人骨关节炎膝关节组织采集与RNA提取

本方案提倡使用原代人组织作为骨关节炎研究的临床相关模型。对这些组织进行基因表达和组织学分析可能提供新的机制性见解。该技术标准化了人膝关节组分的鉴定与处理方法。

该方法能够提取高质量的RNA，满足下游基因表达检测的要求。从病变的关节组织中获取高质量RNA具有挑战性，因此一些看似微不足道的步骤（例如保持所有操作环境清洁和低温）的重要性不容低估。本实验操作将由本实验室的研究助理Thomas Wilson和博士后研究员Navdeep Kaur进行示范。

首先根据大小、形状、颜色和质地的差异，从标本中识别出硬组织（包括软骨、骨和半月板）以及软组织（包括髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜和股内侧斜肌）。将每种组织切成三个部分。用无菌 PBS 冲洗组织片段，以去除任何残留物或碎屑。

进行RNA提取时，将三个组织切片分别切成约一到二毫米见方的小块。将切好的小块组织转移至2毫升冻存管中。拧紧管盖后，将冻存管浸入液氮中快速冷冻30秒，随后转移至-80摄氏度冰箱中长期保存，并对所有组织样本重复此操作。

使用研钵和研杵均质化硬组织。在均质化前，用液氮冷却研钵、研杵和刮刀，以防止样品解冻。每次仅处理一个样品。

使用预冷的刮勺将组织样本转移至研钵中。向组织上倒入液氮。待液氮挥发后，用研杵研磨组织。

研磨组织时反复加入液氮，以获得细小的组织粉末。将细小的组织粉末转移至已预先浸入液氮中冷却30秒的1.5毫升预冷微量离心管中。向每根试管中加入1毫升冰上预冷的酸性胍基苯酚溶液，并将试管置于冰上孵育20分钟。

在匀浆不同硬组织之前，先用70%乙醇彻底清洁研钵、研杵和刮勺，随后使用RNase去污染剂处理，再用DEPC处理水冲洗。将研钵、研杵和刮勺浸泡在70%乙醇中，然后用干净无绒的纸巾擦去残留液体。使用组织匀浆器匀浆软组织。

为消毒匀浆器，使用70%乙醇和RNase去污染剂分别运行管路清洗，每次清洗30秒，然后用DEPC处理水清洗，再用额外的70%乙醇清洗，每次均为30秒。用干净无绒的纸巾擦去残留液体。向预先标记的5 mL圆底管中加入1 mL酸性胍基苯酚溶液，并将组织样本转移至管中。

在整个操作过程中将离心管置于冰上，对组织进行最多五次32分之一秒的脉冲匀浆，或直至组织在视觉上完全溶解。将匀浆后的组织置于冰上孵育，直到所有组织样本处理完毕。在处理下一个组织样本前，对匀浆器进行消毒和清洁。

使用无菌镊子清除探针齿部残留的任何组织块。将所有匀浆组织置于冰上额外孵育20分钟，然后将组织样本转移至预先标记并预冷的1.5毫升微量离心管中。七份来自骨关节炎患者的独特人膝关节组织在手术切除后四小时内完成处理。

通过肉眼识别组织，并通过苏木精-伊红（H&E）组织学染色进行确认。对H&E染色的硬组织切片，包括关节软骨、软骨下骨和半月板，在6倍和40倍放大倍数下进行观察。同样，对H&E染色的软组织切片，包括髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜和股内侧斜肌，在6倍放大倍数下观察，随后在40倍放大倍数下观察。

提取RNA的质量评估结果显示，部分样本质量较高，表现为完整性、得率和纯度良好，同时也存在部分质量较低的样本，表明尽管采用了优化的提取方法，但疾病严重程度等外部因素仍可能影响同一患者不同组织中的RNA质量。准确识别每种组织类型对于在患者内部及患者间进行组织内和组织间的比较至关重要，尤其是考虑到原发性疾病组织具有显著异质性。测序技术正在快速发展，而高质量RNA的分离是利用这些技术揭示骨关节炎等复杂慢性疾病中潜在组织特异性机制的关键前提。