Name: 用于登德里脊柱研究的串行块面扫描电子显微镜 （SBEM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 了解连续块面扫描电子显微镜技术在小鼠海马体树突棘研究中的应用。该方法可实现高分辨率大体积组织成像，为解析突触可塑性与神经网络的连接机制提供重要支持。

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SBEM成像、光学显微镜成像以及电子显微镜样品制备均在实验生物学尼恩基研究所影像组织与功能实验室的设备上完成，该实验室为研究所的影像核心设施。
为制备图1，使用了小鼠（Souris_02）的图像以及来自 https://smart.servier.com/ 的一个试剂瓶。
本工作由波兰国家科学中心授予KR的Opus基金（项目编号：UMO-2018/31/B/NZ4/01603）资助。

研究严格遵守波兰神经研究所的指导原则，并获得当地伦理委员会的许可。实验遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）、波兰动物保护法，并经华沙第一地方伦理委员会批准。所有操作均尽可能减少使用动物数量并减轻其痛苦。
警告：由于所用试剂具有危险性，以下描述的所有操作必须在实验室通风橱中进行。需要采取个人安全防护措施，如佩戴手套、实验服、护目镜和面罩。
1. 灌注固定液的配制（0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.4，含 2% wt/vol 多聚甲醛（PFA）和 0.5% vol/vol 戊二醛（GA））
注意：固定液需在使用当天配制，且存放时间不得超过3小时。若时间不足，可提前一天配制0.1 M磷酸盐缓冲液中的2% PFA，于4 °C保存，并在灌流前临时加入新鲜的GA。
<ol>
	<li>取 400 mL 无菌双蒸水（ddH2O），使用搅拌加热板加热至 60 °C。然后加入 20 g 多聚甲醛（PFA），逐滴加入 1 M NaOH，直至 PFA 完全溶解，随后使溶液冷却。</li>
	<li>加入 500 mL 0.2 M 磷酸缓冲液（PB，pH 7.4）。</li>
	<li>过滤溶液以去除任何沉淀物，并将其冷却至 4 °C。</li>
	<li>在灌注前立即向溶液中加入 20 mL 25% 戊二醛（GA），然后用 ddH2O 定容至 1 L。</li>
</ol>
2. SBEM用灌注后固定液的制备（0.1 M磷酸盐缓冲液中含2% 质量/体积PFA和2.5% 体积/体积GA，pH 7.4）
<ol>
	<li>取50 mL灌注固定液（0.1 M磷酸缓冲液中含2% PFA和0.5% GA）。</li>
	<li>加入5 mL 25% GA。</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色用灌流后固定液的制备（磷酸盐缓冲液（PBS）中含4% PFA）
<ol>
	<li>根据制造商说明，将1× PBS（pH 7.4）的片剂溶解于纯化去离子水（H2O）中。</li>
	<li>使用搅拌加热板将溶液加热至60 °C，并加入40 g PFA。</li>
	<li>逐滴加入1 M NaOH，直至PFA完全溶解，然后让混合物冷却。</li>
	<li>用1 M HCl将溶液pH调节至7.5，再用H2O定容至1 L。</li>
	<li>过滤溶液以去除任何沉淀物。</li>
</ol>
4. 动物经心脏灌注
注意：所有含PFA和GA的废液必须根据当地法规收集并储存处理。麻醉和灌注操作应遵循当地法规。本方案中使用了成年3月龄及20±1月龄的雌性Thy1-GFP(M)小鼠（Thy1-GFP +/-）12，其在部分谷氨酸能神经元中表达绿色荧光蛋白（GFP），但也可使用其他品系。动物在实验生物学奈恩基研究所动物房中以C57BL/6J为背景进行杂合子繁育。
<ol>
	<li>灌注前，通过腹腔注射（27号针头）给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪混合物进行麻醉（氯胺酮剂量最高为90 mg/kg体重，赛拉嗪剂量为10 mg/kg体重）。
	<ol>
		<li>通过检测疼痛刺激（捏压）反应和角膜反射（眨眼）来评估麻醉深度是否足够。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>20分钟后，通过腹腔注射（27号针头）给予戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）。</li>
	<li>按照Gage等人13描述的灌注手术方案对小鼠进行灌注（见第4点；图5-6）。使用灌注泵，先以0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）灌注3分钟（30 mL），随后用含2% PFA和0.5% GA的0.1 M PB（pH 7.4）继续灌注6分钟（80 mL）。
	<ol>
		<li>小心地从颅骨中取出脑组织并将其分为两半（参见Gage等，201213中的图9-10）。将其中一半放入含有固定液的样品瓶中用于SBEM分析，另一半放入含4% PFA/PBS的样品瓶中用于免疫荧光染色。</li>
		<li>将脑半球在4 °C下固定过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于电子显微镜的脑切片制备
<ol>
	<li>选择振动切片机的设置（刀片行进速度：0.075 mm/s，切割频率：80 Hz）。</li>
	<li>将切片室放入支架中，将其固定到振动切片机上，并在周围放置冰块。然后将剃刀刀片装入振动切片机的刀片夹中。</li>
	<li>使用勺子或类似工具，将冷却的脑组织（背侧朝上）放置在坚固的切割表面（例如玻璃培养皿盖）上。为制备海马体的冠状切片，使用剃刀刀片或手术刀在大脑半球与小脑之间进行垂直切割，从而去除小脑。嗅球也可一并去除。</li>
	<li>在振动切片机的干燥平台上涂抹氰基丙烯酸酯胶水。</li>
