侧壁，固定鱼体的2/3，使头部露出。在暴露的头部区域，垂直于侧壁塑造一个小支撑，以防止损伤时头部发生旋转或回缩。确保通道的侧壁不会阻碍下落的重物。使用微型打孔器从22号钢制防水板上制备一个直径为3毫米的钢制圆片。将经麻醉后对尾部夹捏无反应的鱼腹朝下放置于通道内的黏土模具中，使其身体两侧被固定。将直径3毫米的22号钢制圆盘放置在鱼头顶部，中心对准预定的撞击点。将鱼体垂直对齐，避免头部向一侧倾斜，以防造成受力不均。使用标准铁架台和臂夹固定钢制或塑料套管，确保套管保持垂直，使其底部距离斑马鱼头部上方1.5厘米。观察导管下方，确保导管对准钢板上方。根据预期损伤程度选择合适的钢珠。从导管上方预定高度处释放钢珠，使其自由下落到钢板上。然后将受伤的鱼放入恢复缸中进行监测。用油灰填充一个培养皿，并制作一个小凹槽，以在解剖过程中支撑鱼体。将鱼背侧朝上放置于油灰模具中。用两枚解剖针固定，一枚穿过体部中线的中点，另一枚插入头部基部后约5毫米处。使用一对5号Dumont镊子钝性分离视神经并摘除眼睛。将5号镊子的一端置于右侧顶板下方。使用剪刀动作，从尾端向头端方向 deliberate 地移动，去除右侧额骨板。然后将鱼体顺时针旋转90度。将5号镊子的一端置于左侧顶骨板下方，采用相同的剪刀式动作去除左侧顶骨板和额骨板，暴露大脑的整个背侧表面。使用5号镊子钝性横断上颌，保留嗅球，避免损伤。用同一把镊子去除右侧的鳃盖骨、前鳃盖骨、间鳃盖骨和下鳃盖骨。随后钝性切除颅骨后端的肌肉组织，以暴露脊髓。使用镊子钝性横断脊髓。将镊子小心地置于脑组织下方，轻柔地将脑组织从颅骨中取出。根据文稿中的说明分离整个脑组织或目标区域，并立即用精细镊子将脑组织放置于小型称量皿上，注意避免刺破或刮伤脑组织。将脑组织转移至已去皮的干燥称量舟中，记录脑组织的湿重。调整脑组织的方向，使其背侧朝上，平放在称量舟中。然后将脑组织及干燥称量舟置于杂交炉中，60 °C 条件下烘干八小时。待脑组织干燥后，将其转移至一个新的已去皮重的小型称量舟中，用精细镊子夹紧，并从脑的腹侧开始，以向上舀取的动作进行操作。在湿润的海绵上做部分切口，每次将一条鱼腹侧朝上放入切口中，使用30号针头向鱼体内注射约40微升10毫摩尔的EdU溶液。然后将鱼放回装有系统用水的暂养缸中。按照前述方法收集脑组织，并将脑组织整体放入一个9毫升的玻璃小瓶中，瓶内含有2毫升固定液（由9份100%乙醇与1份37%甲醛组成）。将脑组织置于4°C的摇床上固定。使用冷冻切片机夹头将脑组织以所需方向包埋于干冰上的TFM中。血管损伤被发现是通过该模型识别成功造模的最简单且最显著的病理特征之一。识别该指标的能力随造模过程中所用鱼品系的不同而变化。由于色素沉着的影响，难以区分野生型AB鱼中轻度或中度创伤性脑损伤与未受损的对照组之间的血管损伤。损伤后，轻度TBI鱼类仅表现出轻微的表面擦伤，而中度TBI鱼类则出现有限的脑出血。严重TBI鱼类的损伤程度明显可见。相比之下，使用白化鱼或Casper鱼可轻松识别血管损伤。通过水肿评估脑部因损伤引起的肿胀。与之相反，中度TBI和重度TBI在损伤后1天和3天均表现出显著的水肿，但中度TBI和重度TBI的液体含量在损伤后5天已恢复至接近未受损对照组的水平。这种钝性损伤导致沿神经轴出现显著的细胞增殖反应。与未受损的对照组相比，前脑的室管膜区和室下区可见EdU标记增加。与未受损的鱼脑相比，受损脑组织在脑室周围灰质区、视顶盖叶以及前部下丘脑区域也表现出EdU标记增加。严重TBI后，与未受损的大脑相比，后脑的神经源性区域表现出细胞增殖增加。为确保损伤的正确诱导，请固定并稳定模具中的鱼，并保持导管笔直，以避免偏心撞击或改变重物下落轨迹。该方法为再生模型提供了一种快速且经济高效的钝性损伤诱导方式，特别适用于重复性头部创伤或损伤诱导再生研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

