人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持和表征
2021年7月9日
这里描述了生成、维持和表征人类多能干细胞衍生的小肠和结肠类器官的详细方法。这些方法旨在提高可重复性、扩大可扩展性并减少类器官铺板和传代所需的工作时间。
以下方案描述了来自人类多能干细胞的一代人类肠道和结肠类器官。这种技术将允许用户询问与肠道模式形成有关的途径。该技术允许用户生成同基因的区域特异性类器官。该协议可以深入了解调节肠道模式建立和维持的因素。
[旁白]首先将细胞外基质或 ECM 包被的 24 孔板放入生物安全柜内 30 分钟，使其达到室温。将 mTeSR1 完全培养基细胞分离溶液和高级 DMEM 放入 37 摄氏度的珠浴中，让它们预热 30 分钟。通过加入 13 毫升 mTeSR1 和 13 微升 10 毫摩尔 Y-27632 Rho 相关蛋白激酶或 ROCK 抑制剂，在 50 毫升锥形管中制备铺板培养基。要从六孔板中收集细胞，请从三到四个孔中吸出培养基，并每孔用两毫升高级DMEM洗涤一次。吸出先进的DMEM，并将一毫升细胞解离溶液分配到每个孔中。将板在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中孵育 5 至 7 分钟。使用五毫升移液器上下移液四到五次来制备细胞悬液，从而解离任何细胞团块。向每个孔中加入两毫升高级DMEM。轻轻上下移液四到五次，然后转移到 15 毫升锥形管中。在室温下以300G旋转细胞三分钟。从管中吸出培养基，而不吸出细胞沉淀。并加入6毫升制备的mTeSR1加ROCK抑制剂培养基。通过上下移液三到四次轻轻重悬细胞。然后将悬浮液转移到 50 毫升管内剩余的 mTeSR1 和 ROCK 抑制剂培养基中。剧烈重悬四到五次，并使用血细胞计数器计数细胞。在接种细胞之前从 24 孔板中吸出 ECM。通过上下移液两到三次再次重悬细胞，并在每个孔中分配0.5毫升细胞悬液。顺时针轻轻摇晃板三次，逆时针三次，前后三次，左右摇晃三次，使细胞均匀分散。将板转移到 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，孵育 24 小时。24小时后，吸出用过的培养基。每孔加入0.5毫升mTeSR1，并在相同条件下再次孵育24小时。通过将每毫升 100 微克激活素 A 储备溶液和每毫升 100 微克 BMP4 稀释到锥形管中的激活素第一天培养基中，制备激活素第一天完全培养基。在 37 摄氏度的珠浴中加热培养基。从24孔板中吸出mTeSR1培养基，每孔加入0.5毫升激活素第一天培养基。将板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，孵育 24 小时。24小时后检查细胞。通过将每毫升 100 微克激活素 A 储备溶液稀释到锥形管中的激活素第二天培养基中，制备激活素第二天完全培养基，并将管置于 37 摄氏度的珠浴中。从二氧化碳培养箱中取出 24 孔分化板，并取出用过的培养基。每孔分配 0.5 毫升预热的 Activin 第 2 天培养基，并将板放回二氧化碳培养箱中 24 小时。通过将每毫升 100 微克激活素 A 储备溶液稀释到锥形管中的激活素第三天培养基中，制备激活素第三天完全培养基，并将试管置于 37 摄氏度的珠浴中。取出用过的培养基，每孔分配 0.5 毫升 Activin 第 3 天培养基。首先将最终内胚层分化为中后肠球体，在50毫升锥形管中加入25毫升含有FGF4的中后肠诱导培养基，并将其置于37摄氏度的珠浴中30分钟。为了制备完整的中后肠诱导培养基，在培养基温热后加入7.5微升CHIR99021。取出用过的培养基，每孔分配0.5毫升中后肠诱导培养基，在37摄氏度，5%二氧化碳下孵育24小时。第二天单层内细胞凝结后，用新鲜的中后肠诱导培养基替换用过的培养基，并将板放回孵育24小时。为避免在更换培养基时丢弃漂浮的球体，将旧培养基转移到 15 毫升管中并以 300 G 离心一分钟。将球体重悬于12.5毫升新鲜的中后肠诱导培养基中，将每孔0.5毫升加入同一24孔板中，并在培养箱中孵育24小时。在后肠诱导的第四天，通过将培养基收集到15毫升管中，然后以300G离心一分钟，从平板孔中收获漂浮球体。通过对 FOXA2 和 SOX17 进行免疫荧光染色来评估根治性内胚层诱导的效率。发现前HOX因子HOXD3的mRNA表达在Noggin处理的人肠道类器官或HIO中最高，在上皮生长因子或EGF处理的HIO中表达较少，在BMP处理的人结肠类器官或HCO中最低。相反，发现 HOXA13 和 HOXD13 mRNA 表达在 HIO 中较低，在 HCO 中较高。对 SATB2、CDX2 和 CDH1 进行免疫荧光染色，以确定 HCO 上皮是否正确图案化。
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概述
本文描述了生成、维护和表征源自人类多能干细胞的小肠和结肠类器官的详细方法。这些方法旨在提高类器官处理的重复性、可扩展性和效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 类器官技术
- 胃肠道研究
背景
- 人类多能干细胞可以分化成各种细胞类型。
- 类器官是模拟器官功能的3D结构。
- 改进类器官培养技术对研究至关重要。
- 重复性和可扩展性是类器官研究中的常见挑战。
研究目的
- 提供类器官生成的综合协议。
- 简化类器官维护的过程。
- 增强类器官的表征方法。
使用的方法
- 从多能干细胞生成小肠和结肠类器官。
- 维护类器官培养的技术。
- 评估类器官质量的表征方法。
- 提高可扩展性和减少处理时间的策略。
主要结果
- 成功生成具有高重复性的类器官。
- 提高了类器官培养的可扩展性。
- 减少了类器官铺板和传代所需的时间。
- 增强的表征技术导致更好的质量评估。
结论
- 所描述的方法显著改进了类器官研究。
- 这些协议可以应用于涉及胃肠道类器官的各种研究。
- 未来的研究可以从这些方法的重复性和效率中受益。
常见问题
Executive Industry Relevance
Human pluripotent stem cell-derived intestinal and colonic organoids provide a scalable, reproducible system for modeling gastrointestinal development and disease. These models enable mechanistic de-risking of therapeutic targets by recapitulating region-specific epithelial and mesenchymal interactions. The protocol supports predictive confidence in preclinical target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of BMP-dependent regional specification mechanisms in human gut development.