	<li>用镊子夹取脑组织，并在滤纸上小心地将其表面擦干。</li>
	<li>将脑半球用胶水粘附在靠近切割刀片的平台上，前端朝上。将平台固定到支架后，立即注入冰冻的0.1 M磷酸缓冲液（PB），pH 7.4。如果垂直切割操作正确，脑半球将直立固定，形成90°角，从而可进行包含海马体的对称冠状切片。确保脑组织完全浸没在PB中。</li>
	<li>将振动切片机刀片置于脑半球前方，并将其下降至脑半球的冠状面。再向尾侧方向降低400 µm，开始切片。持续切片，直至前两片完全与组织块分离。</li>
	<li>收回刀片，再向尾侧降低100 µm，然后再次切片。</li>
	<li>当海马体变得可见时（可参考小鼠脑图谱Paxinos和Franklin，200414），使用小号画笔或扩口的塑料巴斯德吸管收集切片。</li>
	<li>将切片转移至盛有冷0.1 M PB（pH 7.4）的12孔板中。</li>
	<li>在盛有0.1 M PB（pH 7.4）的玻璃培养皿中，使用剃刀刀片或手术刀解剖海马体，并将其放入含有相同磷酸缓冲液的玻璃小瓶中。 
	&#8203;注意：如需长期保存切片，可在0.1 M PB中添加0.05%叠氮化钠（NaN3）。</li>
</ol>
6. 用于免疫染色的脑组织样本制备
<ol>
	<li>在通风橱中用 4% PFA/PBS 溶液固定过夜后，将脑组织放入冷冻保护液（含 0.05% NaN3 的 30% 蔗糖 PBS 溶液）中，于 4 °C 保存 2 天（直至组织沉底）。</li>
	<li>配制防冻溶液（15% 蔗糖/30% 乙二醇/0.05% NaN3/PBS）。</li>
	<li>将冷冻切片机柜内温度设定为 -19 °C，并确保在继续操作前已达到该温度。切片过程中，确保柜内温度维持在 -18 °C 至 -20 °C 之间。</li>
	<li>使用勺子或类似工具，将冷却后的脑组织（背侧朝上）放置于坚固的切割表面（例如玻璃培养皿盖）。为制备海马体的冠状切片，使用剃刀刀片或手术刀在大脑半球与小脑之间进行垂直切割，从而去除小脑。</li>
	<li>选取一个预冷的样品托盘，在冷冻架上用冷冻介质覆盖，并用镊子将脑半球固定在托盘上，使前端朝上，等待样品完全冻结。将样品托盘插入样品头中。</li>
	<li>在冷冻室内的刀片架上安装刀片，并切出 40 µm 厚的切片。</li>
	<li>用小号画笔将切片转移至盛有冷防冻溶液的 96 孔板中，并轻轻展开组织片（每次切片后收集一片，以防止其在切片室内丢失）。 
	&#8203;注意：脑组织或切片可在防冻溶液中于 -20 °C 长期保存。</li>
</ol>
7. 脑切片的免疫染色
注意：所有染色步骤均在24孔板中，于平台摇床上进行。
<ol>
	<li>用 PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。</li>
	<li>将切片置于 300 µL 封闭液（5% 正常驴血清（NDS）/0.3% Triton X-100）中，在旋转摇床上轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>将切片与抗 PSD-95 一抗在 5% NDS/0.3% Triton X-100/PBS 中稀释（1:500，每孔 300 µL），于 4 °C 过夜孵育。一抗的终浓度为 2 µg/mL。</li>
	<li>用 0.3% Triton X-100/PBS 在室温（RT）下清洗切片三次，每次 6 分钟。</li>
	<li>将切片与二抗在 300 µL 0.3% Triton X-100/PBS 中稀释（1:500），孵育 90 分钟。二抗的终浓度为 4 µg/mL。</li>
	<li>用 PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。</li>
	<li>使用封片剂将切片封固于载玻片上，然后加盖盖玻片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜观察样本（63 × 油镜，NA 1.4，像素尺寸 0.13 µm × 0.13 µm）。 
	&#8203;注意：长期保存时，请将样本置于 4 °C，避免光照。</li>
</ol>
8. SBEM 样本制备
警告：由于所用试剂具有危险性，以下所有操作必须在实验室通风橱中进行。使用这些化学品前，应仔细阅读制造商提供的材料安全数据表，并咨询安全负责人了解当地相关规定，以确保安全操作和废液处理。
<ol>
	<li>样品染色 
	注意：切片洗涤和室温孵育应在温和振荡条件下进行（例如，使用平台摇床）。使用经高压灭菌的脱气水。
	<ol>
		<li>用冰冷的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤切片5次，每次3分钟。</li>
		<li>将4%的水溶液四氧化锇与3%的亚铁氰化钾溶液按1:1体积比混合。最终混合物将变为棕色。将样品浸入该混合液中，置于冰上，并从此时起注意避光。轻轻振荡孵育1小时。</li>
		<li>同时配制硫代羰基肼（TCH）溶液。将10 mL双蒸水与2O (ddH₂O)2O）和 0.1 g 的 TCH，放入设定温度的烘箱中 60 &#176;C 1小时。期间需不时摇动溶液（例如每10分钟一次）。完成后冷却至室温。</li>
		<li>用ddH₂O冲洗切片2O 五次，每次 3 分钟。</li>
		<li>使用滤器过滤 TCH 溶液 0.22 &#181;m 使用注射器滤器过滤溶液，并将样本浸入滤过的溶液中。切片将变为黑色，在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>用ddH₂O冲洗样品2O 五次，每次 3 分钟。</li>
		<li>用2%的OsO₄水溶液孵育样品4 室温下孵育30分钟。</li>
		<li>用ddH₂O冲洗样品2O 五次，每次 3 分钟。</li>
		<li>将样品置于过滤后的1%醋酸铀水溶液中，并在 4 &#176;C 过夜。使用 0.22 &#181;m 用于过滤的注射器滤器</li>
