Name: 多活性猪猪Bac转座酶介导的秋粘虫，蜉蝣属果蝇蛆中的种系转化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 了解利用高活性piggyBac转座酶系统在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中建立种系转化的方法。该技术通过显微注射实现高效基因递送，为鳞翅目害虫功能基因组学研究及遗传防控策略开发提供重要工具。

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本研究得到美国国家科学基金会I/UCRC——节肢动物管理技术中心（资助号IIP-1821936）以及行业合作伙伴的支持，同时获得农业与食品研究计划竞争性资助项目（资助号2019-67013-29351）、美国农业部国家食品与农业研究所（资助号2019-67013-29351和2353057000）的资助。

1. 体外 hyPBase mRNA 的合成
注意：hyPBase 的完整编码序列已合成并插入 pTD1-Cas9 载体中（参见材料表），以构建 pTD1-hyPBase 质粒，该质粒包含一个 hyPBase 表达盒，其序列为 T7 启动子：多角体蛋白-5' 非翻译区：hyPBase：多角体蛋白-3' 非翻译区：poly(A)。pTD1-hyPBase 构建体的完整序列见补充材料。
<ol>
	<li>模板的制备 体外 合成
	<ol>
		<li>使用上游引物 5'-atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' 和下游引物 5'-tagaggccccaaggggttatgctag-3'，以高保真聚合酶和 pTD1-hyPBase 质粒为模板，进行 PCR 反应以扩增表达 hyPBase 的表达盒。 
		注意：PCR 反应（终体积 50 µL）包含 5.0 µL 10x 反应缓冲液、4.0 µL 10 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTP）、1.0 µL 质粒（50 µg/µL）、1.0 µL 高保真聚合酶、各 1.0 µL 的 10 µM 正向引物和反向引物，以及 33 µL 无核酸酶水。反应程序如下：95 °C 预变性 3 min，随后进行 35 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 10 s、60 °C 退火 15 s 和 68 °C 延伸 2 min。</li>
		<li>在新鲜的Tris-乙酸-乙二胺四乙酸（TAE）缓冲液中，于120 V电压下将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳30分钟，随后使用凝胶回收试剂盒纯化产物。 
		注意：不要使用PCR产物纯化试剂盒。即使痕量的pTD1-hyPBase质粒也会显著降低效率 体外 合成</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 使用商业试剂盒合成hyPBase mRNA
	<ol>
		<li>完全解冻冷冻试剂，将酶和2x NTP/CAP溶液置于冰上，解冻后的10x反应缓冲液置于室温。</li>
		<li>在室温下加入以下组分以组装反应体系：2x NTP/CAP 溶液：10 µL；10x 反应缓冲液：2 µL；模板 DNA：0.1–0.2 µg；酶混合物：2 µL；无核酸酶水补至 20 µL。</li>
		<li>轻轻吹打混合试剂，充分混匀后于 37 °C 孵育 2–4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氯化锂沉淀法回收合成的mRNA
	<ol>
		<li>加入30 µL氯化锂沉淀液，轻轻弹击离心管充分混匀，然后在-20 °C放置不少于30分钟。</li>
		<li>在4 °C下以最大速度离心15分钟，小心移除上清液。</li>
		<li>用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀物一次，重新离心，然后小心移除上清液。</li>
		<li>将沉淀在室温下干燥1-2分钟，然后用20-40 µL无核酸酶水重悬沉淀。</li>
		<li>将1 µL mRNA溶液与9 µL无核酸酶水混合稀释。取2 µL用于测定mRNA浓度，另取8 µL在新鲜TAE缓冲液中以100 V电压进行1%琼脂糖凝胶电泳40分钟，以检测mRNA质量。</li>
		<li>分装mRNA溶液，于-70 °C冷冻保存，可保存长达一年。 
		&#8203;注意：不要将 mRNA 沉淀完全干燥，否则可能难以溶于水中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 显微注射
<ol>
	<li>卵的收集
	<ol>
		<li>将12只雄性蛹和12只雌性蛹放入一个15 cm × 15 cm × 10 cm的盒子中。用纸巾覆盖盒子，并在盒内放置10%蔗糖溶液以供成虫取食。</li>