研究钝力损伤对成年斑马鱼影响的可扩展模型

在本视频中，受精的斑马鱼胚胎在体视显微镜下进行去壳处理，随后暴露于胆固醇合成抑制剂中，导致幼鱼出现血管破裂和脑出血。通过显微镜观察，可根据明显的红色斑点识别出血性幼鱼，并将其分离以进行后续分析。...

建立斑马鱼幼体药物诱导出血模型

脊髓横断后，成年斑马鱼在损伤后六周内可实现功能恢复。为了利用幼鱼的透明特性以及更快的恢复速度，我们介绍了一种横断斑马鱼幼体脊髓的方法。横断后，我们观察到感觉功能在损伤后2 天开始恢复，损伤后3天出现C形弯曲运动。...

幼年斑马鱼脊髓横断术

为了阐明斑马鱼成体神经发生与再生的细胞和分子机制，我们建立了一种侵入性手术方案，可在斑马鱼成体端脑中诱导机械性损伤，并通过免疫组织化学方法对刺伤半球后续发生的变化进行监测 原位...

斑马鱼成体端脑刺伤损伤：一种研究脊椎动物脑神经发生与再生的方法

在此，我们介绍一种通过注射庆大霉素诱导急性肾损伤来研究成年肾脏再生的可靠方法。我们证明了损伤程度依赖于庆大霉素剂量和环境温度 原位 杂交标记 lhx1a+ 形成新的肾单位。...

通过庆大霉素诱导损伤实现成年斑马鱼的肾脏再生

本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中制造机械性血管损伤的方法。该损伤模型为研究止血、与损伤相关的炎症反应以及伤口愈合提供了一个理想的平台，适用于实时显微镜观察的生物体。...

斑马鱼胚胎中的机械性血管损伤

本文介绍了3种成年斑马鱼损伤模型及其与免疫抑制药物治疗的联合应用。我们提供了再生组织成像以及其中骨矿化检测的技术指导。...

成年斑马鱼损伤模型用于研究泼尼松龙在骨组织再生中的作用

本文介绍了一种在斑马鱼幼鱼中定量评估脑出血后脑损伤、运动功能障碍和神经炎症的实验方案，该模型模拟人类脑内出血（ICH）的情况。...

利用斑马鱼幼鱼研究出血性中风的病理后果

本方案描述了使用顺铂作为肾毒性试剂在成年斑马鱼中诱导急性肾损伤（AKI）的操作步骤。我们详细介绍了评估该技术可重复性的方法，以及两种分别用于分析肾组织中炎症和细胞死亡的技术：流式细胞术和TUNEL检测。...

顺铂诱导的成年斑马鱼急性肾损伤模型

本文描述了一种用于研究成年斑马鱼高度再生能力所涉及的分子调控机制的机械性脑损伤模型。该方法阐述了如何在多种小型鱼类的视顶盖区域制造刺伤损伤，以通过荧光免疫染色评估其再生反应。...

利用斑马鱼和青鳉鱼视顶盖成年 stab wound 损伤模型进行再生能力比较分析

成年斑马鱼在脊髓损伤后具有功能恢复能力，是阐明神经再生内在机制的首选模型系统。本文中，我们描述了游泳耐力和游泳行为检测方法，作为脊髓再生功能的评估指标。...

成年斑马鱼游泳耐力与游泳行为的评估

本方案描述了一种冷冻损伤模型，用于诱导成年斑马鱼多个尾部肌节发生严重损伤。该方法为研究非哺乳脊椎动物在组织严重丧失后骨骼肌的再生提供了一种新途径。...

成年斑马鱼尾柄骨骼肌再生研究的冷冻损伤模型

了解利用改良Marmarou落重法在成年斑马鱼中建立钝力创伤性脑损伤模型的方法。该技术可研究神经再生机制及不同损伤严重程度的病理反应，为创伤性脑损伤研究提供可扩展的动物模型。

一种可扩展的模型用于研究钝力损伤对成年斑马鱼的影响

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