		<li>将0.4 g L-天冬氨酸与80 mL ddH₂O混合，配制L-天冬氨酸溶液。2O，调节pH至3.8以促进溶解，然后加水定容至100 mL。</li>
		<li>次日，开始使用Walton's铅天冬氨酸15 制备。将0.066 g硝酸铅与10 mL预热至 60 &#176;C 并调节pH至5.5（在 60 &#176;C) 用 1 M NaOH。用天冬氨酸铅封口小瓶并静置 60 &#176;C 在水浴中放置30分钟。溶液应保持澄清。若溶液变浑浊，则必须弃用并重新配制。</li>
		<li>在此期间，用脱气的 ddH₂O 清洗样品2O 五次，每次 3 分钟。然后将它们置于设定温度的烘箱中 60 &#176;C 30分钟。</li>
		<li>将样品浸入新配制的铅天冬氨酸溶液中，并在设定温度的烘箱中孵育 60 &#176;C 20分钟。</li>
		<li>用脱气的ddH₂O洗涤样品2O 五次，每次 3 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水与树脂包埋
	<ol>
		<li>制备环氧树脂。称取组分（33.3 g 组分 A/M、33.3 g 组分 B 和 1 g 组分 D），充分混合树脂（例如，在15 mL离心管中置于旋转摇床上振荡），至少混合30分钟，然后加入16滴加速剂DMP 30。再次搅拌10分钟。 
		注意：在通风橱下称量试剂。此配比的组分可制备约 60 mL 树脂，足以用于 15 个装有样品的西林瓶。可按需减少配制量，或将剩余树脂储存于注射器中 4 &#176;C 并于次日使用。请记得密封注射器的尖端。</li>
		<li>准备含有梯度浓度乙醇的样品瓶（30%、50%、70%、90%、100%、100% 乙醇溶于水，以及经分子筛干燥的100%乙醇）。</li>
		<li>将树脂与100%乙醇按1:1比例混合，配制50%树脂溶液，充分混匀。</li>
		<li>将样品依次在30%至100%无水乙醇（经分子筛干燥）的各级浓度乙醇中各脱水5分钟。注意，样品切勿完全干燥。</li>
		<li>先将样品浸入50%树脂中30分钟，随后浸入100%树脂中1小时，最后再次浸入100%树脂中过夜。所有浸透步骤均需在持续缓慢振荡条件下进行。</li>
		<li>次日，将样品置于新鲜的100%树脂中1小时，然后将其包埋于氟聚合物包埋片之间。用乙醇对包埋片进行脱脂处理，并将样品平置于两层包埋片之间，以两片载玻片作为支撑进行平整包埋。注意避免树脂中或样品附近产生气泡。</li>
		<li>在烤箱中固化样品 70 &#176;C 至少 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>修块与安装
	<ol>
		<li>分离包埋片，用剃刀切下一小块包埋样品（约1 mm × 1 mm），转移至Parafilm上。此举可最大限度减少因静电导致样品丢失的风险。</li>
		<li>取一支经乙醇脱脂处理的铝针。充分混合导电环氧树脂，并取少量用于将样品固定在铝针上。将导电环氧树脂在 70 &#176;C 10分钟。</li>
		<li>用金刚石刀修切样本块的每一侧，然后修平块面，直至暴露出组织。 
		注意：在此步骤中，通过收集部分切片并进行甲苯胺蓝染色，确认目标区域的存在16 或在电子显微镜下检查。</li>
		<li>尽可能减小样品尺寸。然后使用导电漆将样品接地至销钉并进行固化（室温下放置24小时或在烘箱中 65 &#176;C 40分钟。</li>
		<li>为尽量减少电荷积累伪影，使用一层薄金或金/钯对样本进行溅射镀膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. SBEM 成像
<ol>
	<li>将带有样品的样品针放入连续切片扫描电镜的样品腔中。将样品与切刀对齐。关闭样品腔并设置参数。</li>
	<li>以所需的放大倍数、像素尺寸、切片厚度、加速电压（EHT）、光阑、压力等条件采集图像序列。 
	&#8203;注意：参数取决于样品和实验目的。示例性的初始成像设置见材料表。</li>
</ol>
10. 三维重建
注意：以下步骤中我们使用开源软件，例如 FijiJ17（ImageJ 1.49b 版本）、Microscopy Image Browser (MIB)18 和 Reconstruct19，但也可采用其他多种软件。
<ol>
	<li>将数字显微图（dm）文件转换为TIFF格式。首先导入图像序列（在FijiJ中： 文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列 &#62; 选择8位格式）然后另存为TIFF格式（在FijiJ中： 文件 &#62; 另存为 &#62; 图像序列 &#62; 选择 Tiff).</li>
	<li>调整图像堆栈的亮度和对比度（在 FijiJ 中）： 图像 &#62; 调整 &#62; 亮度/对比度）并在必要时进行去噪（使用FijJ的DenoisEM插件）20 : 插件 &#62; DenoiseEM &#62; 去噪).</li>
	<li>对齐图像堆栈&#160;（在 FijiJ： 插件 &#62; StagReg 或 MIB：数据集 &#62; 对齐工具).</li>
	<li>分割树突棘与突触&#160;（在 MIB 或 Reconstruct 软件中，可获取全面的教程（参见 材料表 详见正文。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Deerinck 于 2010 年描述的 NCMIR 基本方法有多种变体10。其基本原理保持不变，但根据所研究材料的类型，会进行一些细微调整。先前已有报道指出，可用于 SBEM 样品包埋的树脂种类多样，例如，对于植物样品，由于 Spurr 树脂黏度较低，更易穿透细胞壁，因此是首选树脂22,23。此外，固定过程中可使用多种缓冲液（如卡考基酸盐缓冲液、HEPES 或磷酸盐缓冲液），以及不同浓度的戊二醛（2–3%）和多聚甲醛（2–4%）23,24,25,26,27,28。使用鞣酸可增强富含...