		<li>羽化后第2天，将成虫暴露于强光下过夜。</li>
		<li>羽化后第3天，将来自步骤2.1.2的成虫转移至暗处。在产卵后2小时内收集胚胎。</li>
		<li>向置于冰上培养皿中的纸巾片上的新鲜卵滴加数滴水。用细毛刷轻轻将卵转移至载玻片上，并逐个排列整齐。微注射前将排列好卵的载玻片保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微注射准备
	<ol>
		<li>使用自动显微注射仪（参见材料表），向卵内注射含有转基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达质粒（200 ng/µL）、pBac: hr5ie1-EGFP-SV40、hyPBase mRNA（200 ng/µL）以及无菌蒸馏水的混合物，同时使用补偿压力。</li>
		<li>将注射后的卵置于27 ± 1 °C、相对湿度60 ± 10%条件下培养，直至孵化。</li>
		<li>用人工饲料喂养孵化后的幼虫，并在幼虫进入早期3rd龄期（体长约6 mm，体色变黑）时，将每条幼虫转移至一个小杯中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 荧光筛选与遗传杂交
<ol>
	<li>收集蛹，将约150只雌蛹和约150只雄蛹放入一个35 cm × 35 cm × 35 cm的笼子中。在笼内悬挂数张纸巾（约30 cm × 15 cm），用于收集卵。</li>
	<li>每天收集带有卵的纸巾，并将卵置于27 ± 1 °C、60 ± 10%相对湿度条件下培养，直至孵化。</li>
	<li>将初孵幼虫在4 °C下冷藏5分钟以使其 immobilize（固定），然后转移至冰冷的培养皿上。</li>
	<li>在荧光体视显微镜下筛选固定后的初孵幼虫。挑选EGFP阳性的个体，在27 ± 1 °C条件下饲养约两周至化蛹阶段，并根据腹部腹面体节的表型差异进行性别分离。 
	注意：雌蛹在第八腹节具有狭缝状的生殖 opening（开口），第九和第十腹节的头侧边缘向生殖 opening 弯曲；雄蛹的生殖 opening 在第九腹节处有轻微隆起。</li>
	<li>将EGFP阳性的蛹与野生型相反性别的蛹按1:1的雄雌比例放入同一笼中。通过同胞交配繁殖EGFP表达的成虫，以获得后续世代。</li>
</ol>
4. 转基因插入的PCR检测
<ol>
	<li>使用任何商业化的基因组DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从野生型和EGFP阳性个体幼虫中提取基因组DNA。</li>
	<li>以基因组DNA为模板进行PCR反应，上游引物序列为5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3'，位于ie1启动子区；下游引物序列为5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3'，位于转化载体的EGFP区域。</li>
	<li>每项PCR反应体系总体积为40 µL，包含20 µL聚合酶混合液、1.0 µL基因组DNA（40 µg/µL）、各1.0 µL的10 µM上游和下游引物，以及17 µL无核酸酶水。反应程序设置如下：95 °C预变性3 min，随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性20 s、56 °C退火20 s、68 °C延伸40 s。</li>
	<li>将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳30 min进行检测。</li>
</ol>
5. 转基因插入位点的确定
<ol>
	<li>以基因组DNA为模板，进行高效TAIL-PCR，以确定EGFP阳性昆虫中外源基因插入的整合位点。
	<ol>
		<li>按照文献中所述步骤进行PCR反应9。
		<ol>
			<li>在三轮PCR反应中，分别使用三种特异性针对piggyBac载体的引物：P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3'，P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3'，以及P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3'。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对最终的PCR产物进行测序，以确定整合位点。</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transformation+with+piggyBac%3A+getting+the+number+of+injections+just+right%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

