高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化
2021年9月23日
利用高活性piggyBac转座酶的mRNA，成功实现了对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的种系转化。
本方案展示了利用基于piggyBac的转化系统生产转基因草地贪夜蛾的方法。我们希望这些方法不仅有助于提高草地贪夜蛾的转化效率，也能促进其他鳞翅目昆虫的转化。本文所述方法可高效实现鳞翅目害虫的种系转化。
本实验操作将由我实验室的博士后研究员Xien Chen博士演示。首先，将12只雄性蛹和12只雌性蛹放入一个盒子中。在盒内放置10%蔗糖溶液，用于成虫取食。
用纸巾盖住盒子。在羽化后的第二天，让成虫整夜暴露于强光下。在羽化后的第三天，将成虫转移至黑暗环境中。
在超过预定时间后的两小时内收集胚胎。将水滴加到置于冰上培养皿中新鲜卵子所在的纸巾片上。用细刷将卵子轻轻转移至载玻片，并逐一在载玻片上排列整齐。
显微注射前，将带有卵的载玻片置于冰上保持对齐。使用自动显微注射仪的补偿压力，将每微升含200纳克基于piggyBac的EGFP表达质粒、每微升含200纳克高活性piggyBac转座酶mRNA以及无菌蒸馏水的混合液注射入卵中。将注射后的卵置于27±1°C、相对湿度60%±10%的条件下培养至孵化。
将孵化的幼虫喂食人工饲料，并在幼虫发育至初凝乳期和星形期时，将每条幼虫转移至一个小杯中。收集蛹，并将约150只雌蛹和150只雄蛹放入饲养笼中。在笼内悬挂数张尺寸为30厘米×15厘米的纸巾，用于收集卵。
每天收集带有卵的纸巾，并将卵置于适宜条件下直至孵化。将初孵幼虫在4°C下放置5分钟以使其 immobilize（固定），然后转移至冰冷的培养皿中。在荧光体视显微镜下筛选已固定的初孵幼虫。
挑选EGFP阳性的新生幼虫，在27±1°C条件下饲养约两周，直至化蛹。通过1%琼脂糖凝胶检测体外合成的高活性piggyBac转座酶mRNA。PDS注射的胚胎未显示EGFP信号，而注射了EGFP表达质粒和高活性piggyBac转座酶mRNA的胚胎显示出EGFP荧光，表明piggyBac构建成功。
通过G0代成虫自交获得的G1代幼虫表现出强烈的EGFP信号。利用EGFP阳性幼虫的基因组DNA作为模板，成功扩增出含有启动子和EGFP片段的DNA片段。然而，当以野生型幼虫的基因组DNA作为模板时，未检测到相同片段。
用于显微注射的卵应尽可能新鲜，并且在显微注射前必须始终置于冰上，以减缓其发育进程。该技术为研究人员解答害虫功能基因组学中的科学问题，以及开发针对这一全球性害虫的遗传控制方法奠定了基础。
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概述
本研究展示了一种利用基于piggyBac的转化系统在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中实现成功种系转化的实验方案。该方法有望提高鳞翅目害虫中的转化效率，并促进这些生物的功能基因组学研究。
关键研究组成部分
研究领域
- 害虫昆虫中的基因工程
- 转化生物学技术
- 功能基因组学应用
背景
- 草地贪夜蛾是一种重要的农业害虫。
- piggyBac 转座子系统以其高效的基因递送能力而闻名。
- 提高种系转化效率对于害虫防控策略至关重要。
使用的方法
- 使用 piggyBac 质粒和 mRNA 对卵进行显微注射
- 以Spodoptera frugiperda作为生物模型
- 利用荧光显微镜筛选转基因幼虫
主要结果
- 转基因幼虫中EGFP的成功表达表明piggyBac系统具有功能活性。
- 通过基因组DNA扩增验证了EGFP的表达，从而区分转基因个体与野生型幼虫。
- 该转化技术在产生基因修饰害虫昆虫方面表现出高效性。
结论
- 本研究建立了草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）种系转化的可靠方法。
- 研究结果有助于推进农业害虫的遗传防控措施。
常见问题
行业重要性概述
在草地贪夜蛾等农业害虫中建立高效的种系转化技术，可为害虫防控研发流程中的靶点验证和作用机制去风险化提供功能基因组学支持。本方案通过提供一个可扩展的系统，用于在具有疾病相关性的昆虫模型中探究基因功能并评估表型结果，从而支持早期发现研究。成功的转基因操作有助于后续筛选及生物标志物的发现，推动遗传性害虫管理策略的发展。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够对害虫基因进行功能研究，以验证遗传控制策略的靶标。
- 操作价值：提供可重复的系统，用于创制转基因品系，实现对靶标的稳定评估。
- 预测价值：通过将基因破坏与害虫模型中的表型效应关联，支持基于机制的风险预判。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：构建荧光报告基因品系，用于高通量筛选基因扰动。
- 操作价值：实现基于PCR的标准化基因分型及TAIL-PCR，用于插入位点验证。
- 检测适用性：产生稳定的转基因品系，适用于化合物筛选和表型检测。
转化与临床前研究
- 转化连续性：将发现阶段的基因验证与基因调控机制的临床前评估相联系。
- 风险调整推进：在田间应用前促进对基因必要性和表型影响的评估。
- 生物标志物一致性：支持识别与易感性或抗性性状相关的遗传标记。
流程与工作流整合
该方法通过转基因技术实现靶点验证，借助表型筛选支持先导化合物的鉴定，并利用稳定的遗传模型为临床前决策提供依据，从而整合到早期发现的工作流程中。
- 发现生物学：通过在草地贪夜蛾中实现基因敲除或过表达，支持假设验证，以评估靶标的关联性。
- 筛选：建立标准化的转基因品系，用于可重复地筛选遗传或化学调控因子。
- 分析检测：提供定量PCR和荧光读数，以测量转基因的整合情况和表达水平。
- 转化研究：将基因功能发现与遗传害虫防控策略的临床前评估相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的转基因平台，适用于多种鳞翅目害虫，支持全产品线范围内的靶标验证。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在害虫模型中进行直接的基因操作，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：提供可扩展、可重复的转基因系统，配备标准化的显微注射和筛选流程。
- 战略价值：通过降低靶点必需性中的生物学不确定性，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于害虫模型中的体内表型验证，实现对靶点的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备昆虫胚胎学和显微注射技术方面的专业知识。
- 需要配备自动显微注射仪、荧光体视显微镜以及用于验证的PCR设备。
- 要求在胚胎采集、注射条件和转基因筛选等环节建立标准化操作流程，并在不同团队间统一执行。
- 需针对不同鳞翅目物种调整温度、湿度和饲料方案。
- 依赖于胚胎的质量与新鲜程度，显微注射效率受胚胎发育时相的影响。