中枢神经系统中大多数兴奋性突触位于树突棘上——树突棘是神经元膜上的微小突起。这些突起形成了隔离的生化区室，调控细胞内信号转导。树突棘和突触的结构可塑性与突触效能的功能性变化密切相关，而突触效能的变化是学习和记忆等重要过程的基础1,2。需要注意的是，只有电子显微镜（EM）技术能够确定树突棘是否具有来自轴突的突触前输入。研究突触后密度（PSD）的形态（代表突触的突触后部分）、树突棘的尺寸、轴突终扣的大小与形状等超微结构细节，也需要电子显微镜的高分辨率。此外，利用电子显微镜还可以观察突触及其周围环境的结构。
得益于成像和计算技术的进步，现已能够重建完整的神经环路。体积电子显微镜技术，如连续切片透射电子显微镜（ssTEM）、连续块面扫描电子显微镜（SBEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM），常被用于神经元环路的重建3。
在我们的研究中，SBEM 方法已成功用于研究小鼠海马组织样本及脑片培养样本中树突棘和突触后密度（PSDs）的结构可塑性4,5。SBEM 技术基于在扫描电镜腔室内安装微型超薄切片机6,7,8,9。首先对样品块的表面进行成像，随后由超薄切片机按设定深度切去一层，暴露出新的块面，再对该新块面进行成像，如此循环往复8。因此，仅保留块面的图像，而被切下的薄片则作为碎片丢失。正因如此，SBEM 被称为一种破坏性技术，意味着无法对同一位置进行重复成像。然而，这种在块面上进行的破坏性方法的优势在于，不会出现切片扭曲或丢失的问题，而这些问题可能严重影响数据质量和数据分析结果3。此外，SBEM 能够在高分辨率下实现相对较大的视场成像（> 0.5 mm × 0.5 mm）3。
为了使用扫描电镜背散射电子成像技术（SBEM），由于采用背散射电子探测器进行图像采集，样品必须按照一种专用的、具有高对比度的制备方案进行处理。本文展示了如何依据Deerinck10（国家显微镜与成像研究中心（NCMIR）方法）开发的流程，采用20世纪80年代建立的还原锇-硫碳酰肼-锇（rOTO）染色法进行样品制备8,11。此外，我们还引入了一种两步固定方法，通过温和的灌注固定，使得同一脑组织既可用于光学显微镜下的免疫荧光研究，也可用于SBEM分析。
在该方案中，小鼠脑组织首先用温和的固定剂进行初步固定，然后切成两半，其中一个半脑进行后固定并用于免疫荧光（IF）制备，另一个半脑则用于电镜（EM）研究（图1）。
<img alt="用于固定、后固定、振动切片、扫描电镜成像和三维重建的小鼠脑分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1。用于SBEM分析的树突棘样品制备流程示意图。 小鼠经处死后，用温和的初固定液进行灌流固定。将脑组织切成两半，其中一侧半脑使用专用于免疫荧光（IF）的固定液进行后固定，经冷冻保护后，用恒冷箱切片机切片，并用于免疫荧光研究；另一侧半脑则使用电镜专用固定液进行后固定，用振动切片机切片后制备用于电镜研究。用于SBEM研究的脑片经染色增强反差后，平埋于树脂中，随后将海马CA1区固定在样品钉上，并使用SBEM进行成像（图 1）。协议中以黄色框标示的部分在视频中进行了展示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;麻醉剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪混合物（Ketamina/Sedazin）</td><td>Biowet Pulawy，普瓦维，波兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠（Morbital）</td><td>Biowet Pulawy，普瓦维，波兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;固定剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛（GA）</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>G5882</td><td>1级，25% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，专为用作电子显微镜固定剂而特别纯化</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>POCH，格利维采，波兰</td><td>575283115</td><td>纯度 p.a.</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>441244</td><td>颗粒状，95%</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>P4417-50TAB</td><td>片剂</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>S5881</td><td>试剂级， &lt;图像 替代文本=&quot;方程&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png&quot;/&gt;98%，颗粒（无水）</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;灌注：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大型钝头/钝头弯剪（约14.5 cm）</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺（双头 2&quot; 一端扁平，一端圆形，另一端锥形收窄至1/8&quot;)</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>针尖，15号，钝头（灌注针）</td><td>KD Medical GmbH 医院产品，柏林，德国</td><td>KD-FINE 900413</td><td>1.80 x 40 mm</td></tr><tr><td>精细（Graefe）镊子一对</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特市</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>灌流泵</td><td>铅液</td><td>BQ80S</td><td></td></tr><tr><td>塑料小瓶</td><td>Profilab，波兰华沙</td><td>534.02</td><td>带蓝色瓶盖的塑料离心管（用于组织储存），20 ml，31 x 48 mm</td></tr><tr><td>直头虹膜剪（约9 cm）</td><td>Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于电镜的脑切片制备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>NEST，新泽西州拉威，美国</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Fenedur，蒙得维的亚，乌拉圭</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司</td><td>72632</td><td>20 ml 闪烁瓶，一包100个</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR，Radnor，PA，美国</td><td>612-4545</td><td>LDPE，一次性，7.5 ml</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Wilkinson Sword，伦敦，英国</td><td></td><td>经典双刃安全剃须刀片</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Swann-Morton，谢菲尔德，英国</td><td>20</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>徕卡显微系统公司，奥地利维也纳</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于免疫荧光的脑切片制备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>NEST，新泽西州拉威，美国</td><td>701101</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>徕卡显微系统公司，奥地利维也纳</td><td>Leica CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Bioshop，Burlington，加拿大</td><td>ETH001</td><td></td></tr><tr><td>低剖面一次性刀片 819</td><td>Leica Biosystems Inc., USA</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Swann-Morton，谢菲尔德，英国</td><td>20</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠 (NaN3)</td><td>POCH，格利维采，波兰</td><td>792770426</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>POCH，格利维采，波兰</td><td>772090110</td><td></td></tr><tr><td>用于冷冻切片的组织冷冻介质，OCT-Compound</td><td>Leica Biosystems，瑞士</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫染色：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>NEST，新泽西州拉威，美国</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>抗突触后密度蛋白95抗体</td><td>默克-密理博，美国马萨诸塞州伯灵顿</td><td>MAB1598</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss, G&amp;ouml;蒂宾根，德国</td><td></td><td>蔡司转盘共聚焦显微镜（63 &amp;times; 油镜，数值孔径 1.4，像素大小 0.13 &amp;micro;m &amp;times; 0.13 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>封面幻灯片</td><td>Menzel