- Operational Value: Provides a defined, inducible system to generate SATB2-expressing colonic organoids for target hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in intestinal patterning and epithelial-mesenchymal crosstalk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates organoids containing all major human colonic epithelial cell types for physiologically relevant compound screening.
- Operational Value: Establishes a standardized, three-day BMP induction protocol for scalable production of colonic organoids.
- Assay Readiness: Enables co-development of epithelial and mesenchymal compartments, supporting complex tissue-level readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human developing colon morphology and molecular signature for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Supports continuity from pluripotent stem cells to differentiated intestinal lineages for preclinical disease modeling.
- Risk Mitigation: Reduces biological ambiguity in target selection through region-specific organoid fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reproducible source of regionally specified intestinal organoids for downstream applications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of developmental pathways like BMP in human gut patterning.
- Screening: Delivers standardized, scalable organoid cultures suitable for high-content compound evaluation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of epithelial composition, SATB2 expression, and morphogenetic outcomes.
- Translational Research: Models human colonic development to bridge discovery and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Defines a modular differentiation protocol adaptable across gastrointestinal target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in modeling human intestinal regional specification and target engagement.
- Operational Value: Standardized, three-day BMP induction enables scalable, reproducible organoid generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic uncertainty in gastrointestinal target biology.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant organoid systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and directed differentiation.
- Dependent on precise timing of BMP pathway modulation during mid/hindgut patterning.
- Necessitates standardized reagents including BMP4 and NOGGIN for intestinal vs. colonic fate specification.
- Requires validation of SATB2 expression and epithelial-mesenchymal co-development as quality metrics.
- Adaptation to other gastrointestinal regions may require modulation of additional developmental pathways.