较低的转座率以及将转基因元件递送至新鲜胚胎的困难，限制了许多非模式昆虫（尤其是鳞翅目昆虫）生殖系转化的成功率。为了提高生殖系转化效率，研究人员开发出了一种最常用的piggyBac转座酶的高活性版本（hyPBase）7,10。迄今为止，鳞翅目昆虫中成功的生殖系转化主要报道于模式昆虫家蚕Bombyx mori11。然而，在其他鳞翅目昆虫（包括一些主要农业害虫）中开展转基因研究仍然具有挑战性。
使用本方案建立转基因草地贪夜蛾品系的主要局限性和关键步骤在于合成高质量的hyPBase mRNA，以及将piggyBac转座组分递送至早期胚胎中。传统piggyBac系统包含两个核心组分：一个携带待插入基因组的外源片段的供体质粒，以及一个提供转座酶的辅助质粒12。为了提高转化效率，辅助质粒中通常使用高活性启动子来驱动...

草地贪夜蛾（FAW），学名Spodoptera frugiperda，原产于美洲的热带和亚热带地区。目前，该害虫已在全球100多个国家造成严重危害1。FAW幼虫可取食超过350种寄主植物，其中包括多种重要的粮食作物2。成虫具有强大的迁飞能力，导致其近年来迅速从美洲扩散至世界其他地区1,2。因此，这种害虫现已成为国际粮食安全的重大威胁。应用新技术可能有助于推进对草地贪夜蛾的深入研究，并为防控该害虫提供新的策略。
昆虫种系转化已被用于研究基因功能，并创制转基因昆虫以应用于遗传控制3,4。在实现昆虫遗传转化的多种方法中，基于piggyBac元件的方法应用最为广泛5。然而，由于转座效率较低，在非模式昆虫中开展转基因操作仍然具有挑战性。最近，研究人员开发出一种高活性的piggyBac转座酶（hyPBase）6,7。近期已在草地贪夜蛾（FAW）中成功实现种系转化8，这是首次在鳞翅目昆虫中应用hyPBase的报道。本报告详细描述了使用hyPBase mRNA创制转基因草地贪夜蛾的方法。此处所述方法也可用于其他鳞翅目昆虫的转化。

<table><tbody><tr><td>1.5&quot; 牙科棉卷</td><td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>饲养</td></tr><tr><td>1 盎司舒芙蕾杯盖</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 盎司舒芙蕾杯</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>饲养</td></tr><tr><td>48 盎司塑料熟食容器</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>饲养</td></tr><tr><td>附加滤光片组（绿色）</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>筛选</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>注射</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>筛选</td></tr><tr><td>轻质镊子</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>饲养</td></tr><tr><td>沟槽防护网</td><td>ThermWell Products</td><td>VX620</td><td>饲养</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>注射</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>注射</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>注射</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>注射</td></tr><tr><td>NightSea 全套系统</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>筛选</td></tr><tr><td>氮气</td><td>AWG/Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>注射</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Bounty</td><td>&amp;nbsp;43217-45074</td><td>饲养</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; 人工饲料</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [申请物种/数量]</td><td>饲养</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; 卵</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [申请物种/数量]</td><td>饲养</td></tr><tr><td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td><td>聚合酶混合物</td></tr></tbody></table>

高活性 piggybac 转座酶介导的秋黏虫spodoptera frugiperda种系转化

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

利用转座元件将遗传物质稳定插入昆虫基因组，是功能基因组学研究和开发遗传害虫管理策略的有力工具。在昆虫转化中应用最广泛的转座元件是piggyBac，基于piggyBac的生殖系转化已在模式昆虫中成功实现。然而，在包括农业害虫在内的非模式昆虫中应用该技术仍具挑战性。本文报道了利用高活性piggyBac转座酶（hyPBase）对全球性农业害虫草地贪夜蛾（FAW），Spodoptera frugiperda，进行生殖系转化的研究。
在本研究中，采用 hyPBase mRNA 取代辅助质粒用于胚胎显微注射。这一改进成功实现了转基因棉铃虫（FAW）的创制。此外，本文还描述了转基因个体的筛选方法、基于 PCR 的转基因插入快速检测技术，以及基于热不对称交错 PCR（TAIL-PCR）的整合位点确定方法。因此，本文提供了一套完整的转基因棉铃虫制备方案，将有助于推动基于 piggyBac 的棉铃虫及其他鳞翅目昆虫的转基因技术发展。

含有 hyPBase 的表达载体构建：T7 启动子：多角体蛋白-5'非翻译区：hyPBase：多角体蛋白-3'非翻译区：多聚腺苷酸信号序列的构建（图1A）并扩增为约2.2 kb的PCR片段，用于合成hyPBase mRNA 体外 (图1B）。随后，制备hyPBase mRNA并进行琼脂糖凝胶电泳。在1%琼脂糖凝胶上检测到预期大小的mRNA条带（约1.1 kb条带）图1C).
随后，构建了一个基于piggyBac的EGFP表达载体（图2A）。将该质粒与hyPBase mRNA或PBS溶液混合后，在产卵后2小时内注射到胚胎中。注射后24小时，在注射胚胎中观察到EGFP表达的瞬时信号。PBS注射组胚胎未显示EGFP信号（图2B），而注射EGFP表达质粒和hy...