Glaser，德国不伦瑞克</td><td>B-1231</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Fluoromount-G封片剂</td><td>Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>AGAA00008</td><td>SuperFrost</td></tr><tr><td>正常驴血清（NDS）</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>JWElectronic，华沙，波兰</td><td>KL-942</td><td></td></tr><tr><td>TritonT X-100 试剂级</td><td>Bioshop，Burlington，加拿大</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;电子显微镜样品制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>六水合六氰合铁(II)酸钾</td><td>POCH，格利维采，波兰</td><td>746980113</td><td></td></tr><tr><td>Aclar 33C 薄膜</td><td>美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司</td><td>50425</td><td>氟聚合物薄膜包埋片</td></tr><tr><td>DMP-30, 2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>T58203</td><td>环氧包埋介质加速剂</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 单组分 A，M</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>44611</td><td>Durcupan ACM 单组分 A，M 型环氧树脂</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 单组分 B</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>44612</td><td>Durcupan ACM 单组分 B，硬化剂 964</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 单组分 D</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>44614</td><td>Durcupan ACM 单组分 D，增塑剂</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>POCH，格利维采，波兰</td><td>64-17-5</td><td>乙醇，纯度99.8%，P.A.-BASIC</td></tr><tr><td>Genlab 实验室烘箱</td><td>Wolflabs，英国约克</td><td>Mino/18/SS</td><td>Oven Genlab MINO/18/SS 18升容积，无风扇循环，无数字显示屏，标准温度梯度，标准恢复速率，无定时器 250&amp;deg;C 最高温度，240V 电源供应</td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>A-9256</td><td>试剂级， &lt;图像替代文本&quot;方程&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png&quot;/&gt;98%（HPLC）</td></tr><tr><td>硝酸铅</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>467790</td><td>&lt;图像 替代文本=&quot;方程&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png&quot;/&gt;99.95% 痕量金属基准</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>75632</td><td>用于电子显微镜，4% 在 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Elmetron，扎布热，波兰</td><td>CP-5-5</td><td></td></tr><tr><td>旋转器</td><td>BioSan, J&amp;oacute;zef&amp;oacute;波兰</td><td>Multi Bio RS-24</td><td>rotator Multi Bio RS-24</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>S5881</td><td>试剂级， &lt;图像 替代文本=&quot;方程&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png&quot;/&gt;98%，颗粒（无水）</td></tr><tr><td>向日葵迷你摇床</td><td>Shepreth，英国 Grant 生物</td><td>PD-3D</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Millipore，Burlington，MA，USA</td><td>SLGP033NB</td><td>0,22 &amp;micro;m 孔径</td></tr><tr><td>硫代碳酰肼</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>88535</td><td>电子显微镜用，纯度 p.a. &lt;图像 替代文本=&quot;方程&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png&quot;/&gt;99.0% (N)</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Serva，德国海德堡</td><td>77870</td><td>醋酸铀酰&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，科研级</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>WSL，斯维埃托赫洛维采，波兰</td><td>LWT</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于SBEM的样本安装&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔培养板</td><td>VWR，Radnor，PA，USA</td><td>734-2782</td><td>96孔板，圆底，未处理</td></tr><tr><td>AM Gatan 3View 样品台操作镊子</td><td>微米到纳米，荷兰哈勒姆&lt;br/&gt; 荷兰</td><td>50-001521</td><td></td></tr><tr><td>双目</td><td>OPTA-TECH，波兰华沙</td><td>X2000</td><td></td></tr><tr><td>导电胶</td><td>美国佐治亚州 Chemtronics</td><td>CW2400</td><td>导电环氧树脂</td></tr><tr><td>Gatan 3View 样品针 stubs</td><td>微米到纳米，荷兰哈勒姆&lt;br/&gt; 荷兰</td><td>10-006003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国</td><td>P7793</td><td>卷尺寸 20&amp;nbsp;英寸 &amp;times; 50&amp;nbsp;ft</td></tr><tr><td>Pelco 导电银漆</td><td>Ted Pella，美国加利福尼亚州雷丁</td><td>16062-15</td><td>PELCO&amp;reg;&amp;nbsp;导电银漆，15g</td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司</td><td>72000</td><td>不锈钢 &quot;聚四氟乙烯&quot; 镀膜。PERSONNA 品牌 .004&quot; 厚型，单片独立包装，每盒250片。</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>蔡司，德国奥伯科亨</td><td></td><td>Sigma VP配Gatan 3View2腔室，加速电压2.5 kV，可变压力5 Pa，光阑 20 &amp;micro;m，停留时间 6 &amp;micro;s切片厚度 60 nm，放大倍数 15 000 x，图像分辨率 2048 x 2048 像素，像素大小 7.3 nm</td></tr><tr><td>修剪 90&amp;deg; 金刚石刀片</td><td>Diatome Ltd.，瑞士尼道</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>徕卡显微系统公司，奥地利维也纳</td><td>Leica ultracutR</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>网页</td><td></td><td>教程</td></tr><tr><td>FijiJ</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微图像浏览器</td><td>http://mib.helsinki.fi/</td><td></td><td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td></tr><tr><td>重建</td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td><td></td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td></tr><tr><td>动物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>成年3个月大及&amp;nbsp;20&amp;plusmn;1&amp;nbsp;月龄&amp;nbsp;雌性&amp;nbsp;Thy1-GFP(M) 小鼠（Thy1-GFP +/-）（Feng 等，2000），其在部分分布的谷氨酸能神经元中表达 GFP。动物在实验生物学奈恩基研究所动物房内以杂合子形式与 C57BL/6J 背景杂交繁殖。</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（sbem）

