利用pH敏感型荧光脂质类似物ND6测量膜脂质周转

本方案描述了一种新型pH敏感性荧光脂质探针ND6的表征与应用，该探针特异性靶向细胞膜，可使研究人员在活细胞中实时监测胞吐和胞吞过程。以往大多数膜蛋白报告系统依赖于pH敏感型绿色荧光蛋白，属于间接检测方法。作为脂质模拟物，ND6可整合入细胞膜中，从而真实反映脂质膜的运输动态。

ND6探针仅在嵌入生物膜环境中才会产生荧光。该探针的荧光强度与其哌嗪头部基团的质子化和去质子化过程相关。因此，在较低pH条件下，其荧光更强。

胞吐作用和内吞作用是许多信号分子分泌与摄取过程中的普遍机制。因此，ND6可用于研究细胞生物学和生物医学科学中的一些基本问题。本次实验操作将由本实验室的学生Haley、Oliver和Jonathan进行演示。

首先准备一个成像室，该成像室需具备温度控制功能，并支持灌流液的输入与输出，以用于活细胞荧光成像。设置可编程设备，以便在成像过程中于预定时间点切换灌流液并施加电刺激。称取适量的ND6。

将其溶解于二甲基亚砜中，并在室温下使其充分溶解。随后短暂超声处理该溶液。使用0.22微米滤器过滤粗储备液，以去除较大的染料聚集体。

使用常规或微量分光光度计，在 405 纳米处测定染料浓度。使用浴液将储备液稀释至浓度为 1 毫克/毫升后，方可使用。储备液应于室温下避光保存。

将ND6储存液加入培养基中，使其终浓度为每微升1微克，并孵育以广泛标记内吞的膜区室（如内体）。为减少突触小泡的标记程度，需通过药理学方法抑制神经元的自发活动。按照文中的描述选择性地标记突触小泡后，将含有细胞的盖玻片安装至成像室中。

将温度传感器、灌流输入管和真空吸头连接到成像室。调节灌流速度至约 0.2 毫升每秒，开始灌注含有 NBQX 和 DAP5 的预热正常台氏液，以去除培养物中过量的 ND6。调节焦距，找到含有健康且充分伸展、具有连接神经突的神经元的合适视野。

避开含有未溶解双胶体的区域。尝试以不同的曝光时间对载有ND6的细胞进行成像，以确定最佳成像参数。根据文本稿件中的信息，设置刺激和灌注程序、帧间隔及总持续时间。

开始图像采集，同时进行同步刺激和灌注。在成像过程中监测刺激和溶液更换。成像结束后停止灌注。

移除盖玻片，并为下一次实验清洁成像室。备份所有图像文件并制作电子副本。选择并打开数据分析程序以提取数据。

在分析程序中打开或导入图像堆栈。生成二值化掩膜后，使用“分析颗粒”功能，并设置合适的面积大小和圆度，以获取对应于细胞膜、内体、溶酶体或突触小体的感兴趣区域（ROIs）。在视野内无细胞区域选择四个背景感兴趣区域。

然后保存所有选定的感兴趣区域（ROI）。对ND6延时成像序列中的所有帧进行对齐。将第一幅图像设为参考图像，并使用刚性配准方法将其余图像与之对齐，以消除由于XY方向漂移引起的伪影。

然后保存对齐的图像堆栈。将保存的感兴趣区域（ROI）应用到对齐的ND6图像堆栈上。测量图像堆栈中每一帧内每个ROI的ND6荧光平均像素强度。

然后导出结果用于统计分析。计算背景感兴趣区域（ROI）的平均强度，以获得基线噪声，并从所有选定的ROI中减去该值。在施加pH 5.5的Tyrode's溶液期间，对每个选定ROI的三个最高平均强度取平均值，以获得最大荧光强度，并将其定义为100%，用于归一化处理。

在施加50毫摩尔氯化铵期间，取每个选定ROI的三个最低平均强度的平均值，以确定最小荧光强度，并将其定义为归一化的0%。根据每个ROI自身的0%和100%强度计算其相对荧光变化。基于各个ROI的数据，推导平均荧光变化、变化动力学以及其他数值或图表。

用ND6孵育神经元细胞后，可在神经元突起上观察到明亮的绿色荧光斑点。ND6与FM464荧光强度之间存在显著相关性，也提示ND6可标记突触小泡。在电刺激和高钾刺激下，ND6的荧光强度均出现下降，表明ND6位于突触小泡膜上，且在递质释放过程中突触小泡腔内环境趋于中性。

在强电刺激下，MβCD处理显著降低了通过ND成像测量的突触小泡释放和回收，这表明膜胆固醇可促进突触小泡的胞吐和胞吞作用。Baf A1通过急性阻断回收突触小泡的再酸化过程，抑制了刺激后ND6荧光的恢复。必须具备荧光显微镜的基本知识。

为支持活细胞成像而对生理条件进行周密规划非常重要。必须精确确定纳米金刚石（ND）储备液的浓度。如有可能，每次使用前应重新测定储备液浓度。

请避免阳光直射，以防光漂白和探针分解。