利用高活性piggyBac转座酶的mRNA，成功实现了对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的种系转化。

高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化

利用转座元件将遗传载荷稳定插入昆虫基因组是进行功能基因组学研究和开发遗传修饰技术的强大工具。

本方案展示了利用基于piggyBac的转化系统生产转基因草地贪夜蛾的方法。我们希望这些方法不仅有助于提高草地贪夜蛾的转化效率，也能促进其他鳞翅目昆虫的转化。本文所述方法可高效实现鳞翅目害虫的种系转化。本实验操作将由我实验室的博士后研究员Xien Chen博士演示。首先，将12只雄性蛹和12只雌性蛹放入一个盒子中。在盒内放置10%蔗糖溶液，用于成虫取食。用纸巾盖住盒子。在羽化后的第二天，让成虫整夜暴露于强光下。在羽化后的第三天，将成虫转移至黑暗环境中。在超过预定时间后的两小时内收集胚胎。将水滴加到置于冰上培养皿中新鲜卵子所在的纸巾片上。用细刷将卵子轻轻转移至载玻片，并逐一在载玻片上排列整齐。显微注射前，将带有卵的载玻片置于冰上保持对齐。使用自动显微注射仪的补偿压力，将每微升含200纳克基于piggyBac的EGFP表达质粒、每微升含200纳克高活性piggyBac转座酶mRNA以及无菌蒸馏水的混合液注射入卵中。将注射后的卵置于27±1°C、相对湿度60%±10%的条件下培养至孵化。将孵化的幼虫喂食人工饲料，并在幼虫发育至初凝乳期和星形期时，将每条幼虫转移至一个小杯中。收集蛹，并将约150只雌蛹和150只雄蛹放入饲养笼中。在笼内悬挂数张尺寸为30厘米×15厘米的纸巾，用于收集卵。每天收集带有卵的纸巾，并将卵置于适宜条件下直至孵化。将初孵幼虫在4°C下放置5分钟以使其 immobilize（固定），然后转移至冰冷的培养皿中。在荧光体视显微镜下筛选已固定的初孵幼虫。挑选EGFP阳性的新生幼虫，在27±1°C条件下饲养约两周，直至化蛹。通过1%琼脂糖凝胶检测体外合成的高活性piggyBac转座酶mRNA。PDS注射的胚胎未显示EGFP信号，而注射了EGFP表达质粒和高活性piggyBac转座酶mRNA的胚胎显示出EGFP荧光，表明piggyBac构建成功。通过G0代成虫自交获得的G1代幼虫表现出强烈的EGFP信号。利用EGFP阳性幼虫的基因组DNA作为模板，成功扩增出含有启动子和EGFP片段的DNA片段。然而，当以野生型幼虫的基因组DNA作为模板时，未检测到相同片段。用于显微注射的卵应尽可能新鲜，并且在显微注射前必须始终置于冰上，以减缓其发育进程。该技术为研究人员解答害虫功能基因组学中的科学问题，以及开发针对这一全球性害虫的遗传控制方法奠定了基础。

hyperactive-piggybac-transposase-mediated-germline-transformation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

多活性猪猪Bac转座酶介导的秋粘虫，蜉蝣属果蝇蛆中的种系转化

转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C.

通过基因枪转化法产生转基因 C. elegans

在模式生物中，转基因技术可操控基因功能，而RNA干扰（RNAi）则可降低特定mRNA转录水平1-2。本实验方案旨在介绍将稳定遗传的DNA和瞬时双链RNA导入嗜尸线虫Pristionchus...

通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

利用光片荧光显微镜对昆虫胚胎的形态发生过程进行成像已成为当前的标准技术。本实验方案概述并比较了三种适用于赤拟谷盗（Tribolium...

活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

本文介绍了收集和显微注射前细胞期西方玉米根虫胚胎的实验方案，旨在进行功能性基因组学检测，如种系转化和CRISPR/Cas9基因组编辑。...

西方玉米根虫（Diabrotica virgifera virgifera）胚胎的显微注射用于种系转化或CRISPR/Cas9基因组编辑

本文介绍了一种蟋蟀卵显微注射的实验方案，该技术是开展蟋蟀多种实验研究的基础方法，包括但不限于RNA干扰和基因组编辑。...

注射Gryllus bimaculatus卵

我们提供了一种详细的方案，用于饲养火衣鱼（Thermobia...

火虫 Thermobia domestica 中的卵显微注射与高效交配用于基因组编辑

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对棉铃虫（Helicoverpa armigera...

胚胎显微注射及CRISPR/Cas9基因组编辑棉铃虫（Helicoverpa armigera）（Hübner）敲除突变体的鉴定

针对寄生性线虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides...

通过显微注射法在 Strongyloides 属物种中生成转基因株和基因敲除株

了解利用高活性piggyBac转座酶系统在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中建立种系转化的方法。该技术通过显微注射实现高效基因递送，为鳞翅目害虫功能基因组学研究及遗传防控策略开发提供重要工具。

高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化

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