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

三维电子显微镜（3D EM）能够以纳米级分辨率分析树突棘的形态学参数。此外，某些树突棘的特征，例如棘的体积和突触后密度（PSD）（代表突触的突触后部分）、突触前终末的存在、滑面内质网或PSD的非典型形态（例如多神经支配的树突棘），只能通过3D EM进行观察。通过采用连续块面扫描电子显微镜（SBEM），相比传统的连续切片方法，可以更简便且更可重复地获得3D EM数据。本文展示了如何制备小鼠海马组织样本用于SBEM分析，以及该方案如何与树突棘的免疫荧光研究相结合。温和的固定灌注方法使得我们可以在脑组织的一半进行光学显微镜下的免疫荧光研究，而另一半则用于SBEM制样。该方法减少了实验所需的动物数量。

采用上述方法可获得高对比度、高分辨率的小鼠脑组织图像。SBEM 技术提供的大视野有助于精确选择感兴趣区域。获取海马 CA1 区域的大范围图像，用于测量辐射层（stratum radiatum，SR）的长度（图 2A），并精确定位成像中心（图 2B）。随后采集图像序列，并对感兴趣的目标结构进行分割，包括树突、树突棘以及突触的突触后密度等（图 2C，D）。
采用SBEM技术可以分析相对大体积的组织，并识别罕见事件，例如多神经支配的树突棘（图2E）——这是一种特殊类型的突触，其特征是多个突触前终末共同接触同一个突触后树突棘21。
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连续块面扫描电子显微镜（SBEM）用于对小鼠海马区的树突棘进行成像和分析。

用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）

三维电子显微镜（3D EM）能够以纳米级分辨率分析树突棘的形态学参数。此外，某些树突棘特征，例如树突棘体积和突触后密度（PSD，代表突触的突触后部分）、突触前终末的存在、滑面内质网或非典型形式的PSD（如多突触支配的树突棘），只能通过3D EM进行观察。通过采用连续块面扫描电子显微镜（SBEM）技术，相较于传统的连续切片方法，可更简便且更可重复地获取3D EM数据。本文展示了如何制备小鼠海马组织样本用于SBEM分析，并介绍了该方案如何与树突棘的免疫荧光研究相结合。采用温和固定灌注方法，可在同一动物的一半脑组织上进行光学显微镜下的免疫荧光研究，而另一半脑组织则用于SBEM样本制备。该策略可减少实验所需的动物数量。

大脑中的每个神经元通过大约 7,000 个突触与其他神经细胞相连。哺乳动物大脑中的这些突触主要位于细胞膜的小突起上，这些小突起称为树突棘。突触和树突棘的可塑性与学习和记忆等重要的脑功能密切相关。需要注意的是，只有电子显微镜才能全面确定树突棘是否具有突触后输入。目前已有多种树突棘成像技术，但连续块面扫描电子显微镜能够以高分辨率对大体积组织进行成像，具有独特优势。基于连续切块的扫描电子显微镜技术需要特殊的样品制备方案，其中包括使用重金属进行强对比染色。我在灌流过程中采用的初始固定方法使我们能够对同一脑组织进行光学显微镜和电子显微镜的联合分析。小鼠经牺牲后，使用温和的初固定剂进行灌流固定。将脑组织切成两半，其中一半使用专用于免疫荧光的固定剂进行后固定，经冷冻保护处理后，用恒冷箱切片机切片，并用于免疫荧光研究；另一半则使用电子显微镜固定剂进行后固定，用振动切片机切片后，制备用于电子显微镜研究。用于连续块面扫描电子显微镜研究的脑片经染色增强对比度后，平埋于树脂中，随后将海马CA1区固定于样品钉上，并用连续块面扫描电子显微镜进行成像。用黄色框标出的步骤在视频中有所展示。取已固定并切成100微米切片的组织，用冷磷酸盐缓冲液洗涤五次，每次三分钟。配制4%四氧化锇与3%铁氰化钾的等体积混合液。最终产物将变为棕色。将样品浸入此混合液中，然后将样品置于冰上。从这一步开始，需要避光保护。在温和振荡条件下孵育一小时。同时，配制TCH溶液。将10毫升双蒸水与0.1克TCH混合。置于60 °C的烘箱中加热1小时。期间需不时摇动溶液。准备好后，将其冷却至室温。随后用双蒸水洗涤样品，每次三分钟，共洗涤五次，然后将样品浸入过滤后的TCH溶液中。切片将变为黑色。室温下孵育20分钟。用双蒸水洗涤样品，每次3分钟，共洗涤5次，然后在室温下用2%四氧化锇孵育30分钟。再次用双蒸水洗涤样品，每次3分钟，共洗涤5次，随后将样品置于过滤的1%戊酸戊酯中。在4摄氏度下孵育过夜。次日，开始制备D-天冬氨酸。将硝酸铅与预热至60摄氏度的天冬氨酸溶液混合。将混合物置于60摄氏度的水浴中，并用1摩尔氢氧化钠将pH值调节至5.5。用天冬氨酸铅封住小瓶，并在60摄氏度下放置30分钟。溶液应呈澄清状态。如果溶液变浑浊，则必须弃用，并重新配制。在此期间，用双蒸馏气体水将样品清洗五次，每次三分钟，并将样品置于60摄氏度的烘箱中保持30分钟。将样品浸入新配制的铅天冬氨酸盐溶液中，并在设定为60摄氏度的烘箱中孵育20分钟。准备环氧树脂。称量各组分并充分混合树脂至少30分钟，然后加入促进剂DMP 30。用梯度稀释的乙醇制备病毒。然后将样品从烘箱中取出，用双蒸水清洗五次，每次三分钟。在此期间，将树脂与100%乙醇按1:1比例混合，配制成50%树脂，充分混匀。随后，将样品在每种浓度的乙醇中各脱水五分钟。注意样品切勿完全干燥。先用50%树脂浸透样品30分钟，接着用100%树脂浸透一小时，最后再用新鲜的100%树脂浸透过夜。第二天，将样品放入新鲜的100%树脂中孵育一小时，然后将其包埋在氟聚合物包埋片之间。用乙醇脱脂后准备若干包埋片，并将用于支撑的载玻片放置一旁。将一片包埋片置于载玻片上，滴加一滴树脂，然后使用木棒小心地转移样品。用第二块盖上。尽量避免产生气泡。由于组织非常脆弱，请操作轻柔。将另一块载玻片小心地放置在包埋片上，于70摄氏度的烘箱中固化样品至少48小时。分离各层后，用剃刀片切下一小块包埋好的样品，并将其转移至石蜡中。这将最大限度地降低因静电而导致样本丢失的风险。取一根经乙醇脱脂的铝针，充分混合导电环氧树脂，并用少量树脂将样本固定在针上。将导电环氧树脂在 70 摄氏度下固化 10 分钟。使用金刚石刀修切样品块的每一侧，然后抛光块面，直至暴露组织。使用导电漆将样品接地至针脚，并进行固化。为尽量减少电荷积累，样品还应溅镀一层金或金钯的薄层。将带有样品的样品钉放入连续块面扫描电子显微镜的腔室中。将样品与切刀对齐，然后关闭腔室并设置参数。采集图像堆栈。使用所述方法，获得了小鼠脑组织的图像。选取了海马区的一个大图像，并将成像区域设置在辐射层的中心。获取了一组图像，并对树突棘和突触等感兴趣的对象进行了分割。组织形态学质量良好，细胞膜和突触小泡清晰可见，线粒体保存完好。PSD 95 抗体的免疫荧光研究表明，温和的初次固定与传统的 4% PFA 固定可获得相当的结果。本方案可利用基于连续切块的扫描电子显微镜技术获取脑组织图像，实现高质量的组织形态保存，并使12层可见膜结构清晰呈现，有助于准确进行分割与三维重建。通过初步固定处理，可对同一脑组织样本同时开展PSD-95免疫荧光分析与树突棘的电子显微镜成像。本文中我们使用PSE 9、500萌发。然而，另一个也可以使用。

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用于登德里脊柱研究的串行块面扫描电子显微镜 （SBEM）

取一段显示神经元轴突和树突的小鼠大脑皮层组织切片。树突具有突起，称为树突棘，可与轴突形成突触。将组织与四氧化锇-铁氰化钾溶液孵育，该溶液可结合脂质，随后再次应用四氧化锇，以增强成像的结构对比度。使用可结合大分子并增强对比度的重金属化合物进行染色。采用浓度递增的酒精进行脱水，以便进行树脂包埋。将组织包埋于树脂中，固定在样品 holder...

聚焦离子束扫描电子显微镜用于突触连接神经元的三维重建

来源： Pekarek, B. T., et. al., 通过CLARITY组织透明化技术对完整神经元树突进行成像与定量分析。J. Vis. Exp.

完整小鼠脑组织中树突分支及树突棘形态的共聚焦显微成像

来源： Mukherjee, K., et. al. 利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体。 J. Vis. Exp.

使用连续块面扫描电子显微镜对神经元线粒体进行成像

本文介绍了一种用于成像海马神经元树突棘的工作方案 体外...

使用结构光照明显微镜成像大鼠原代海马神经元的树突棘

大规模二维电子显微镜（EM），即纳米解剖学，是指在组织范围内应用纳米级分辨率的电子显微镜技术。本文介绍了一种通用的纳米解剖学方法，用于研究健康状态下以及无创性脑损伤后的斑马鱼幼体脑组织。...

大规模扫描透射电子显微镜（纳米解剖学）对健康与损伤斑马鱼脑组织的成像

对哺乳动物脑组织中线粒体的可视化与分析是一项具有挑战性的任务。本文介绍了如何利用连续块面扫描电镜（SBFSEM）进行三维（3D）重建分析，以深入了解这一关键能量生成细胞器的形态学和体积特征。...

利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体

本文介绍了一种高效结合连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜的技术方案，用于定位目标区域。该方法可在大视野范围内实现三维空间中稀有事件的高效搜索与精确定位。...

利用连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜进行的靶向研究

本方案概述了一种使用连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的常规方法，SBF-SEM是一种强大的三维成像技术。SBF-SEM的成功应用依赖于适当的固定和组织染色技术，以及对成像参数的仔细设置。本方案涵盖了该过程各个阶段的实用注意事项。...

生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（SBF-SEM）

树突棘是大多数兴奋性突触的突触后区室。在神经发育、衰老、学习过程以及许多神经和精神疾病中，树突棘形态会发生改变，这凸显了可靠分析树突棘的重要性。本方案描述了如何使用自动三维神经元重建软件，准确且可重复地量化树突棘形态。...

使用自动三维神经元重建软件进行树突棘定量分析

本方案描述了使用透射电子显微镜（TEM）定量分析小鼠桶状皮层中昼夜节律变化的方法，主要关注突触数量和树突棘形态的变化。...

透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术

了解连续块面扫描电子显微镜技术在小鼠海马体树突棘研究中的应用。该方法可实现高分辨率大体积组织成像，为解析突触可塑性与神经网络的连接机制提供重要支持。

用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）

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